一種新型、廣譜的治療性腫瘤疫苗的制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型、廣譜的治療性腫瘤疫苗的制備和使用方法，本發(fā)明所述治療性腫瘤疫苗，由一種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)后制備得到；或者脫離DC細(xì)胞，單獨(dú)的經(jīng)過照射滅活的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系疫苗；其中，所述轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系是用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染得到的，具有在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子和/或在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ESO-1分子的能力；所述在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子的能力通過病毒或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得；所述在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ESO-1分子的能力通過病毒或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得。
【專利說明】一種新型、廣譜的治療性腫瘤疫苗的制備和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種生物疫苗及其制備方法，特別是涉及一種治療性腫瘤疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]腫瘤疫苗一直是近些年研究的熱點(diǎn)之一，其原理是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，激活患者自身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的目的。在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，最早接觸腫瘤抗原的是抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells, APC),再由APC將腫瘤抗原處理后遞呈給T細(xì)胞、B細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，
[0003]樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞,它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。
[0004]人體內(nèi)大部分DC處于非成熟狀態(tài)，激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較低，但未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力，在攝取抗原(包括體外加工)或受到某些因素刺激時(shí)即分化為成熟DC，而成熟的DC表達(dá)高水平的共刺激因子和粘附因子。DC在成熟的過程中，由接觸抗原的外周組織遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答。DC作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APC，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)生成。 近年來研究表明，應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原或抗原多肽體外沖擊致敏DC,回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
[0005]DC抗腫瘤的機(jī)制如下:①DC可以高表達(dá)MHC-1類和MHC-1I類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)MHC-1類限制性CTL反應(yīng)和MHC-1I類限制性的⑶4+Thl反應(yīng)。同時(shí)，DC還通過其高表達(dá)的共刺激分子(⑶80/B7-1、⑶86/B7-2、⑶40等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào)，啟動(dòng)了免疫應(yīng)答。②DC與T細(xì)胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18激活T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞毒作用?、跠C分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)專一趨化初始型T細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞聚集，增強(qiáng)了 T細(xì)胞的激發(fā)。保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位長(zhǎng)期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL-12、IFN-y)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進(jìn)一步以正反饋旁分泌的方式活化DC，上調(diào)IL-12及⑶80、⑶86的表達(dá)；同時(shí)DC也直接向⑶8+T細(xì)胞呈遞抗原肽，在活化的⑶4+T細(xì)胞輔助下使⑶8+T細(xì)胞活化，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞還可以進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子或直接殺傷，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。
[0006]該發(fā)明基于以上前提，沿用以下思路而產(chǎn)生:
[0007](I)研究以樹突狀DC細(xì)胞為靶向的治療性癌癥疫苗的必要性。DC細(xì)胞是最強(qiáng)有力的抗原呈遞細(xì)胞，它們可以激活天然T細(xì)胞去識(shí)別內(nèi)源性的腫瘤細(xì)胞。DC細(xì)胞在產(chǎn)生和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)的過程中起了十分重要的作用。因此，DC細(xì)胞被評(píng)價(jià)為腫瘤疫苗發(fā)展的基石?？骨傲邢倌[瘤疫苗Provenge，是第一例美國(guó)FDA通過的治療性腫瘤疫苗，是最前沿的DC細(xì)胞疫苗之一。它是用自體DC細(xì)胞加人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)在體外培養(yǎng)而制成的。
[0008]然而，像Provenge —樣，大多數(shù)DC細(xì)胞疫苗的制作過程需要首先對(duì)病人特有的粒細(xì)胞進(jìn)行分離、然后用細(xì)胞因子刺激、同腫瘤相關(guān)抗原一起培育，最終在許多嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施下生長(zhǎng)成熟。這些漫長(zhǎng)的過程大大增加了 DC細(xì)胞疫苗的造價(jià)。所以每個(gè)前列腺癌患者注射三次Provenge總共會(huì)花費(fèi)九萬四千美元?？梢詥为?dú)使用的針對(duì)DC細(xì)胞表面受體的治療性疫苗，可以繞過體外培育DC細(xì)胞這個(gè)過程，而直接運(yùn)用體內(nèi)生長(zhǎng)的DC細(xì)胞，那么這將大大減低治療的費(fèi)用而彌補(bǔ)目前DC細(xì)胞疫苗的不足。
[0009](2)用重要的DC細(xì)胞表面受體使疫苗產(chǎn)生靶向作用。DC細(xì)胞表面受體對(duì)DC細(xì)胞產(chǎn)生固有免疫和獲得性免疫起著重要作用。根據(jù)抗原的大小，未成熟DC細(xì)胞運(yùn)用巨胞飲作用(macropinocytosis)、胞吞作用(endocytosis)、吞卩遼作用(phagocytosis)以及調(diào)理作用(opsonization)來攝吸外源性抗原。受體介導(dǎo)的吞噬作用比常規(guī)的巨胞飲作用更特異和有效。因此，運(yùn)用DC細(xì)胞表面受體的靶向疫苗可以更有效的攝吸和處理抗原。重要的DC表面受體如下所述。
[0010](3)通過配基與DC細(xì)胞表面受體的相互作用來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。包括細(xì)胞內(nèi)受體和成熟受體在內(nèi)的多種受體都常參與抗原靶向識(shí)別。參與DC細(xì)胞吞噬作用的主要受體是補(bǔ)體受體、Fe受體、凝集素和整合素家族受體；然而使DC細(xì)胞成熟的主要受體是在DC細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和上皮細(xì)胞上的toll樣受體(TLR)。TLR是固有免疫系統(tǒng)的主要成份，因?yàn)樗鼈兛梢詸z測(cè)細(xì)菌感染，還可以激活DC細(xì)胞成熟來誘導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)。目前在人和小鼠體內(nèi)至少已經(jīng)有11種TLR被發(fā)現(xiàn)，他們可以識(shí)別一組有限的但是高度保守的分子結(jié)構(gòu)，因此叫做病原體相關(guān)的分子模式。例如TLR4可以識(shí)別革蘭陰性菌上特有的脂多糖，TLR2可以識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌上特有的肽聚糖，TLR3可以識(shí)別病毒感染時(shí)產(chǎn)生的雙鏈RNA，TLR9可以識(shí)別原核細(xì)胞和病毒上非甲基化的Cp⑶NA序列。通過TLR激活DC細(xì)胞可以誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟并向淋巴結(jié)遷移。通過這些參與刺激的受體，DC細(xì)胞產(chǎn)生極化并分泌細(xì)胞因子和趨化因子，例如促炎癥反應(yīng)的TNF-a、IL-U IL_6、IL-12等等。
