一種通過環(huán)糊精表面接枝來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過環(huán)糊精表面接枝來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，首先對結(jié)晶板表面進行處理，使結(jié)晶板表面羥基化，采用環(huán)糊精或其衍生物修飾結(jié)晶板表面；然后配置蛋白溶液，最終建立蛋白質(zhì)結(jié)晶體系，進行結(jié)晶。本發(fā)明只需要對結(jié)晶板進行兩步處理即可得到表面接枝環(huán)糊精的結(jié)晶板，一次可處理大量結(jié)晶板，同時工藝簡單，避免了逐一添加異相形核劑的人工與時間耗費。通過本發(fā)明，結(jié)晶成功率的提高最大可達到現(xiàn)有技術(shù)的2倍以上。
【專利說明】
一種通過環(huán)糊精表面接枝來提局蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種在結(jié)晶板表面接枝環(huán)糊精或其衍生物用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，特別是通過在結(jié)晶板表面接枝環(huán)糊精或其衍生物來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)作為生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，對其功能研究具有重要的生物學(xué)意義。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是功能研究的前提和基礎(chǔ)，因此解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對闡明相關(guān)的生物學(xué)問題具有重要的意義。目前獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)主要有X-射線衍射技術(shù)、核磁共振技術(shù)和冷凍電鏡等，其中應(yīng)用最廣和精度最高的是X-射線衍射技術(shù)。獲得可衍射的蛋白質(zhì)晶體是實現(xiàn)該技術(shù)的前提和基礎(chǔ)，但目前蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率較低，嚴重制約了該項技術(shù)的發(fā)展，所以如何提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率是首當(dāng)其沖需要解決的問題。
[0003]蛋白質(zhì)結(jié)晶包括兩個步驟，蛋白質(zhì)分子首先在過飽和溶液中形核，繼而在晶核表面進行有序堆積，完成晶體生長，其中形核是蛋白質(zhì)結(jié)晶的關(guān)鍵和前提。只有蛋白質(zhì)溶液和鹽溶液濃度達到過飽和才能跨越形核勢皇而形核，這就使形核變得非常困難。在提高蛋白質(zhì)形核成功率的諸多嘗試中，通過添加異相形核劑來提高結(jié)晶成功率是目前應(yīng)用最為廣泛的方法，將異相核引入蛋白結(jié)晶體系中，可以使蛋白質(zhì)分子免除跨越形核勢皇的步驟，而直接在異相核表面堆積從而進行晶體生長。通常，這些異相核需要手動逐一添加到結(jié)晶體系中，阻礙了結(jié)晶自動化的實現(xiàn)，同時也非常耗費時間與人工，最簡單的解決方法是對結(jié)晶基底直接接枝異相核來提高結(jié)晶效率。目前，已經(jīng)有一些通過對結(jié)晶板表面進行官能團修飾來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，文獻“Pham T.,Lai D., Ji D.，et al.,Well-orderedself-assembled monolayer surfaces can be used to enhance the growth ofprotein crystals,Colloids and Surfaces B:B1interfaces,2004,34(3):191-196^ ψ報道，表面修飾i 燒硫醇、十二燒硫醇、十八燒硫醇構(gòu)成的疏水自組裝單分子層的鍍金玻璃載玻片，比傳統(tǒng)硅烷化玻璃載玻片更快得到晶體，同時晶體尺寸也會增加，結(jié)晶成功率顯著提高。可見，對結(jié)晶板表面進行修飾是一種有效地提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法。
[0004]環(huán)糊精是由葡萄糖單元組成的環(huán)狀低聚糖，其中各葡萄糖單元均以I，4-糖苷鍵結(jié)合成環(huán)，其分子呈現(xiàn)兩端開口的中空筒狀結(jié)構(gòu)，筒狀外緣相對親水而空腔內(nèi)部相對疏水。特殊的結(jié)構(gòu)使環(huán)糊精或其衍生物可以與其它分子結(jié)合構(gòu)成包合物。環(huán)糊精現(xiàn)已經(jīng)成功地應(yīng)用于蛋白復(fù)性、穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)、膜蛋白純化等方面。文獻“Anand U.,Mukherjee S.，Reversibility in protein folding:effect of beta-cyclodextrin on bovine serumalbumin unfolded by sodium dodecyl sulphate,Physical Chemistry ChemicalPhysics ,2013,15(23): 9375-83”中報道，β-環(huán)糊精可以提高由十二烷基硫酸鈉引起的牛血清白蛋白變性的復(fù)性效率。
[0005]
【申請人】已提交了一種使用環(huán)糊精作為籽晶來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法的專利申請，將環(huán)糊精及其衍生物添加到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系中作為異相形核劑來促進晶體形核。通過此發(fā)明，證明環(huán)糊精及其衍生物對于蛋白質(zhì)結(jié)晶有促進作用。但是原有技術(shù)中需要將環(huán)糊精手動逐一添加到結(jié)晶體系中，耗費時間和人工并且不利于自動化的實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種將環(huán)糊精或其衍生物接枝于結(jié)晶板表面來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，通過對結(jié)晶基底直接接枝環(huán)糊精或其衍生物來提高結(jié)晶效率，直接對結(jié)晶板進行表面改造免除了異相形核劑逐一添加至結(jié)晶體系的步驟，極大的節(jié)約了時間，提高了效率。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0008](a)對結(jié)晶板表面進行處理，包括以下內(nèi)容:
