本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種淡菜甾體活性組分提取物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界60歲及以上老齡人口在2013年已達(dá)8.14億，預(yù)計(jì)到2050年這個(gè)數(shù)字將超過20億。世界已進(jìn)入老齡化社會，隨之而來的與衰老相關(guān)的疾病成為日益凸顯的問題。包括阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病是世界性的最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生難題之一。僅在中國，阿爾茨海默病的患者數(shù)量在1990年已有193萬，到2010年已增加至569萬。在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，尋找抗衰老及治療神經(jīng)退行性疾病的藥物已成為急需解決的問題。如公開號為CN102070695A的中國專利文獻(xiàn)公開了一種麥角甾醇衍生物，該麥角甾醇衍生物提取自中藥靈芝孢子粉；研究發(fā)現(xiàn)，在抗衰老化合物的體外篩選模型中，該麥角甾醇衍生物可以顯著延長酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。經(jīng)過對衰老機(jī)制的長期研究，本領(lǐng)域內(nèi)已形成多種衰老學(xué)說，包括程序衰老說、體細(xì)胞突變說、錯(cuò)誤成災(zāi)說，自由基說、神經(jīng)內(nèi)分泌說、免疫衰老說、細(xì)胞之學(xué)說，等等。由此可見，衰老是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，即便是同一類抗衰老藥物，其發(fā)揮藥效的方式也不盡相同，彼此之間無必然聯(lián)系。海洋生物由于生活在特殊的環(huán)境中，與陸地生物相比，結(jié)構(gòu)成分也具有特殊性，近年來成為新藥研究者的主要研究對象。并且我國的海洋資源豐富，繼中藥之后，海產(chǎn)品是另一個(gè)藥物資源寶庫。許多已上市的化妝品、保健品的功能性成分就來自于海產(chǎn)品，如膠原蛋白，二十二碳六烯酸(DHA)等。因此海產(chǎn)品為我們尋找抗衰老藥物提供了一個(gè)極具希望的新 領(lǐng)域。淡菜是貽貝(Mytilidae)肉的干制品。貽貝是馳名中外的海產(chǎn)食品之一，是貝類養(yǎng)殖事業(yè)中的重要種類，世界許多地區(qū)都有養(yǎng)殖。它的藥用價(jià)值也已有研究：一種治療耳鳴的中藥處方中就含有淡菜；淡菜中的寡肽對于老年性腦功能失調(diào)具有治療作用；淡菜所含的多級不飽和脂肪酸可預(yù)防心血管疾病；脂質(zhì)類提取物具有抗關(guān)節(jié)炎的作用。而目前關(guān)于淡菜的抗衰老活性還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種淡菜甾體活性組分提取物，該提取物具有較強(qiáng)的抗衰老效果。一種淡菜甾體活性組分提取物，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，包括：25～39％的膽固醇，19～27％的菜子固醇，12～25％的(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，12～25％的24-亞甲基膽固醇。上述四種甾醇化合物的結(jié)構(gòu)式分別為：其中，膽固醇(cholesterol)的理化性質(zhì)為：白色固體；分子式為C27H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z409.345,理論值：C27H46ONa(M+Na)+409.344.；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.86(d,3H,J＝2.0Hz),0.87(d,3H,J＝2.0Hz),0.92(d,3H,J＝6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.1,28.4,31.8,32.1,32.1, 35.9,36.3,36.7,37.4,39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,56.3,56.9,72.0,122.2,141.1.菜子固醇(brassicasterol)，系統(tǒng)命名為(22E,24R)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，其理化性質(zhì)為：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.345,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.5Hz),0.83(d,3H,J＝6.5Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.01(s,3H),1.01(d,3H,J＝6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8,32.1,33.3,36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9,136.0,140.9.