[0011]在多達(dá)15年研究睪丸癌抗原NY-ES0-1高免疫原性的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)NY-ES0-1與DC細(xì)胞表面的補(bǔ)體Clq受體和TLR4相連，并作為自己的佐劑，成為樹突狀細(xì)胞靶向定位的配基之一。腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為可以釋放“危險(xiǎn)信號(hào)”，例如熱休克蛋白和尿酸。作為睪丸腫瘤抗原NY-ES0-1的發(fā)現(xiàn)者，我們團(tuán)隊(duì)一直在研究為什么NY-ES0-1可以在癌癥病人中誘導(dǎo)毒性T細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞，以及抗體反應(yīng)。這種被來源于腫瘤的NY-ES0-1抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫并不是由于NY-ES0-1的高水平表達(dá)。事實(shí)上，與其它腫瘤相關(guān)抗原相t匕，NY-ES0-1抗原在腫瘤組織中反而處于低水平的表達(dá)。
[0012]我們因此假設(shè)NY-ES0-1的內(nèi)因子引起了它在體內(nèi)超強(qiáng)的免疫原性。這種假設(shè)被我們現(xiàn)在的研究所支持，那就是NY-ES0-1通過DC細(xì)胞表面的Clq受體(與鈣網(wǎng)織蛋白CRT作用相同)直接與人和小鼠的未成熟DC細(xì)胞相連。在腫瘤細(xì)胞，CRT暴露在表面的作用是發(fā)出“相連的信號(hào)”，把免疫原性傳遞給沒有免疫原性的凋亡細(xì)胞。在我們的報(bào)告中，多聚物NY-ES0-1/CRT的相互作用與快速的吞噬作用聯(lián)系在一起，并被人DC細(xì)胞交叉呈遞。最新的資料顯示TLR4和鈣網(wǎng)織蛋白CRT —道作為NY-ES0-1在DC細(xì)胞表面的一個(gè)共受體。快速的吞噬作用與強(qiáng)有力的TLR信號(hào)大概可以解釋為什么在免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境中NY-ESO-1作為細(xì)胞內(nèi)蛋白而具有強(qiáng)大的免疫原性。
[0013]我們?cè)诖嘶A(chǔ)上同時(shí)借鑒GVAX思路和其失敗原因，本發(fā)明所使用的同時(shí)表達(dá)GM - CSF和表面NY -ES0-1分子的疫苗一方面可以通過GM — CSF來吸引和誘導(dǎo)骨髓系細(xì)胞比如單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為未成熟DC ;另一方面可以通過NY -ES0-1這一 TLR4的自然受體直接作用于誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟和進(jìn)一步刺激T/B細(xì)胞，達(dá)到疫苗激活作用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0014]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題系提供了一種新的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系，其細(xì)胞表達(dá)GM-CSF和/或細(xì)胞表面的NY-ES0-1分子?？梢园邢蚣せ钗闯墒霥C細(xì)胞使其變?yōu)槌墒霥C細(xì)胞。
[0015]此外，還提供一種新型、廣譜的治療性腫瘤疫苗及其制備方法，該治療性腫瘤疫苗能安全、有效的特異性治療多種腫瘤。
[0016]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0017]一種治療性腫瘤疫苗，由一種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)后制備得到?；蛘呙撾xDC細(xì)胞，單獨(dú)的經(jīng)過照射滅活的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系疫苗。
[0018]其中，所述轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系是用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染得到的，具有在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子和/或在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1分子的能力。
[0019]本發(fā)明所述 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子的能力通過病毒(慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，AV),或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得。
[0020]本發(fā)明所述在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1分子的能力通過病毒(慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，AV),或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得。
[0021]所述逆轉(zhuǎn)錄病毒來源于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)如圖1A，構(gòu)建方法可參照文獻(xiàn):L.Xu, J.Zheng, D.H.Nguyen, Q.T.Luong, Ζ.Lin, G.Zeng “Enhancing whole tumor-cellvaccination by engaging innate immune system through NY-ESO-l/dendriticcell interactions.” J.1mmunother.(2013) in press。如以下方法:通過 Bgl I 和Sal I兩種限制性內(nèi)切酶的作用，將完整的NY-ESO-lcDNA克隆到pDisplay載體中。以pDispIay-NY-ESO-1 質(zhì)粒作為基因克隆模板，上游引物(5’ ACACTCGAGCAATTGATGGAGACAGACACACTCCTGCT-3’)，下游引物(5，-ACGCGGCCGCGGATCCAGCGGCCGCCTAACGTGGCT-3’ )。PCR原料包含 T7, CMV, signal peptide, HA tag, NY-ESO-1, myc tag 以及經(jīng)過 Xho I 和 BamI限定將血小板衍生生長(zhǎng)因子跨膜區(qū)亞克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將這個(gè)重組質(zhì)粒命名為pRV-DispIay-NY-ESO-1。
[0022]所述腫瘤細(xì)胞是從患者身上獲得的活的腫瘤細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明，包括任何一種經(jīng)過培養(yǎng)可以生長(zhǎng)繁殖并被可以被逆轉(zhuǎn)錄病毒所轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞或者多種同類異源腫瘤細(xì)胞系的混合，如:肺癌，胃癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌，鼻咽癌，頭頸癌的細(xì)胞；
[0023]所述轉(zhuǎn)染是將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒和Phoenix細(xì)胞混合，其中加入DNA轉(zhuǎn)染試劑得到含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的Phoenix細(xì)胞上清液；然后再用該細(xì)胞上清液和腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞；[0024]轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增，然后利用表面表達(dá)的NY -ES0-1分子進(jìn)行流式細(xì)胞儀介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞純化，對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行GM — CSF轉(zhuǎn)染，得到可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞系，即本發(fā)明所述具有在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子和/或在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1分子的能力的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系；
[0025]所述制備是將所得可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行滅活，得到滅活的可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞，這一細(xì)胞系或者多株滅活的混合細(xì)胞系可以單獨(dú)作為腫瘤疫苗使用；將該滅活的可表達(dá)GM — CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)，得到細(xì)胞混合物，再經(jīng)提取分離即得本發(fā)明所述的疫苗。