[0009]用H20、98wt%*硫酸和K2Cr2O7配置成處理液，其中H20、濃硫酸和K2Cr2O7所占的質(zhì)量份數(shù)為(30?70): (30?70): (0.5?5)，用處理液浸泡材質(zhì)為聚苯乙烯的結(jié)晶板20min?240min;然后用去離子水將浸泡后的結(jié)晶板表面沖洗干凈;將結(jié)晶板放入I?20wt %的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面含有羥基的結(jié)晶板；
[0010]將表面含有羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)pH為4?7、含0.5?2vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷、0.5?2to I % H2O的乙醇溶液中室溫浸泡6?24h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再將其浸入0.01?0.2?丨％環(huán)糊精或其衍生物的無水乙醇溶液中，于75 °C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板；
[0011](b)配置用于溶解蛋白質(zhì)的緩沖液，使pH值在3?1，濃度范圍為0.001?IM，溶解蛋白質(zhì)，得到終濃度為I?100mg/ml蛋白溶液；
[0012](c)將結(jié)晶試劑與蛋白溶液按照體積比為(0.01?50):1滴加在環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板中，建立蛋白質(zhì)結(jié)晶體系用于結(jié)晶；
[0013](d)將蛋白質(zhì)結(jié)晶體系在O?60°C環(huán)境下靜置I?720h結(jié)晶；在顯微鏡下統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體的條件數(shù)目。
[0014]所述的環(huán)糊精或其衍生物包括但不限于環(huán)糊精、烯丙基-環(huán)糊精、羥丙基-環(huán)糊精、羥丁基-環(huán)糊精、己二胺基-環(huán)糊精、對甲苯磺?；h(huán)糊精、聚合環(huán)糊精、乙二胺-環(huán)糊精、甲基-環(huán)糊精、巰基-環(huán)糊精和羧甲基-環(huán)糊精。
[0015]所述的緩沖液包括但不限于三羥甲基氨基甲烷系統(tǒng)、硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸、磷酸鹽、醋酸、巴比妥酸、檸檬酸、碳酸。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:通過在結(jié)晶板表面接枝環(huán)糊精或其衍生物，來促進晶體形核，從而使蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率能夠提高。環(huán)糊精及其衍生物由于其特殊的結(jié)構(gòu)特征，在蛋白相關(guān)研究中已有廣泛應(yīng)用，將其直接表面接枝修飾在結(jié)晶板表面，可以實現(xiàn)簡化添加異相形核劑的過程，又提高了結(jié)晶成功率。在本發(fā)明中只需要對結(jié)晶板進行兩步處理即可得到表面接枝環(huán)糊精的結(jié)晶板，一次可處理大量結(jié)晶板，同時工藝簡單，避免了逐一添加異相形核劑的人工與時間耗費。通過本發(fā)明，結(jié)晶成功率的提高最大可達到現(xiàn)有技術(shù)的2倍以上。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實施例。
[0018]本發(fā)明提供一種通過對結(jié)晶板表面接枝環(huán)糊精或其衍生物來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，具體的技術(shù)方案步驟如下:
[0019](a)對結(jié)晶板表面進行處理
[0020]①結(jié)晶板表面羥基化:對目前商業(yè)的結(jié)晶板材質(zhì)常用的聚苯乙烯(polystyrene，簡寫為PS)板進行表面處理。首先，用H20、98%濃硫酸和1(2&207配置成的處理液(其中處理液H20、濃硫酸和K2Cr2O7各組分所占的質(zhì)量配比分別為(30?70): (30?70): (0.5?5)，浸泡PS板20min?240min;然后，用去離子水將浸泡后的PS板表面沖洗干凈;接著，將結(jié)晶板放入I?20wt%的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后，用去離子水清洗干凈，即得到表面含有輕基的PS板；
[0021]②環(huán)糊精或其衍生物修飾結(jié)晶板表面:首先，將表面含有羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)pH為4?7，含0.5?2vol % 2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，0.5?2vol %H20的乙醇溶液中室溫浸泡6?24h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再將其浸入0.01?0.2wt%環(huán)糊精或其衍生物(所述的環(huán)糊精或其衍生物包括但不限于環(huán)糊精、烯丙基-環(huán)糊精、羥丙基-環(huán)糊精、羥丁基-環(huán)糊精、己二胺基-環(huán)糊精、對甲苯磺酰基環(huán)糊精、聚合環(huán)糊精、乙二胺-環(huán)糊精、甲基-環(huán)糊精、巰基-環(huán)糊精和羧甲基-環(huán)糊精)的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板；
[0022](b)配置蛋白溶液:配置用于溶解蛋白質(zhì)的緩沖液(指所有可以減少溶液體系內(nèi)pH改變，維持體系酸堿度的溶液，緩沖液類型包括但不限于三羥甲基氨基甲烷系統(tǒng)、硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸、磷酸鹽、醋酸、巴比妥酸、檸檬酸、碳酸)，使其PH值在3?10，濃度范圍為
0.001?IM，溶解蛋白質(zhì)，得到終濃度為I?100mg/ml蛋白溶液；
[0023](c)蛋白質(zhì)結(jié)晶體系的建立:將結(jié)晶試劑(指所有用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的試劑)與蛋白溶液按照體積比為(0.01?50):1滴加在環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板中，建立蛋白質(zhì)結(jié)晶體系用于結(jié)晶；
[0024](d)結(jié)晶:將蛋白質(zhì)結(jié)晶體系在O?60°C環(huán)境下靜置I?720h結(jié)晶。在顯微鏡下統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體的條件數(shù)目。
[0025]實施例1:葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)晶條件的篩選