(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇(crinosterol)的理化性質(zhì)為：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.345,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.8Hz),0.84(d,3H,J＝6.8Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.00(d,3H,J＝6.9Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.16(m,2H),5.35(m,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,18.2,19.6,19.8,20.3,21.2,21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9,40.4,42.4,42.5,43.2,50.3,56.1,57.1,72.0,121.9,132.0,136.2,141.0.24-亞甲基膽固醇(24-methylenecholesterol)，系統(tǒng)命名為麥角甾-5，24-(28)-二烯-3β-醇，其理化性質(zhì)為：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.344,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J＝6.9Hz),1.03(d,3H,J＝6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.6,21.3,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9,32.1,34.0,34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1,121.9,140.9,157.1。作為優(yōu)選，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述淡菜甾體活性組分提取物包括：27％的膽固醇，19％的菜子固醇，12％的(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，12％的24-亞甲基膽固醇。本發(fā)明還提供了所述淡菜甾體活性組分提取物的制備方法，包括：(1)將淡菜置于甲醇中浸提，得浸提物；作為優(yōu)選，將淡菜置于甲醇中，室溫下浸提2～3天。甲醇的破壁效果較好，提取效率較高。(2)用80％的甲醇水溶液和正己烷對浸提物進(jìn)行萃取，取正己烷層，得粗提物；(3)對粗提物進(jìn)行分離純化，獲得所述淡菜甾體活性組分提取物。所述分離純化包括以下步驟：(a)以正己烷：乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)作洗脫劑，采用硅膠開口柱對粗提物進(jìn)行第一次分離，獲得目標(biāo)餾分；對粗提物進(jìn)行TLC分析，確定溶劑系統(tǒng)，優(yōu)選地，將正己烷：乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)按體積比99:1、98:2、97:3、96:4、90:10、0:100依次洗脫，體積比90:10洗脫的餾分為目標(biāo)餾分。(b)以甲醇：水溶劑系統(tǒng)作洗脫劑，采用十八烷基鍵合硅膠開口柱對所述目標(biāo)餾分進(jìn)行第二次分離，獲得所述淡菜甾體活性組分提取物。對所述目標(biāo)餾分進(jìn)行TLC分析，確定溶劑系統(tǒng)，優(yōu)選地，將甲醇：水溶劑系統(tǒng)按照體積比90:10，93:7，95:5，100:0依次洗脫，取體積比95：5洗脫的餾分，獲得所述淡菜甾體活性組分提取物。以90％甲醇水溶液作流動(dòng)相，利用反相HPLC對所述淡菜甾體活性組分提取物作進(jìn)一步純化，從中分離到膽固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇和24-亞甲基膽固醇這四種甾醇化合物，在淡菜甾體活性組分提取物中，這四種甾醇化合物的總含量大于50％。本發(fā)明還提供了所述淡菜甾體活性組分提取物在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，該淡菜甾體活性組分提取物在抗衰老化合物的體外篩選模型中，可以顯著延長酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。為了研究作用機(jī)制，我們通過占重量比最大的膽固醇進(jìn)行了抗衰老機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)膽固醇是通過調(diào)節(jié)UTH1基因、SOD基因的表達(dá)，減少活性氧自由基(ROS)和丙二醛 (MDA)的產(chǎn)生，提高抗氧化能力，從而實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞復(fù)制性壽命的延長的。根據(jù)氧化自由基學(xué)說，氧化壓力是導(dǎo)致衰老的主要原因。即使在正常條件下線粒體也會產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物—活性氧(ROS)，這些物質(zhì)會破壞細(xì)胞膜和生物大分子，例如蛋白和核酸，進(jìn)而破壞細(xì)胞的功能，引起衰老和死亡。除此之外，活性氧還可通過氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生有害物來破壞細(xì)胞破，比如丙二醛。UTH1是一個(gè)與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因。