[0026]本發(fā)明所述的疫苗，具體可以通過以下方法制備:
[0027]I)使用Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒:首先，在六孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2ug編碼人類GM-CSF或表面NY-ES0-1分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l_2xl06Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineLTX and PLUSReagents0轉(zhuǎn)染48小時(shí)以后，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作。
[0028]2)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞可以是來源于病人自身的體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系或者是2 — 3株異體但是同類的腫瘤細(xì)胞系，比如小細(xì)胞肺癌，透明細(xì)胞腎癌等等。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中會(huì)經(jīng)歷一個(gè)快速增長(zhǎng)的過程。具體方法如下:在一 個(gè)六孔板中，IxlO6腫瘤細(xì)胞將被放在0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL濃度為4ug/mL的聚凝胺中懸浮培養(yǎng)。最后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗癌基因抗體來證實(shí)轉(zhuǎn)染是否成功。
[0029]3)純化擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞:經(jīng)過以上基因工程轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠通過流式細(xì)胞儀對(duì)抗癌基因抗體熒光染色的活細(xì)胞進(jìn)一步分選，達(dá)到大于90 %的純度。之后，對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，整個(gè)培養(yǎng)過程將嚴(yán)格操作，以保證表達(dá)表面NY-ES0-1分子的腫瘤細(xì)胞純度大于90%。
[0030]4)多次GM — CSF轉(zhuǎn)染:在以上初步純化的腫瘤細(xì)胞到達(dá)5xl06以后，需要進(jìn)行多次GM — CSF病毒轉(zhuǎn)染，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清液，保證二十四小時(shí)內(nèi)每百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞分泌GM — CSF 到達(dá) 500pg/ml。
[0031]5)滅活制備腫瘤疫苗:經(jīng)過支原體，細(xì)菌等等陰性檢測(cè)后的細(xì)胞系需要做成單細(xì)胞懸液并經(jīng)過300Gy的輻照儀照射，得到滅活細(xì)胞。
[0032]6)上述滅活細(xì)胞和DC細(xì)胞用培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，得到混合細(xì)胞懸液。
[0033]7)對(duì)混合細(xì)胞懸液進(jìn)行純化，分離，配制，制備成疫苗制劑。
[0034]本發(fā)明的疫苗經(jīng)過以下實(shí)驗(yàn)證明具有優(yōu)良的技術(shù)效果:
[0035]在腎癌動(dòng)物模型上的效果實(shí)驗(yàn):
[0036]材料和方法
[0037]實(shí)驗(yàn)小鼠
[0038]所有老鼠依照動(dòng)物加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校研究委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)原則辦理手續(xù)。6-8 周雌性 BALB/c 小鼠購(gòu)買于 Charles River Laboratories (San Diego, CA).TLR4缺陷小鼠(BALB/c 小鼠，年齡在 6-8 周)來自于 Jackson Laboratory (Sacramento, CA).為便于皮下注射，用異氟醚對(duì)小鼠進(jìn)行短時(shí)間麻醉。將IXlO6腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)膠(BDBiosciences, San Diego, CA)按照2:1的比例注入小鼠。每隔一天計(jì)算小鼠腫瘤體積，計(jì)算公式如下:體積=(LXW2)/2，L是最大長(zhǎng)度；W是最大寬度。
[0039]質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
[0040]通過Bgl I和Sal I兩種限制性內(nèi)切酶的作用，將完整的NY-ESO-lcDNA克隆到pDisplay載體中。以pDisplay-NY-ESO-l質(zhì)粒作為基因克隆模板，上游引物(5’ACACTCGAGCMTTGATGGAGACAGACACACTCCTGCT-3’)，下游引物(5’_ACGCGGCCGCGGATCCAGCGGCCGCCTAACGTGGCT-3’)。PCR原料包含 T7, CMV, signal peptide, HA tag, NY-ESO-1, myc tag 以及經(jīng)過XhoI和Bam I限定將血小板衍生生長(zhǎng)因子跨膜區(qū)亞克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將這個(gè)重組質(zhì)粒命名為pRV-Di sp Iay-NY-ESO-1。作為對(duì)照，我們用同樣的方法構(gòu)建一出pRV-Display-GFP。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)通過DNA測(cè)序的方法驗(yàn)證。
[0041]細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0042]小鼠腎癌細(xì)胞系，Renca(BALB/c同源)，細(xì)胞系購(gòu)買于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(Manassas, VA)，細(xì)胞系經(jīng)含10% FBS以及青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)。如之前所述，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，Renca細(xì)胞系能夠在細(xì)胞膜上表達(dá)與膜相連接的NY-ES0-1或GFP，這兩種細(xì)胞系分別命名為Renca-ESO和Renca-GFP。Renca-ESO和Renca-GFP細(xì)胞系通過流式細(xì)胞分選儀富集，獲得的細(xì)胞系純度大于90%。在一些實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到Renca_CA9細(xì)胞系，這是一種能夠表達(dá)carbonic anhydrase9 (CA9)抗原的Renca細(xì)胞系。所有細(xì)胞系將通過支原體檢測(cè)試劑盒(Mycoplasma Detection Kit, MolecularProbes, Eugene, OR)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為無支原體污染。
[0043]試劑和抗體 [0044]結(jié)合有H-2Dd 的多肽 CA9172-180(AFCPALRPL)，CA9258-266(AFARVDEAL)和CA9323-331 (RYFQYEGSL)通過 GenScript (Piscataway, NJ)公司人工合成。LPS 和CpG(分別為TLR4和TLR9的激動(dòng)劑)購(gòu)買于InvivoGen(San Diego, CA)。鼠單克隆抗體，CD4, CDllb, CDllc, CD80, CD86, and 1-A/1-E 購(gòu)買于 BioLegend (San Diego, CA)。鼠單克隆抗體 CD8 和 FoxP3 購(gòu)買于 BD Pharmingen (San Diego, CA)。
[0045]在機(jī)體內(nèi)和機(jī)體外的DC活化試驗(yàn)
[0046]腫瘤細(xì)胞(I X IO6重懸于50 μ L PBS)注射到小鼠的后腳底板。在注入腫瘤細(xì)胞后三天，取出小鼠引流淋巴結(jié)和對(duì)側(cè)淋巴結(jié)。用注射器對(duì)淋巴結(jié)進(jìn)行機(jī)械解離后，將細(xì)胞通過70 μ m細(xì)胞篩網(wǎng)過濾。將細(xì)胞懸液離心后，對(duì)其進(jìn)行流式抗體染色，進(jìn)行流式分析。對(duì)于機(jī)體外的分析，我們先通過沖洗小鼠股骨和脛骨獲得小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解后，將細(xì)胞培養(yǎng)于含有 10% FBS, 20ng/mL 重組鼠 GM_CSF(R&D systems, Minneapolis, MN)，50 μ M2-巰基乙醇(Invitrogen, Carlsbad, CA)的RPMI1640中，培養(yǎng)六天。細(xì)胞每隔一天進(jìn)行一次換液。第六天，收集髓系DC細(xì)胞，將其放入6孔板中與腫瘤細(xì)胞(每孔放入5X IO5DC細(xì)胞和5 X IO5腫瘤細(xì)胞)共培養(yǎng)24小時(shí)。之后，收集共培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液離心后，對(duì)其進(jìn)行流式抗體染色，進(jìn)行流式分析。