[0026]第一步:通過表面處理得到甲基環(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用H20、98%濃硫酸和K2Cr2O7按照質(zhì)量百分比30: 65: 5混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板40min;然后，用去離子水將浸泡過的PS板表面沖洗干凈;接著，將處理的結(jié)晶板放入1wt %的60°〇稀硫酸溶液中24h;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面接枝羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)PH約為4，含lvol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，Ivol^H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡12h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再浸入0.15vol %甲基環(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡5h，取出后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝甲基環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0027]第二步:將美國Hampton公司的葡萄糖異構(gòu)酶溶于pH為3，0.5M的HEPES-Na緩沖液中，達到終濃度為2mg/ml，得到葡萄糖異構(gòu)酶溶液；
[0028]第三步:用Hampton公司的Index?試劑盒的96種結(jié)晶試劑篩選葡萄糖異構(gòu)酶晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為0.1:1滴加在結(jié)晶板坐滴孔中混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
[0029]第四步:將結(jié)晶體系置于15°C條件下靜置結(jié)晶72h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)葡萄糖異構(gòu)酶晶體的條件個數(shù)。
[0030]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:61種結(jié)晶條件中出現(xiàn)了葡萄糖異構(gòu)酶晶體，結(jié)晶成功率為63.54%。與未處理結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了2.1倍。
[0031]實施例2:溶菌酶結(jié)晶條件的篩選
[0032]第一步:通過表面處理得到β-環(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用H20、98%濃硫酸和K2Cr2O7按照質(zhì)量百分比50: 47: 3混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板20min;然后，用去離子水將處理過的PS板表面沖洗干凈;接著，將處理的結(jié)晶板放入15wt %的60°(:稀硫酸溶液中浸泡Ih;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面接枝羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)PH約為6，含IV01 % 2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，1.5to I % H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡24h，取出后將其用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再浸入0.15νο1%β-環(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡10h，取出后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝β-環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0033]第二步:將日本Seikagaku公司的溶菌酶溶于pH為4.6,0.1M的醋酸鈉緩沖液中，達到終濃度為80mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
[0034]第三步:將80mg/ml氯化鈉溶液與蛋白質(zhì)溶液按照體積比30: I滴加在結(jié)晶板坐滴孔中，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
[0035]第四步:將結(jié)晶體系置于4°C條件下靜置結(jié)晶24h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)溶菌酶晶體的條件個數(shù)。
[0036]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:72種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了溶菌酶晶體，結(jié)晶成功率為75%。與現(xiàn)有技術(shù)中使用未處理的結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了2.4倍。
[0037]實施例3:刀豆球蛋白結(jié)晶條件的篩選
[0038]第一步:通過表面處理得到對甲苯磺?；h(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用出0、98%濃硫酸和1(2(^207按照質(zhì)量百分比40: 58: 2混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板140min;然后，用去離子水將處理過的PS板表面沖洗干凈;接著，將處理的結(jié)晶板放入10^%的55°(:稀硫酸溶液中浸泡1h;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面接枝羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)pH約為5.5，含2vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，0.5to I % H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡I Oh，取出后將其用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再浸入0.0Svol %對甲苯磺?；h(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡5h，然后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝對甲苯磺酰基環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0039]第二步:將美國Sigma公司的刀豆球蛋白溶于pH為7，0.0lM的HEPES-Na緩沖液中，達到終濃度為30mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