UTH1敲除后的酵母不僅能顯著延長其在營養(yǎng)缺乏時(shí)的壽命，還能增強(qiáng)其對過氧化物的耐受性。轉(zhuǎn)錄因子Skn7能夠感受氧化壓力，進(jìn)而激活下游的與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，膽固醇的抗衰老活性與基因UTH1，Skn7相關(guān)。SOD也是與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因，表達(dá)的超氧化物歧化酶能夠清除氧自由基，緩解氧化壓力。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，膽固醇的抗衰老活性也與基因SOD相關(guān)。本發(fā)明還提供了一種抗衰老藥物或保健品，由所述淡菜甾體活性組分提取物和藥學(xué)上可接受的載體組成。所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，如填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑等。所述填充劑可采用淀粉、蔗糖或微晶纖維素；所述粘合劑可采用淀粉漿、羥丙纖維素、明膠或聚乙二醇；所述濕潤劑可采用硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇類；所述吸收促進(jìn)劑可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性劑可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外還可以加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。所述抗衰老藥物或保健品的劑型可以是片劑，丸劑，粉劑，分散片，小藥囊劑，酏劑，混懸劑，乳劑，溶液劑，糖漿劑，氣霧劑，軟膠囊，硬膠囊，無菌注射液，搽劑或栓劑；可制成常規(guī)、速釋、緩釋或延遲釋放制劑。本發(fā)明的抗衰老藥物或保健品可通過各種途徑給予，包括口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：在酵母衰老模型K6001啤酒酵母細(xì)胞中，本發(fā)明的淡菜甾體活性組分 提取物能夠顯著延長酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命，該組合物的抗衰老活性均高于膽固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇和24-亞甲基膽固醇這四種甾醇化合物單獨(dú)的抗衰老活性；本發(fā)明對延緩衰老及治療衰老性疾病方面的新藥研發(fā)進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。附圖說明圖1A為從淡菜中分離獲得的四種甾醇化合物的結(jié)構(gòu)式；其中，cholesterol表示膽固醇，brassicasterol表示菜子固醇，crinosterol表示(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，24-methylenecholesterol表示24-亞甲基膽固醇，下同；圖1B為本發(fā)明淡菜甾體活性組分提取物(SF)對酵母k6001的復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；其中，Control為陰性對照，Resveratrol為白藜蘆醇，SF是由淡菜分離得到的活性組分，經(jīng)HPLC純化得到Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol四個(gè)甾醇類化合物，其中的Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol的重量百分?jǐn)?shù)分別是27％，19％，12％，12％(四個(gè)化合物重量比例為23:16:10:10)，還含有30％的其他成分,下同；圖1C為四種甾醇化合物對酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；圖2為不同比例的甾醇成分所組成的混合物對酵母復(fù)制性壽命的影響?；旌衔?和混合物2完全由Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol搭配組成，重量比例分別為23:16:10:10和1:1:1:1；圖3A為膽固醇對酵母突變菌株Δuth1復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；其中，CHOL表示膽固醇，下同；圖3B為膽固醇對酵母突變菌株Δskn7復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；圖3C為膽固醇對酵母突變菌株Δsod1復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；圖3D為膽固醇對酵母突變菌株Δsod2復(fù)制性壽命的影響結(jié)果；圖4A為膽固醇對酵母細(xì)胞抗氧化性能的影響結(jié)果；圖4B為在氧壓下膽固醇對酵母細(xì)胞生存率的影響結(jié)果；圖5A為膽固醇對酵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響結(jié)果；其中，F(xiàn)luorescent/107cell表示每107個(gè)細(xì)胞的熒光值；圖5B為膽固醇對酵母細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響結(jié)果；其中，MDA(nmol/mgprotein)表示丙二醛(Malondialdehyde)的含量，單位為納摩爾/毫克蛋白。