[0047]T cell功能試驗(yàn)
[0048]對(duì)于體外細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，我們用CytoTox96Non-radioactiveCytotoxicity assay (Promega, Madison, WI)進(jìn)行檢測(cè)，這種方法是基于乳酸脫氫酶(LDH)的色度比色檢測(cè)。Renca細(xì)胞或同源NIH3T3細(xì)胞系(靶細(xì)胞)接種于96孔板，每孔IXlO4個(gè)細(xì)胞。脾細(xì)胞來自已獲得免疫的小鼠(效應(yīng)細(xì)胞)，通過計(jì)數(shù)后按照不同的效靶比加入靶細(xì)胞中，所有試驗(yàn)進(jìn)行三次。經(jīng)過37°c培養(yǎng)4小時(shí)后，吸取50 μ L上清分析LDH活性，并按照試劑盒推薦方法換算細(xì)胞毒性百分比?？乖禺愋訡TL細(xì)胞應(yīng)答在體內(nèi)的檢測(cè)，是通過CFSE對(duì)捐獻(xiàn)脾細(xì)胞的小鼠進(jìn)行活體細(xì)胞染色檢測(cè)。未成熟的同源脾細(xì)胞系懸液作為靶細(xì)胞，向其中加入lOyg/mL多肽在37°C培養(yǎng)一小時(shí)，之后用5μΜCFSE(CFSEhigh cells)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。未加多肽刺激的脾細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同樣用5μΜ CFSE (CFSElowcells)對(duì)其進(jìn)行染色標(biāo)記。取相同數(shù)量的兩種細(xì)胞混勻，取5X IO6的細(xì)胞靜脈注射給免疫小鼠(immunized mice)。第二天,殺死小鼠用流式方法對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行CFSE強(qiáng)度的分析。The peptide-specific lysis通過以下公式計(jì)算:lysis% =[1- (Rnaive/Rimmunized) ] X 100, R 代表 CFSE1w/CFSEhigh 比例。為檢測(cè) IFN 的分泌，從免疫小鼠脾臟分離出脾細(xì)胞(2 X IO6)，與經(jīng)35gray強(qiáng)度照射的Renca細(xì)胞或NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)。然后按照試劑盒使用說明用ELISA kit (BioLegend, San Diego, CA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清。
[0049]增加腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)
[0050]通過用注射器對(duì)腫瘤進(jìn)行機(jī)械剪碎后，將腫瘤放入含有111^/1^膠原酶0 0?0(31^Applied Science, Indianapolis, IN)和 200U/mL DNase I (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)的PBS中，37°C培養(yǎng)30分鐘，之后通過多次吹打和70 μ m細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，使腫瘤成為單細(xì)胞懸液。通過Ficoll分離液分離,收集中間層細(xì)胞進(jìn)行下一步分析。
[0051]腫瘤肺轉(zhuǎn)移治療實(shí)驗(yàn)
[0052]通過尾靜脈將IOOyL PBS(約2X IO5個(gè)腫瘤細(xì)胞)注入小鼠體內(nèi)建立小鼠肺轉(zhuǎn)移模型。小鼠在接種腫瘤25-28天后被殺死。為區(qū)分正常組織和腫瘤組織，通過氣管向小鼠肺部加入墨汁(15%墨汁，85%水，3滴NH40H/100mL)。摘取小鼠的肺，在Fekete’ s溶液(100mL70%乙醇，10mL37%福爾馬林，and5mL冰醋酸)中保存。數(shù)出白色腫瘤小組織個(gè)數(shù)。
[0053]統(tǒng)計(jì)分析
[0054]數(shù)據(jù)以均值土 SD形式呈現(xiàn)，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法或單因素方差分析法分析，并且遵從邦博朗尼事后多重校正法(Bonferroni posttest mult ip lecompari sons)。Ρ〈0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
[0055]結(jié)果
[0056]細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠降低小鼠機(jī)體內(nèi)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)
[0057]在人工培養(yǎng)的細(xì)胞系和臨床腫瘤樣本中，NY-ES0-1被證實(shí)是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，在細(xì)胞死亡以后，能夠通過結(jié)合細(xì)胞表面CRT和TLR4啟動(dòng)固有免疫系統(tǒng)。為了研究NY-ES0-1在細(xì)胞外對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫的影響，我們讓NY-ES0-1表達(dá)于Renca細(xì)胞(鼠科腎癌細(xì)胞系)表面。異常的超量表達(dá)NY-ES0-1也許能夠增強(qiáng)細(xì)胞固有免疫和可測(cè)量的免疫學(xué)結(jié)果之間的相互關(guān)系。我們通過融合血小板源生生長(zhǎng)因子受體跨膜區(qū)(Fig.1Α)結(jié)構(gòu)構(gòu)建一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1。經(jīng)過這種逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Renca細(xì)胞被分選出來,并命名為Renca-ESO。最后,通過抗體對(duì)HA tag染色,用共聚焦顯微鏡(Fig.1B)和流式細(xì)胞儀(Fig.1C)對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1進(jìn)行確認(rèn)。以上述相同方法，構(gòu)建一株細(xì)胞表面表達(dá)GFP的Renca細(xì)胞系(Renca-GFP)作為對(duì)照。[0058]為確定基因修飾是否對(duì)Renca細(xì)胞系生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，我們進(jìn)行細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)(Fig.1D)。通過觀察原代Renca細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后Renca細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞增殖無明顯差異。為評(píng)估直接接入NY-ES0-1對(duì)固有免疫的影響，5組WT BALB/c小鼠通過皮下接種IX IO6Renca-ESO細(xì)胞，監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)情況(Fig.1D)。按相同方法，將Renca細(xì)胞和Renca-GFP細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，作為對(duì)照。Renca-ESO腫瘤顯示出的生長(zhǎng)速度明顯慢于其他對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)速度。這個(gè)腫瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)區(qū)別可以認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的NY-ES0-1與固有免疫相互作用的結(jié)果。
[0059]細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠使機(jī)體內(nèi)和離體培養(yǎng)的DC細(xì)胞活性增強(qiáng)
[0060]DC細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答開始、進(jìn)行，以及調(diào)控起著關(guān)鍵性作用。但同時(shí)，DC細(xì)胞的角色并不單一，當(dāng)成熟的/激活的DC細(xì)胞開始進(jìn)行免疫反應(yīng)時(shí)，未成熟的DC細(xì)胞是趨向于免疫耐受的。在機(jī)體內(nèi)，成熟的DC細(xì)胞會(huì)迅速的從外周組織遷移到引流淋巴結(jié)。同時(shí)，它還參與一些其他的免疫協(xié)調(diào)工作，包括抗原遞呈過程中的一些復(fù)雜的分子表達(dá)上調(diào)和T細(xì)胞共刺激。因此，我們需要知道細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1是否有助于腫瘤細(xì)胞激活DC細(xì)胞。分別將大約I X 106Renca細(xì)胞、Renca-GFP細(xì)胞和Renca-ESO細(xì)胞通過后腳底板注射到不同WT BALB/c小鼠體內(nèi)。三天后，切下小鼠引流淋巴結(jié)并對(duì)小鼠DC細(xì)胞表型進(jìn)行流式分析。我們的結(jié)果顯示注入Renca-ESO腫瘤細(xì)胞的小鼠引流淋巴結(jié)(the draining lymphnode)內(nèi)激活的DC細(xì)胞比例高于另外兩組(Fig.2A)。我們之前的數(shù)據(jù)表明NY-ES0-1能夠結(jié)合DC細(xì)胞表面的TLR4，我們?cè)噲D確認(rèn)上面的觀點(diǎn)，因此我們建立了一個(gè)腫瘤細(xì)胞與WT或TLR4缺陷的(TLR4 - / -)BALB/c小鼠的髓系DC細(xì)胞(BMDC)離體共培養(yǎng)體系。將未成熟的BMDC與細(xì)胞表面不表達(dá)NY-ES0-1的Renca細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。Renca-ESO細(xì)胞，能夠向陽(yáng)性對(duì)照LPS和CpG —樣，通過刺激上調(diào)DC細(xì)胞表面⑶80、⑶86、MHC II有效的證明DC細(xì)胞被活化(Fig.2B)，而對(duì)照組并沒有顯示出相應(yīng)的結(jié)果。與此同時(shí)，在TLR4-/-小鼠組，Renca-ESO細(xì) 胞沒有激活DC細(xì)胞，這正好符合我們上述觀點(diǎn):在NY-ES0-1激活DC細(xì)胞過程中，TLR4起到關(guān)鍵性的作用(Fig.2B)。
