一種用于植物甾醇側鏈降解反應的底物處理方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于植物甾醇側鏈降解反應的底物處理方法，屬于微生物制藥領域，本發(fā)明涉及的方法用于植物甾醇側鏈降解生成雄烯二酮(AD)反應中，投加植物甾醇進行轉化前預先將植物甾醇與凹土進行改性，根據(jù)底物投料量與凹土的添加量，控制植物甾醇與凹土的質量比為1:0.1～5，投入的共改性植物甾醇與凹土的濃度為1～40g/L。此方法能夠有效提高底物在水溶液中的分散度，提高底物的利用率和反應速率，并在一定程度上解除底物和產(chǎn)物抑制，提高產(chǎn)物的轉化率，且工藝簡單，經(jīng)濟實用，對環(huán)境污染危害小，對用生物轉化法生產(chǎn)甾體藥物有著非常重要的意義。
【專利說明】
一種用于植物甾醇側鏈降解反應的底物處理方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物制藥領域，尤其涉及到一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物 處理方法。
【背景技術】
[0002] 甾體激素類藥物是我國醫(yī)藥領域的重要門類，雄烯二酮(Andr〇Stenedi〇n，AD)是 甾體激素類藥物不可替代的中間體。我國是油料生產(chǎn)大國，油脂工業(yè)副產(chǎn)物中蘊藏著極為 豐富的植物甾醇資源。微生物選擇性降解植物甾醇(phytosterol，PS)側鏈生成AD，能替代 復雜的多步化學合成法，并減輕目前由于薯蕷皂素為原料造成的資源緊缺，對合理利用我 國甾體植物資源、推動制藥行業(yè)的發(fā)展有著重要意義。
[0003] 微生物選擇性降解植物留醇側鏈是在微生物細胞產(chǎn)生的留體轉化酶作用下進行 的，在植物留醇側鏈降解生成AD的過程中所遇到的最主要的問題是植物留醇具有很強的疏 水性，在水中的溶解度極低，易聚集在水相表面，這就使得底物與微生物細胞不能很好地接 觸，導致轉化率偏低及轉化時間延長等一系列問題。
[0004] 凹凸棒土又稱凹土(attapulgite，AT)，其獨特的鏈層狀晶體結構，賦予了AT許多 性質，主要包括吸附性、載體性、催化性、分散性和流變性等。用熱活化、酸化、堿化、有機改 性、混合法對原凹土進行改性可以使其疏松多孔，比表面積增加，吸附性能隨之提高，也使 其成為一種理想的載體，因而對其改性有較高的社會效益和經(jīng)濟效益。將底物植物留醇預 先和凹土一起進行改性，使植物留醇吸附負載到疏松多孔的凹土上，更好地隨凹土分散到 水溶液培養(yǎng)基中，使得底物與微生物細胞更好地接觸，進而提高反應的轉化率。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種用于植物留醇側鏈降解生成雄 烯二酮反應的底物處理方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案是：一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，投 加植物留醇進行反應前預先將植物留醇與凹土進行共改性形成共改性凹土-植物甾醇。
[0007] 優(yōu)選的，共改性凹土-植物留醇為酸共改性凹土-植物留醇、硅烷偶聯(lián)劑共改性凹 土-植物留醇、堿共改性凹土-植物留醇和表面活性劑共改性凹土-植物留醇中的一種。
[0008] 優(yōu)選的，共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的質量比為1:0.1~5。
[0009] 其中，酸共改性凹土-植物留醇的改性步驟為：將植物留醇和凹土按照質量比1: 0.1~5加入到酸溶液中，酸溶液為硫酸、鹽酸、硝酸或磷酸中的一種，超聲振蕩，離心水洗至 中性，干燥后研磨成細粉。
[0010] 其中，硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質 量比1:0.1~5加入到pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入硅烷偶聯(lián)劑，硅烷偶聯(lián)劑為3-氨基丙 基三乙氧基硅燒KH550，超聲振蕩，離心水洗至無硅烷偶聯(lián)劑，干燥后研磨成細粉。
[0011] 其中，堿共改性凹土-植物留醇的改性步驟為：將植物留醇和凹土按照質量比1: 0.1~5加入到堿溶液中，堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液，超聲振蕩，離心水洗至中 性，干燥后研磨成細粉。
[0012] 其中，表面活性劑共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質 量比1:0.1~5加入到表面活性劑改性溶液中，表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨，超聲 振蕩后，離心水洗至無表面活性劑，干燥后研磨成細粉。
[0013] 優(yōu)選的，共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的最適添加比例為1:1~ 3〇
[0014] -種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法在植物留醇側鏈降解反應中的 應用。
[0015]優(yōu)選的，共改性凹土-植物甾醇投入濃度為1~40g/L，共改性凹土-植物甾醇所投 入的植物留醇與凹土的質量比優(yōu)選為1:1~3，共改性凹土-植物留醇最適添加濃度為1.5~ 10g/L〇
[0016] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是:通過在投加植物留醇進行轉化前預先將植物甾 醇與凹土進行改性，能夠有效提高底物在水溶液中的分散度，使得底物與微生物細胞更好 地接觸，進而提高反應的轉化率。制備過程中無需加入有機溶劑，反應條件溫和，轉化裝置 簡單，原料來源充足，制備過程簡單，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境污染危害小;本發(fā)明方法提高了底 物轉化速率和轉化率，具有操作簡便，綠色環(huán)保，價格低廉的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 縮寫詞含義：
[0019] AT--凹土
[0020] PS--植物甾醇
[0021 ] AD--雄稀二酮（雄留 _4_ 稀-3，17-二酮，Androstenedione)
[0022]本發(fā)明涉及的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，投加植物留醇進 行反應前預先將植物留醇與凹土進行共改性形成共改性凹土-植物留醇，其中共改性方法 包括，酸共改性、硅烷偶聯(lián)劑共改性、堿共改性和表面活性劑共改性，所投入的共改性凹土-植物留醇濃度為1~40g/L，生成共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的質量比 為1:0.1~5,其中，凹土濃度為0.5~10g/L，植物留醇濃度為0.5~30g/L;生成共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的最適添加比例為1:1~3。
[0023] 1共改性凹土-植物甾醇的制備：
[0024] (1)酸共改性凹土-植物甾醇：將植物甾醇和凹土按照質量比1 : 0.1~5加入到 100mL的4mol/L的酸溶液中，其中植物留醇和凹土的總質量不超過5g，酸溶液為硫酸、鹽酸、 硝酸或磷酸中的一種，超聲振蕩30min，離心水洗至中性，60°C干燥8h，研磨成細粉。
[0025] (2)硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物留醇:將植物留醇和凹土按照質量比1:0.1~5加 入到100mL的pH 3.5的醋酸水溶液中，植物甾醇和凹土的總質量不超過5g，再加入0. lmL的 硅烷偶聯(lián)劑，硅烷偶聯(lián)劑為3-氨基丙基三乙氧基硅烷KH550,超聲振蕩30min，離心水洗至 無硅烷偶聯(lián)劑，60°C干燥8h，研磨成細粉。