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1淡菜甾體活性組分提取物的制備本實(shí)施例淡菜甾體活性組分提取物的制備方法，包括以下步驟：(1)將179g淡菜干貨置于1L甲醇(工業(yè)級)中，室溫下浸提3天(震蕩)；經(jīng)抽濾濃縮后，得到甲醇浸提物。(2)用80％的甲醇水溶液和正己烷萃取分離，靜置過夜，將正己烷層減壓濃縮旋干后，得到正己烷層粗樣4g。(3)將正己烷層粗樣用硅膠開口柱進(jìn)行分離(200-300目)，以正己烷∶乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)作洗脫劑，按正己烷∶乙酸乙酯的體積比＝99:1，98:2，97:3，96:4，90:10，0:100依次洗脫，取體積比90:10洗脫的餾分。(4)將步驟(3)所取餾分用ODS開口柱進(jìn)行純化，以甲醇∶水溶劑系統(tǒng)作洗脫劑，按甲醇∶水的體積比＝90∶10，93∶7，95∶5，100∶0依次洗脫，取體積比95:5洗脫的餾分，得到淡菜甾體活性組分提取物147mg。(5)取淡菜甾體活性組分提取物16.7mg用反向HPLC純化，色譜條件：色譜柱ODS-HG-5(10/250mm)，流速3ml/min，檢測波長210nm，流動(dòng)相為為甲醇∶水＝90∶10，得到化合物cholesterol(膽固醇，4.5mg，保留時(shí)間為160.9min)，brassicasterol(菜子固醇，3.2mg，保留時(shí)間為146.7min)，crinosterol((22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，2.0mg，保留時(shí)間為136.9min)，24-methylenecholesterol(24-亞甲基膽固醇，2.0mg，保留時(shí)間為124.0min)。本實(shí)施例淡菜甾體活性組分提取物中含有27％的膽固醇，19％的菜子固醇，12％的(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇，12％的24-亞甲基膽固醇。(6)對所得四種化合物的理化特征及化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)13CNMR、1HNMR、HRMS、[α]D進(jìn)行分析結(jié)果如下：膽固醇的理化性質(zhì)：白色固體；分子式為C27H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z409.345,理論值：C27H46ONa(M+Na)+409.344.；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.86(d,3H,J＝2.0Hz),0.87(d,3H,J＝2.0Hz),0.92(d,3H,J＝6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.1,28.4,31.8,32.1,32.1,35.9,36.3,36.7,37.4,39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,56.3,56.9,72.0,122.2,141.1。菜子固醇的理化性質(zhì)：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.345,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.5Hz),0.83(d,3H,J＝6.5Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.01(s,3H),1.01(d,3H,J＝6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8,32.1,33.3,36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9,136.0,140.9。(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇的理化性質(zhì)：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.345,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.8Hz),0.84(d,3H,J＝6.8Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.00(d,3H,J＝6.9Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.16(m,2H),5.35(m,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,18.2,19.6,19.8,20.3,21.2,21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9,40.4,42.4,42.5,43.2,50.3,56.1,57.1,72.0,121.9,132.0,136.2,141.0。24-亞甲基膽固醇的理化性質(zhì)：白色固體；分子式為C28H46O；高分辨率質(zhì)譜ESI-TOF-MSm/z421.344,理論值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J＝6.9Hz),1.03(d,3H,J＝6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。