[0061]細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠增強(qiáng)腫瘤特異性⑶8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答
[0062]為了確定被活化的DC細(xì)胞是否有助于增強(qiáng)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，我們進(jìn)行INF-分泌量和CTL活性試驗(yàn)。為進(jìn)行上述試驗(yàn)，我們從免疫幼鼠身上獲得脾細(xì)胞，將其與Renca細(xì)胞或同源的NIH3T3細(xì)胞(陰性對(duì)照)作為靶細(xì)胞共培養(yǎng)。來自幼鼠或免疫小鼠的脾細(xì)胞與輻射后的Renca細(xì)胞或Renca-GFP細(xì)胞產(chǎn)生少量或低水平的IFN-。相比之下，脾細(xì)胞與輻射后的Renca-ESO細(xì)胞釋放了更高水平的IFN-(Fig.3B)。⑶8+T細(xì)胞活性檢測(cè)，通過LDH釋放試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估,與對(duì)照組進(jìn)行比較，相對(duì)Renca細(xì)胞,Renca-ESO細(xì)胞顯示了非常高的細(xì)胞毒性(Fig.3C)。
[0063]接下來，我們進(jìn)行體內(nèi)CTL試驗(yàn)檢測(cè)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。Renca-CA9細(xì)胞系，能夠表達(dá)CA9抗體的Renca細(xì)胞系，曾被用作細(xì)胞疫苗。與對(duì)照組相比，Renca-CA9-ES0免疫小鼠顯示出更強(qiáng)的靶細(xì)胞殺傷毒性(Fig3)，如數(shù)據(jù)中顯示，通過CA9多肽得沖擊，CFSEhigh脾細(xì)胞死亡率升高。這個(gè)結(jié)果與之前體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，它們共同表明，對(duì)于輻射后的腫瘤細(xì)胞，表面表達(dá)NY-ES0-1能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞之間的免疫應(yīng)答作用。
[0064]細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠增強(qiáng)腫瘤疫苗效果并且增加TIL[0065]為評(píng)價(jià)細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1細(xì)胞疫苗的潛在效果，我們對(duì)WT BALB/c小鼠每隔兩天注射一次腫瘤疫苗,共注射三次(Fig.4A)，第一次注射疫苗在小鼠接種腫瘤細(xì)胞6天后進(jìn)行。與為注射腫瘤疫苗組相比，接受腫瘤疫苗的所以實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度都得到了明顯的減緩(Fig.4B)。在接受腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)組中，Renca-ESO實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于Renca實(shí)驗(yàn)組和Renca-GFP實(shí)驗(yàn)組，腫瘤生長(zhǎng)速度也明顯的慢于后兩者(Fig.4B)。
[0066]為確定在免疫小鼠體內(nèi)使腫瘤生長(zhǎng)減慢的T細(xì)胞亞型，在小鼠生長(zhǎng)到30天時(shí)，分離小鼠腫瘤，進(jìn)行機(jī)械剪碎，并對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行侵潤(rùn)T細(xì)胞流式分析。相對(duì)于未處理小鼠，所有接受疫苗的小鼠顯示出高比例的侵潤(rùn)C(jī)D4+和CD8+T細(xì)胞(Fig.4C)。在接受腫瘤疫苗的小鼠中，它們的⑶4+T細(xì)胞比例無明顯區(qū)別，⑶8+T細(xì)胞有較大差別。Renca-ESO疫苗中CD8+T細(xì)胞比例明顯高于其他疫苗(Fig.4C)。在分析相同大小腫瘤中的T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，在這些實(shí)驗(yàn)組中，每毫克腫瘤含CD4+T細(xì)胞數(shù)量為600個(gè)。相比之下，每毫克腫瘤含⑶8+T細(xì)胞數(shù)量，Renca-ESO組數(shù)量分別是Renca組和Renca-GFP組的2倍和1.5倍。因此，Renca-ESO疫苗抗腫瘤效果與侵潤(rùn)⑶8+T細(xì)胞數(shù)量升高相關(guān)。
[0067]Renca-ESO疫苗能夠通過減少M(fèi)DSC和Treg增強(qiáng)抗腫瘤效果
[0068]癌癥疫苗治療的最佳效果，需要將抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生、腫瘤發(fā)展過程中的免疫逃逸和免疫耐受機(jī)制相互聯(lián)系。在遭受腫瘤的動(dòng)物或者癌癥患者體內(nèi)，大量的髓系抑制細(xì)胞(MDSC)和抑制性T細(xì)胞(Treg)堆積在骨髓、血液、脾臟和腫瘤位置。另外，⑶4+⑶25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在腫瘤發(fā)生部位也能夠產(chǎn)生免疫抑制的效果。因此，評(píng)估細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1是否對(duì)免疫抑制的發(fā)生有一定緩解作用。在經(jīng)過之前的治療方法治療30天后，收集鼠源的脾細(xì)胞，用CDllb和Grl染色MDSC (Fig.5A and5B)，CD4和
5C and5D)。沒有腫瘤的小鼠CDllb+Grl+MDSC百分比很低(1.8% )，接種腫瘤細(xì)胞但未接受疫苗的小鼠MDSC百分比明顯升高(9.2% )。接受Renca疫苗(5.5% )和Renca-GFP (5.1%)腫瘤疫苗治療的小鼠MDSC細(xì)胞百分比低于未接受腫瘤疫苗治療的小鼠，接受Renca-ESO腫瘤疫苗治療的小鼠顯示出更低的MDSC百分比(3.6% )。類似的，Treg在沒有腫瘤的小鼠體內(nèi)百分比很低(1.8% )，但是在接種腫瘤但為接受腫瘤疫苗治療的小鼠體內(nèi)該百分比明顯升高(9.6%)。不管怎樣，接受Renca-ESO疫苗的小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞百分比低于接受Renca疫苗和Renca-GFP疫苗的小鼠(分別為4.l%vs.5.8% and5.4%)0
[0069]經(jīng)輻射的Renca-EOS疫苗療法能夠降低肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移
[0070]為評(píng)估這種改進(jìn)的腫瘤細(xì)胞疫苗在抗腫瘤轉(zhuǎn)移的效果，我們首先建立一個(gè)被大家公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型。Renca細(xì)胞(2X IO5)經(jīng)過靜脈輸入BALB/c小鼠(Fig.6A)。六天后，這些小鼠開始接受經(jīng)過輻射的腫瘤細(xì)胞疫苗的治療，間隔2天進(jìn)行下一次治療，共進(jìn)行3次治療。在25-28天，摘取小鼠的肺，用墨汁(Fig.6B)和H&E(Fig.6C)染色；數(shù)出肺部白色小瘤數(shù)量(Fig.6D)。未接受腫瘤細(xì)胞疫苗治療的小鼠肺部有大量的白色小瘤,接受Renca疫苗和Renca-GFP疫苗治療的小鼠肺部白色小瘤數(shù)量明顯減少，接受Renca-ESO疫苗治療的小鼠肺部?jī)H有少數(shù)白色小瘤。組織病理學(xué)分析確認(rèn)，Renca-ESO疫苗降低肺部腫瘤轉(zhuǎn)移的效果明顯高于Renca疫苗和Renca-GFP疫苗。以上結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞疫苗降低腫瘤肺轉(zhuǎn)移的效果。
[0071]本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)為:
[0072]I)靶向性:“樹突狀細(xì)胞靶向的癌癥免疫治療技術(shù)“是一種針對(duì)樹突狀細(xì)胞的靶向型的腫瘤疫苗治療新方法，體外體內(nèi)針對(duì)性強(qiáng)，因此減少了細(xì)胞毒性。
[0073]2)平臺(tái)性:雖然現(xiàn)階段主要定向于肺癌和胃癌的術(shù)后治療，但作為一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，它可以衍生出多種產(chǎn)品，也可用于乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌，鼻咽癌，頭頸癌等的術(shù)后治療。靶向腫瘤疫苗既可以提高惡性腫瘤病人的治愈率，減少轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，也可以大幅度減輕因化療、放療而給病人帶來的副作用。