[0040]第三步:用Hampton公司的Index?試劑盒的96種結(jié)晶試劑篩選刀豆球蛋白晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為1:1滴加在結(jié)晶板坐滴孔中混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系;
[0041]第四步:將結(jié)晶體系置于20°C條件下靜置結(jié)晶168h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)刀豆球蛋白晶體的條件個數(shù)。
[0042]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:43種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了刀豆球蛋白晶體，結(jié)晶成功率為44.79%。與現(xiàn)有技術(shù)中使用未處理的結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了2.69倍。
[0043]實施例4:蛋白酶K結(jié)晶條件的篩選
[0044]第一步:通過表面處理得到巰基環(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用H20、98%濃硫酸和K2Cr2O7按照質(zhì)量百分比45: 54.5:0.5混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板120min;然后，用去離子水將處理過的PS板表面沖洗干凈；接著，將處理的結(jié)晶板放入15^%的70°(:稀硫酸溶液中浸泡3h;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面接枝羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)pH約為4.3，含1.5vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，Ivol^H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡12h，取出后將其用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干，浸入0.01%1%巰基環(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°(:浸泡711，然后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝巰基環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0045]第二步:將美國Sigma公司的蛋白酶K溶于pH為9，IM的Tris緩沖液中，達到終濃度為50mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
[0046]第三步:用Hampton公司的Index?試劑盒的96種結(jié)晶試劑篩選蛋白酶K晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為10:1滴加在結(jié)晶板坐滴孔中混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系;
[0047]第四步:將結(jié)晶體系置于50°C條件下靜置結(jié)晶2h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白酶K晶體的條件個數(shù)。
[0048]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:65種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了蛋白酶K晶體，結(jié)晶成功率為67.71%。與現(xiàn)有技術(shù)中使用未處理的結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了2.83倍。
[0049]實施例5:核糖核酸酶A結(jié)晶條件的篩選
[0050]第一步:通過表面處理得到己二胺基環(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用H20、98%濃硫酸和1(2&207按照質(zhì)量百分比60: 39: I混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板200min;然后，用去離子水將浸泡過的PS板表面沖洗干凈;接著，將結(jié)晶板放入5wt %的68°〇稀硫酸溶液中浸泡3h;最后，用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面含有羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)PH約為5，含1.6vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，1.4vol%H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡20h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再將其浸入0.05vol %己二胺基環(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡7h，取出后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝己二胺基環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0051 ] 第二步:將美國Sigma公司的核糖核酸酶A溶于pH為8，0.025M的HEPES-Na緩沖液中，達到終濃度為20mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
[0052]第三步:用Hampton公司的CrystalScreen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結(jié)晶試劑篩選核糖核酸酶A晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為0.01:1滴加在結(jié)晶板坐滴孔中混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