13CNMR(125 MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.6,21.3,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9,32.1,34.0,34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1,121.9,140.9,157.1。四種化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1A所示。實(shí)施例2淡菜甾體活性組分提取物的抗衰老活性分析目前用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠，線蟲，果蠅和酵母。本實(shí)施例選擇釀酒酵母作為抗衰老研究的活性系統(tǒng)，因?yàn)榻湍甘菃渭?xì)胞的真核生物，生命周期短，已獲其完整的基因組數(shù)據(jù)，是目前常用的衰老模型生物。同時(shí)以白藜蘆醇作為陽性對照，白藜蘆醇是目前眾所周知的、在多種動(dòng)物模型上顯示抗衰老作用的小分子化合物。分析方法包括以下步驟：(1)從-30℃冰箱取出K6001酵母菌株，用PBS洗滌三次，每次5ml，除去其中的甘油。最后加入1mlPBS，吹打，使其懸浮后加入到5ml液體培養(yǎng)基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中。28℃振搖(160r/min)培養(yǎng)48小時(shí)。(2)培養(yǎng)結(jié)束后用5mlPBS洗滌三次，除去其中的液體培養(yǎng)基，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算酵母的濃度。(3)采用無水乙醇作溶劑，分別配制0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL的淡菜甾體活性組分提取物，1μM的膽固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇、24-亞甲基膽固醇，10μM的白藜蘆醇，備用。(4)在滅過菌的培養(yǎng)皿中加入5ml的固體培養(yǎng)基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的瓊脂粉)，待培養(yǎng)基凝固后，向其中分別加入步驟(3)中配制好的樣品，溶劑揮發(fā)后加入4000個(gè)酵母，用涂布器涂抹均勻，28℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)。(5)顯微鏡下每皿隨機(jī)數(shù)出40個(gè)母細(xì)胞分別產(chǎn)生的子細(xì)胞個(gè)數(shù)，并記錄、作圖分析，結(jié)果見圖1B、圖1C。圖1B中，陰性對照的K6001的平均壽命為8.0±0.34，陽性對照(10μM的白藜蘆醇)是9.7±0.53**；0.1、0.3、1μg/mL濃度的淡菜甾體活性組分提取物(SF)分別是10.3±0.46***,10.2±0.56**,9.2±0.43*。因 此，SF能延長酵母的復(fù)制性壽命，且在低濃度下活性最好。在圖1C中，陰性對照的K6001的平均壽命為是8.0±0.43；陽性對照是9.7±0.44**；在1μM的濃度下，膽固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇、24-亞甲基膽固醇分別是9.9±0.47**,9.9±0.47**，10.0±0.46**，9.8±0.43**。(*p<0.01，**p<0.01和***p<0.001表明有顯著性差異)。說明四個(gè)化合物在1μM均能顯著延長酵母的復(fù)制性壽命，且程度幾乎相同。對圖1B、C的結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)SF在濃度為0.1μg/ml時(shí)比其中的任何一個(gè)單獨(dú)化合物(最佳濃度1μM，相當(dāng)于約0.4μg/ml)的抗衰老活性強(qiáng)。實(shí)施例3不同組成的淡菜甾體活性組分提取物的抗衰老活性分析測試表1中不同組成的淡菜甾體活性組分提取物對酵母復(fù)制性壽命的影響，分析方法同實(shí)施例2，分析結(jié)果見圖2。表1三種淡菜甾體活性組分提取物的組成成分由圖2可見，陰性對照組酵母的平均壽命是8.1±0.43；陽性對照是10.6±0.52***；SF(即實(shí)施例1獲得的淡菜甾體活性組分提取物)(0.1μg/ml)是10.4±0.51***；混合物1(0.07μg/mL)是10.5±0.53***；混合物2(0.07μg/mL)是10.0±0.54**(**p<0.01和***p<0.001表明有顯著性差異)。對圖2的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)四個(gè)甾醇化合物以與SF中相同比例混合時(shí) (混合物1)，抗衰老活性與SF幾乎相同，表明SF中起到抗衰老作用的成分主要是這四種甾醇化合物，其他物質(zhì)的抗衰老活性較低；當(dāng)改變這四種甾醇化合物的比例時(shí)(混合物2)，仍然有顯著抗衰老活性，但與SF相比，活性強(qiáng)度稍減。說明四個(gè)甾醇化合物在SF的抗衰老活性中共同起著重要的作用，比例的改變影響較小。實(shí)施例4膽固醇的抗衰老機(jī)制分析(1)測試膽固醇在1μM的活性濃度下是否能夠延長敲除了UTH1基因的K6001酵母突變菌株(Δuth1)的復(fù)制性壽命，分析方法同實(shí)施例2，分析結(jié)果見圖3A。