[0074]3)價(jià)格在非靶向性癌癥疫苗的I %以下:相比美國(guó)藥監(jiān)局剛剛通過的Provenge癌癥疫苗(一個(gè)療程9萬4千美元)，我們的產(chǎn)品將更加針對(duì)中國(guó)人群，價(jià)格在其1%以下。
[0075]本發(fā)明的腫瘤疫苗以表達(dá)GM-CSF和在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1的滅活腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)，將其與未成熟的樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，達(dá)到激活樹突狀細(xì)胞的目的，使其成為成熟的細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中，成熟的樹突狀細(xì)胞通過與滅活腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生了特異性，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，腫瘤疫苗能夠激活患者體內(nèi)B細(xì)胞與T細(xì)胞，使其攻擊體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的效果。該項(xiàng)腫瘤疫苗還可以單獨(dú)使用，或者與化療藥物搭配使用，在治療多種腫瘤治療甚至在預(yù)防腫瘤及其復(fù)發(fā)方面起到重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0076]圖1.Renca細(xì)胞表面表達(dá)NY_ES0_1分子降低了其致腫瘤性。
[0077]A,編譯細(xì)胞表面分子NY-ES0-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體圖示。B，共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光染色圖?？笻A抗體和Cy3 二抗染色表達(dá)NY-ES0-1的Renca細(xì)胞(Renca-ESO)。DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。C，對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1 (Renca-ESO，紅色)和GFP (Renca-GFP，綠色)的Renca細(xì)胞進(jìn) 行流式分析，原代Renca細(xì)胞(黑色)作為陰性對(duì)照。D,用體外的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Renca，Renca-GFP和Renca-ESO在指定時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)率。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)方差。E，BALB/c小鼠(η = 5)，側(cè)腹部進(jìn)行皮下注射I X IO6的Renca, Renca-GFP或Renca-ESO細(xì)胞,觀察腫瘤的發(fā)展。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果。*Ρ〈0.05。
[0078]圖2.細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠使機(jī)體內(nèi)和離體培養(yǎng)的DC細(xì)胞活性增強(qiáng)。
[0079]Α,在機(jī)體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1能夠增強(qiáng)DCs的活性。對(duì)BALB/c小鼠(η = 3)進(jìn)行后腳墊皮下注射IX IO6的Renca, Renca-GFP或Renca-ESO細(xì)胞,3天后,腿彎部的淋巴結(jié)細(xì)胞被收集，與相應(yīng)的抗體孵育染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。非引流的對(duì)側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖示為⑶Ilc陽(yáng)性，同時(shí)⑶86、⑶80或MHC II陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。B,表面表達(dá)NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)BMDCs成熟。將WT和TLR4-/-的BALB/c小鼠的未成熟BMDCs與Renca, RencaGFP或Renca-ESO共培養(yǎng)24小時(shí)。作為對(duì)照，其中兩組BMDC分別加入10ng/mL LPS和5 μ g/mL CpG刺激培養(yǎng)24小時(shí)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這些BMDC細(xì)胞⑶86、⑶80和MHC II的表達(dá)量來評(píng)價(jià)。平均熒光強(qiáng)度(MFI)作為指標(biāo)(CDllc+門內(nèi)細(xì)胞)。數(shù)據(jù)來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。*P〈0.05。
[0080]圖3.細(xì)胞表面表達(dá)NY-ESO-1能夠增強(qiáng)腫瘤特異性⑶8+T細(xì)胞免疫。
[0081]A，腫瘤細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤⑶8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究計(jì)劃。給正常BALB/c小鼠(η = 4)側(cè)腹部?jī)?nèi)皮下注射兩次I X IO6被福射(Ir.，35gray)過的Renca, Renca-GFP或Renca-ESO細(xì)胞,兩次注射時(shí)間間隔為兩周。第二次注射七天后，處死小鼠，分析小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答。B，體外CTL實(shí)驗(yàn)。將未成熟的免疫小鼠脾細(xì)胞，以不同比率與作為靶細(xì)胞的活Renca細(xì)胞或NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行LDH釋放實(shí)驗(yàn)，其中NIH3T3細(xì)胞為陰性對(duì)照。C，IFN- Y分泌實(shí)驗(yàn)。將輻射過的Renca或NIH3T3細(xì)胞與未成熟的免疫小鼠脾細(xì)胞刺激培養(yǎng)48小時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測(cè)IFN- Y分泌量。D和E，體內(nèi)的CTL實(shí)驗(yàn)。對(duì)未成熟免疫小鼠進(jìn)行靜脈注射CA9多肽刺激，CFSEhigh脾細(xì)胞(陽(yáng)性)和未刺激的，CFSE1?脾細(xì)胞(陰性對(duì)照)以1:1的比率混合。收獲脾細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞分析(D)?？乖禺愋詺陌俜直?E)。數(shù)據(jù)來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。*P〈0.05。圖4.細(xì)胞表面表達(dá)NY-ESO-1增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞疫苗的療效和TIL的富集。
[0082]A,皮下腫瘤模型的腫瘤細(xì)胞疫苗療效研究計(jì)劃。將BALB/c小鼠(η = 5)右側(cè)腹部皮下注射IXlO6Renca細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞接種六天后，小鼠(η = 5)不經(jīng)過處理或從左側(cè)腹部皮下注射2Χ IO6經(jīng)福射的(ir, 35gray)Renca, Renca-GFP或Renca-ESO細(xì)胞3次，每次注射間隔兩天。第30天處死小鼠并分析TIL。B,接種疫苗小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)曲線。C，未經(jīng)處理的和接種疫苗的小鼠腫瘤內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的流式等高線圖。D，未經(jīng)處理的和接種疫苗的小鼠每毫克腫瘤內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到相似結(jié)果。*Ρ〈0.05。
[0083]圖5.Renca-ESO疫苗抗腫瘤療效的增強(qiáng)與其能減少M(fèi)DSC和Treg有關(guān)。
[0084]A和C ，與圖4相同，未經(jīng)處理的和接種疫苗的小鼠的脾臟內(nèi)MDSC和Treg的流式等高線圖。B和D，未經(jīng)處理的和接種疫苗的小鼠的脾臟內(nèi)MDSC和Treg的細(xì)胞數(shù)量。數(shù)據(jù)來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。*Ρ〈0.05。
[0085]圖6.基于肺轉(zhuǎn)移模型的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同腫瘤細(xì)胞疫苗治療腫瘤的抗腫瘤效果。
[0086]Α,肺轉(zhuǎn)移模型中腫瘤細(xì)胞疫苗療效的研究計(jì)劃。BALB/c小鼠通過尾靜脈注射IX IO5Renca細(xì)胞。腫瘤接種六天后，小鼠(η = 4)不被處理或使用2Χ IO6輻射過的(ir, 35gray)Renca, Renca-GFP或Renca-ESO細(xì)胞皮下注射3次，每次注射間隔兩天。第25-28天處死小鼠并數(shù)出白色小瘤。B和C，各組肺轉(zhuǎn)移的典型圖片匯總(B)和H&E染色切片(C)。D,墨水染色肺部后肺部白色小瘤數(shù)量。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。*Ρ〈0.05。