[0053]第四步:將結(jié)晶體系置于10°C條件下靜置結(jié)晶720h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)核糖核酸酶A晶體的條件個數(shù)。
[0054]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:13種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了核糖核酸酶A晶體，結(jié)晶成功率為13.54%。與現(xiàn)有技術(shù)中使用未處理的結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了3.25倍。
[0055]實施例6:纖維素酶結(jié)晶條件的篩選
[0056]第一步:通過表面處理得到乙二胺基環(huán)糊精表面接枝的結(jié)晶板。具體為，用H20、98 %濃硫酸和1(2&207按照質(zhì)量百分比42:53.5:4.5混合后配置成處理液。用該處理液浸泡PS板240min;然后，用去離子水浸泡過的PS板表面沖洗干凈;接著，將結(jié)晶板放入20wt %的70°C稀硫酸溶液中浸泡12h;最后，用去離子水清洗干凈，即得到表面接枝羥基的PS板。將表面接枝羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)PH約為5.5，含2vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷，2voI % H2O的無水乙醇溶液中室溫浸泡24h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干；然后，再將其浸入0.1vol %乙二胺基環(huán)糊精的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡10h，取出后依次用乙醇、去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到表面接枝乙二胺基環(huán)糊精的結(jié)晶板；
[0057]第二步:將美國Sigma公司的纖維素酶溶于pH為6，0.0OlM的HEPES-Na緩沖液中，達到終濃度為1mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
[0058]第三步:用Hampton公司的CrystalScreen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結(jié)晶試劑篩選纖維素酶晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為0.5: I滴加在結(jié)晶板坐滴孔中混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
[0059]第四步:將結(jié)晶體系置于30°C條件下靜置結(jié)晶240h。顯微鏡下觀察統(tǒng)計出現(xiàn)纖維素酶晶體的條件個數(shù)。
[0060]經(jīng)過統(tǒng)計得到以下結(jié)果:28種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了纖維素酶晶體，結(jié)晶成功率為29.17%。與現(xiàn)有技術(shù)中使用未處理的結(jié)晶板的對照組相比，成功率提高了3.5倍。
【主權(quán)項】
1.一種通過環(huán)糊精表面接枝來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于包括下述步驟: (a)對結(jié)晶板表面進行處理，包括以下內(nèi)容: 用H2O、98wt %濃硫酸和K2Cr2O7配置成處理液，其中H2O、濃硫酸和K2Cr2O7所占的質(zhì)量份數(shù)為(30?70): (30?70): (0.5?5)，用處理液浸泡材質(zhì)為聚苯乙烯的結(jié)晶板20min?240min;然后用去離子水將浸泡后的結(jié)晶板表面沖洗干凈;將結(jié)晶板放入I?20wt %的50?70°C稀硫酸溶液中浸泡I?24h;最后用去離子水清洗干凈，即得到表面含有羥基的結(jié)晶板； 將表面含有羥基的結(jié)晶板放入用醋酸調(diào)pH為4?7、含0.5?2vol%2，3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷、0.5?2to I % H2O的乙醇溶液中室溫浸泡6?24h，取出后用乙醇沖洗數(shù)次，再用去離子水清洗干凈，N2吹干;然后，再將其浸入0.01?0.2wt%環(huán)糊精或其衍生物的無水乙醇溶液中，于75°C浸泡5?1h，取出后依次用乙醇和去離子水沖洗干凈，N2吹干，得到環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板； (b)配置用于溶解蛋白質(zhì)的緩沖液，使pH值在3?10，濃度范圍為0.001?IM，溶解蛋白質(zhì)，得到終濃度為I?100mg/ml蛋白溶液； (c)將結(jié)晶試劑與蛋白溶液按照體積比為(0.01?50):1滴加在環(huán)糊精或其衍生物表面接枝的結(jié)晶板中，建立蛋白質(zhì)結(jié)晶體系用于結(jié)晶； (d)將蛋白質(zhì)結(jié)晶體系在O?60°C環(huán)境下靜置I?720h結(jié)晶；在顯微鏡下統(tǒng)計出現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體的條件數(shù)目。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過環(huán)糊精表面接枝來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，，其特征在于:所述的環(huán)糊精或其衍生物包括但不限于環(huán)糊精、烯丙基-環(huán)糊精、羥丙基-環(huán)糊精、羥丁基-環(huán)糊精、己二胺基-環(huán)糊精、對甲苯磺?；h(huán)糊精、聚合環(huán)糊精、乙二胺-環(huán)糊精、甲基-環(huán)糊精、巰基-環(huán)糊精和羧甲基-環(huán)糊精。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過環(huán)糊精表面接枝來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，，其特征在于:所述的緩沖液包括但不限于三羥甲基氨基甲烷系統(tǒng)、硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸、磷酸鹽、醋酸、巴比妥酸、檸檬酸、碳酸。
【文檔編號】C12N9/92GK105924496SQ201610393710
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】張辰艷, 楊雪舟, 尹大川, 王前進, 董晨, 郭云珠, 閆二開
【申請人】西北工業(yè)大學(xué)