(2)測試膽固醇在1μM的活性濃度下是否能夠延長敲除了Skn7基因的K6001酵母突變菌株(Δskn7)的復(fù)制性壽命，分析方法同實(shí)施例2，分析結(jié)果見圖3B。(3)測試膽固醇在1μM的活性濃度下是否能夠延長敲除了SOD1基因的K6001酵母突變菌株(Δsod1)的復(fù)制性壽命，分析方法同實(shí)施例2，分析結(jié)果見圖3C。(4)測試膽固醇在1μM的活性濃度下是否能夠延長敲除了SOD2基因的K6001酵母突變菌株(Δsod2)的復(fù)制性壽命，分析方法同實(shí)施例2，分析結(jié)果見圖3D。由圖3A和3B可見，1μM的膽固醇能延長K6001的復(fù)制性壽命，但卻不能延長Δuth1和Δskn7的復(fù)制性壽命，說明膽固醇通過調(diào)節(jié)基因UTH1，Skn7的表達(dá)延長酵母細(xì)胞的復(fù)制性壽命。由圖3C和3D可見，1μM的膽固醇能延長K6001的復(fù)制性壽命，但卻不能延長Δsod1和Δsod2的復(fù)制性壽命，說明膽固醇的抗衰老活性與SOD基因有關(guān)。實(shí)施例5膽固醇提高酵母生存率的活性分析測試膽固醇能否提高酵母的生存率，測試方法如下：(1)將-30℃保存的野生型酵母BY4741用5mlPBS洗滌三次，除去其中的甘油；加入1ml無菌水，吹打使其懸浮，加入到5ml葡萄糖培養(yǎng)基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；將其放入搖床，28℃振搖 (160r/min)培養(yǎng)48小時(shí)，使其恢復(fù)生長能力。(2)將BY4741接種到25mL新的葡萄糖培養(yǎng)基，調(diào)整OD600值為0.1，然后分別與1μM、3μM的膽固醇和陽性對照品(10μM的根皮苷，Phloridzin)孵育12小時(shí)。(3)取各組含有相同酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液5μL滴在含有9mMH2O2的葡萄糖固體培養(yǎng)基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％瓊脂)上；28℃培養(yǎng)4天后觀察酵母的生長狀況并照相，觀察結(jié)果見圖4A；或者，BY4741與膽固醇孵育12小時(shí)后，取每組約200個(gè)細(xì)胞分別涂在含有和不含有4mMH2O2的葡萄糖固體培養(yǎng)基上；28℃培養(yǎng)2天后計(jì)算酵母細(xì)胞生存率；酵母細(xì)胞生存率(％)＝(含4mMH2O2的葡萄糖固體培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù)/不含H2O2的葡萄糖固體培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù))×100％；計(jì)算結(jié)果見圖4B。由圖4A可見，與陰性對照相比，在含有9mMH2O2的葡萄糖固體培養(yǎng)基上，1μM、3μM的膽固醇明顯增加了酵母的生存率。由圖4B可見，陰性對照的酵母細(xì)胞生存率為51.0％±0.8％，1μM、3μM的膽固醇孵育下，酵母細(xì)胞生存率分別提高到了60.6％±2.1％(p<0.01)和68.4％±1.9％(p<0.001)，而10μM的根皮苷孵育下，酵母細(xì)胞生存率提高到了61.5％±2.9％(p<0.01)。表明與根皮苷相比，膽固醇能夠進(jìn)一步提高酵母的生存率。實(shí)施例6膽固醇的抗氧化活性分析測試膽固醇能否提高酵母細(xì)胞的抗氧化能力，測試方法如下：將-30℃保存的K6001酵母菌株用5mlPBS洗滌三次，除去其中的甘油；加入1ml無菌水，吹打使其懸浮，加入到5ml液體培養(yǎng)基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；將其放入搖床，28℃振搖(160r/min)培養(yǎng)48小時(shí)，使其恢復(fù)生長能力；然后將K6001接種到25mL新的葡萄糖培養(yǎng)基，調(diào)整OD600值為0.1，然后分別與1μM、3μM的膽固醇孵育23小時(shí)，測定ROS或MDA含量。其中，使用ROS試劑盒(南京，江蘇，碧云天)和酶標(biāo)儀測定ROS 含量：取1mL酵母培養(yǎng)液，加入10μMDCFH-DA，置于搖床(160r/min)28℃黑暗培養(yǎng)1小時(shí)，每15分鐘渦旋震蕩，使酵母細(xì)胞與DCFH-DA充分混勻；然后用PBS洗滌細(xì)胞后將酵母加入到96孔板，測熒光值(激發(fā)波長488nm，吸收波長525nm)；用血球計(jì)數(shù)板測定酵母濃度最后計(jì)算出一定數(shù)量的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的熒光值。并與對照組比較；測定結(jié)果見圖5A。MDA的測定：酵母細(xì)胞與樣品孵育23小時(shí)后，加入8mMH2O2氧化刺激，維持一小時(shí)；之后收集各組的所有細(xì)胞并用PBS洗三次；然后加500μLPBS使酵母懸浮并通過超聲裂解(每次1分鐘，5次)使細(xì)胞破碎；4℃條件下離心(12000r/min，15min)得到上清裂解液。利用MDA試劑盒測定每組的MDA含量；測定結(jié)果見圖5B。由圖5A可見，1μM、3μM的膽固醇降低了ROS的水平(p<0.01，p<0.05)；由圖5B可見，1μM、3μM的膽固醇降低了MDA的產(chǎn)量(p<0.01，p<0.05)。表明膽固醇能提高酵母細(xì)胞的抗氧化性，從而降低氧自由基產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物。