【具體實(shí)施方式】:
[0087]實(shí)施例1腎癌腫瘤疫苗的制備方法
[0088]1、首先，將ImL編碼人類表面NY-ES0-1分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l-2xl06Phoenix 細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入 DNA 轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineLTX and PLUSReagents。轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作。
[0089]2、復(fù)蘇一支腎癌腫瘤細(xì)胞系，將其放入6孔板中，僅使用一孔，接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為I — 1.5X IO6Cells0放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度:37°C，CO2濃度:5% )。
[0090]3、等腫瘤細(xì)胞飽和度(貼壁)為50% -70%時(shí)，將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL新鮮培養(yǎng)液(混有濃度為8微克/mL的聚凝胺)加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)16小時(shí)以后，換新鮮培養(yǎng)液，并保持細(xì)胞快速生成，不要滿壁。
[0091]4、等將近90%滿壁時(shí)，將轉(zhuǎn)染NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶過程中使用EDTA對(duì)貼壁腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)約5 — 10天，細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)到 5 X IO7-1 X ΙΟ8。
[0092]5、用c-Myc對(duì)表面表達(dá)NY_ES0_1的活腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，進(jìn)行流式分選，使表達(dá)NY-ESO-1的腫瘤細(xì)胞純度大于90%，細(xì)胞收集率為5% -15%。
[0093]6、對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，培養(yǎng)5 — 10天，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到lX108cells。
[0094]7、在六孔板中接種I 一 1.5X IO6Cells純化擴(kuò)增后的NY-ES0-1腫瘤細(xì)胞，其余細(xì)胞進(jìn)行液氮保存。
[0095]8、將ImL編碼人類表面GM-CSF分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l_2xl06Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineLTX and PLUSReagents0轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作(同第一步一樣，該步驟還需仔細(xì)修改，不過這次retrovirus已經(jīng)做好)。
[0096]9、將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，添加前細(xì)胞一定處于快速生長(zhǎng)期，且只有50%左右confluency，培養(yǎng)12小時(shí)。
[0097]10、用GM-CSF的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液，最終保證二十四小時(shí)內(nèi)每百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞分泌GM - CSF到達(dá)lng/ml以上。如果不行，重復(fù)以上9 一 10步驟2_3次。
[0098]11、將上述細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，對(duì)其進(jìn)行300Gy的輻照儀處理，得到滅活細(xì)胞。該滅活細(xì)胞可以單獨(dú)使用，視腫瘤種類做皮下，靜脈，或者淋巴節(jié)注射。也可做如下處理。
[0099]12、采集患者外周血，對(duì)外周血進(jìn)行分離，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并制成DC0
[0100]13、將滅活腫瘤細(xì)胞與DC進(jìn)行共同培養(yǎng)，培養(yǎng)I天。
[0101]14、第2天，DC細(xì)胞經(jīng)具體途徑視腫瘤種類而定，回輸給患者。
[0102]實(shí)施例2肝癌腫瘤疫苗的制備方法
[0103]1、首先，將ImL編碼人類表面NY-ES0-1分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l-2xl06Phoenix 細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入 DNA 轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineLTX and PLUSReagents。轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作。
[0104]2、復(fù)蘇一支肝癌腫瘤細(xì)胞系，將其放入6孔板中，僅使用一孔，接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為I — 1.5X IO6Cells0放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度:37°C，CO2濃度:5% )。
[0105]3、等腫瘤細(xì)胞飽和度(貼壁)為50%-70%時(shí)，將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL新鮮培養(yǎng)液(混有濃度為8微克/mL的聚凝胺)加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)16小時(shí)以后，換新鮮培養(yǎng)液，并保持細(xì)胞快速生成，不要滿壁。
[0106]4、等將近90%滿壁時(shí)，將轉(zhuǎn)染NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶過程中使用EDTA對(duì)貼壁腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)約5 — 10天，細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)到 5 X 107-1 X 108。
[0107]5、用c-Myc對(duì)表面表達(dá)NY_ES0_1的活腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，進(jìn)行流式分選，使表達(dá)NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞純度大于90%，細(xì)胞收集率為5% -15%。
[0108]6、對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，培養(yǎng)5 — 10天，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到lX108cells。
[0109]7、在六孔板中接種I 一 1.5X IO6Cells純化擴(kuò)增后的NY-ES0-1腫瘤細(xì)胞，其余細(xì)胞進(jìn)行液氮保存。
[0110]8、將ImL編碼人類表面GM-CSF分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l_2xl06Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineLTX and PLUSReagents0轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作(同第一步一樣，該步驟還需仔細(xì)修改，不過這次retrovirus已經(jīng)做好)。
[0111]9、將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，添加前細(xì)胞一定處于快速生長(zhǎng)期，且只有50%左右confluency，培養(yǎng)12小時(shí)。
[0112]10、用GM-CSF的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液，最終保證二十四小時(shí)內(nèi)每百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞分泌GM - CSF到達(dá)lng/ml以上。如果不行，重復(fù)以上9 一 10步驟2_3次。
[0113]11、將上述細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，對(duì)其進(jìn)行300Gy的輻照儀處理，得到滅活細(xì)胞。該滅活細(xì)胞可以單獨(dú)使用，視腫瘤種類做皮下，靜脈，或者淋巴節(jié)注射。也可做如下處理。
[0114]12、采集患者外周血，對(duì)外周血進(jìn)行分離，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并制成DC.
[0115]13、將滅活腫瘤細(xì)胞與DC進(jìn)行共同培養(yǎng)，培養(yǎng)I天。
[0116] 14、第2天，DC細(xì)胞經(jīng)具體途徑視腫瘤種類而定，回輸給患者。
【權(quán)利要求】
1.一種治療性腫瘤疫苗，由一種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)后制備得到；其中，所述轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞系是用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染得到的，具有在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子和/或在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ESO-1分子的能力；所述在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GM-CSF分子的能力通過病毒或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得；所述在細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1分子的能力通過病毒或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)獲得；所述腫瘤細(xì)胞是從患者身上獲得的活的腫瘤細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)染是將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒和Phoenix細(xì)胞混合，其中加入DNA轉(zhuǎn)染試劑得到含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的Phoenix細(xì)胞上清液；然后再用該細(xì)胞上清液和腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞；轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增，然后利用表面表達(dá)的NY -ESO -1分子進(jìn)行流式細(xì)胞儀介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞純化，對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行GM - CSF轉(zhuǎn)染，得到可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞系；所述制備是將所得可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行滅活，得到滅活的可表達(dá)GM - CSF的純化的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤細(xì)胞；將該滅活的腫瘤細(xì)胞和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)，得到細(xì)胞混合物，再經(jīng)提取分離即得。
2.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于:所述的腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF分子。
3.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于:所述的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)NY-ES0-1分子。
4.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于:所述的腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)GM-CSF分子和表面NY-ES0-1分子。
5.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，在制備轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞過程中，其特征在于:腫瘤細(xì)胞來源于病人本身的腫瘤體外培養(yǎng)細(xì)胞，異體的腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞系，或者多個(gè)異體腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞系混合。
6.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于實(shí)體瘤或者液體腫瘤可以通過病毒，或者DNA質(zhì)粒介導(dǎo)達(dá)到表達(dá)GM-CSF和表面NY -ES0-1的作用。
7.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于腫瘤細(xì)胞包括胰腺癌，肺癌，胃癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌，鼻咽癌，頭頸癌。
8.如權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于疫苗制備過程需要通過細(xì)胞分選以達(dá)到90%以上的細(xì)胞表面NY -ES0-1表達(dá)效率。
9.權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)使用Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒:首先，在六孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2微克編碼人類GM-CSF或表面NY-ES0-1分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l_2xl06Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineLTX and PLUSReagents,轉(zhuǎn)染24小時(shí)以后，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作； 2)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞:在一個(gè)六孔板中，IxlO6腫瘤細(xì)胞將被放在0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺中懸浮培養(yǎng)； 3)純化擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞:以上基因工程轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠通過流式細(xì)胞儀對(duì)抗癌基因抗體熒光染色的活細(xì)胞進(jìn)一步分選，達(dá)到大于90 %的純度，之后，對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增； 4)多次GM— CSF轉(zhuǎn)染:在以上純化的腫瘤細(xì)胞到達(dá)5xl06以后，進(jìn)行多次GM — CSF病毒轉(zhuǎn)染，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清液，保證二十四小時(shí)內(nèi)每百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞分泌GM - CSF到達(dá).3ng/ml 以上； 5)滅活制備腫瘤疫苗:細(xì)胞系做成單細(xì)胞懸液經(jīng)過300Gy的輻照儀照射，得到滅活細(xì)胞； 6)上述滅活細(xì)胞和DC細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，得到混合細(xì)胞懸液。 7)對(duì)混合細(xì)胞懸液進(jìn)行純化，分離，配制，制備成疫苗制劑。
10.權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)首先，將IrnL編碼人類表面NY-ESO-1分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l-2xl06Phoenix 細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入 DNA 轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineLTX and PLUSReagents。轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作， 2)復(fù)蘇一支腫瘤細(xì)胞系，將其放入6孔板中，僅使用一孔，接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為1一1.5X106cells。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 3)等腫瘤細(xì)胞飽和度為50%-70%時(shí)，將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL新鮮培養(yǎng)液加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)16小時(shí)以后,換新鮮培養(yǎng)液,并保持細(xì)胞快速生成,不要滿壁， 4)等將近90%滿壁時(shí)，將轉(zhuǎn)染NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶過程中使用EDTA對(duì)貼壁腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)約5 — 10天，細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)到 5 X IO7-1 X IO8, 5)用c-Myc對(duì)表面表達(dá)NY-ES0-1的活腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，進(jìn)行流式分選，使表達(dá)NY-ES0-1的腫瘤細(xì)胞純度大于90%，細(xì)胞收集率為5% -15%， 6)對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，培養(yǎng)5— 10天，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到IXlO8Cells, 7)在六孔板中接種I一 1.5X IO6Cells純化擴(kuò)增后的NY-ES0-1腫瘤細(xì)胞，其余細(xì)胞進(jìn)行液氮保存， 8)將ImL編碼人類表面GM-CSF分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA質(zhì)粒加入l_2xl06Phoenix細(xì)胞系統(tǒng)，同時(shí)加入DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineLTX and PLUSReagents,轉(zhuǎn)染24小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行下一步操作， 9)將0.5mL逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺加入腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，添加前細(xì)胞一定處于快速生長(zhǎng)期，且只有50%左右confluency，培養(yǎng)12小時(shí)， 10)用GM-CSF的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液，最終保證二十四小時(shí)內(nèi)每百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞分泌GM - CSF到達(dá)10ng/ml以上， 11)將上述細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，對(duì)其進(jìn)行300Gy的輻照儀處理，得到滅活細(xì)胞。該滅活細(xì)胞可以單獨(dú)使用，視腫瘤種類做皮下，靜脈，或者淋巴節(jié)注射， 12)采集患者外周血，對(duì)外周血進(jìn)行分離，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，并制成DC， 13)將滅活腫瘤細(xì)胞與DC進(jìn)行共同培養(yǎng)，培養(yǎng)I天， 14)第2天，DC細(xì)胞經(jīng)具體途徑視腫瘤種類而定，回輸給患者。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103933558SQ201410201724
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
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