[0026] (3)堿共改性凹土-植物甾醇：將植物甾醇和凹土按照質量比1 : 0.1~5加入到 100mL的4mol/L的堿溶液中，植物留醇和凹土的總質量不超過5g，堿溶液為氫氧化鈉溶液或 氫氧化鉀溶液，超聲振蕩30min，離心水洗至中性，60°C干燥8h，研磨成細粉。
[0027] (4)表面活性劑共改性凹土-植物留醇:將植物留醇和凹土按照質量比1:0.1~5加 入到加入到100mL含有0.01 g表面活性劑改性溶液中，植物留醇和凹土的總質量不超過5g， 表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨，超聲振蕩后，離心水洗至無表面活性劑，60°C干燥 8h，研磨成細粉。
[0028] 2共改性凹土-植物甾醇應用于植物甾醇側鏈降解反應：
[0029]將共改性凹土-植物留醇添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化。
[0030]其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖l〇g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵按0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0031] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0032] 添加共改性凹土-植物甾醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，共改性凹土-植物留醇1~ 40g/L，pH 7.2。
[0033] 為了驗證共改性凹土-植物留醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0034]對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS(添加量與共改性凹土-植物留醇發(fā) 酵體系中植物甾醇的含量相同），pH 7.2。
[0035] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測反應生成的雄烯二酮AD的摩爾生成率。
[0036] 實施例1:硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物甾醇
[0037] 1底物的改性處理：
[0038] 將lg植物甾醇PS和3g凹土AT加入至IjlOOmL醋酸溶液(pH3.5)中，再加入0. lmL 3-氨 基丙基三乙氧基硅烷KH550，超聲振蕩30min，5000r/min離心10min，去離子水洗至無 KH550， 60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物留醇KH550-AT-PS。
[0039] 2植物留醇側鏈降解反應
[0040]將硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物留醇KH550-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中 進行反應。
[0041] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖l〇g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0042] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0043] 添加共改性凹土-植物留醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物甾醇KH550-AT-PS4g/L，pH 7.2。
[0044] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0045]對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS lg/L，pH 7.2。
[0046] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0047] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0048]分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0049]用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0050] 如表1所示，72h后，添加 KH550-AT-PS的AD摩爾生成率為66.76 ± 1.41 %，是對照組 (13.01±0.41%)的5.13倍；12011后，添加1〇1550-厶1'-?5的厶0摩爾生成率為74.06±0.64%， 是對照組（25 · 87 ± 0 · 19 % )的2 · 86倍；168h后，添加 KH550-AT-PS的AD摩爾生成率為74 · 97 ± 0 · 35 %，是對照組（28 · 34 ± 0 · 04 % )的2 · 65倍。
[0051 ] 表1 AD摩爾生成率
[0052]
[0053]實施例2:用酸共改性凹土-植物甾醇 [0054] 1底物的改性處理：
[0055] 將lg植物甾醇PS和3g凹土AT加入到100mL的4mol/L的硫酸溶液中，超聲振蕩 30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為硫酸共 改性凹土-植物留醇H2S〇4-AT-PS。
[0056] 2植物留醇側鏈降解反應
[0057]將硫酸共改性凹土-植物甾醇出504-六1'-?5添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行反 應。
[0058]其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0059] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0060] 添加共改性凹土-植物留醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖l〇g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵 銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，硫酸共改性凹土-植物 甾醇H 2S〇4-AT-PS 4g/L，pH 7.2。
[0061] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0062]對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS lg/L，pH 7.2。
[0063] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0064] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0065]分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0066]用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0067] 如表2所示，72h后，添加 H2S〇4-AT-PS的AD摩爾生成率為50.77 ± 0.38 %，是對照組 (13.01±0.41%)的3.90倍；12011后，添加!12304-厶1'-?5的厶0摩爾生成率為59.34±0.83%，是 對照組（25 · 87 ± 0 · 19 % )的2 · 30倍；168h后，添加 H2S〇4-AT-PS的AD摩爾生成率為64 · 11 土 0 · 25 %，是對照組（28 · 34 ± 0 · 04 % )的2 · 26倍。
[0068] 表2 AD摩爾生成率
[0069]
[0070]實施例3:用酸共改性凹土-植物甾醇 [0071] 1底物的改性處理：
[0072] 將lg植物甾醇PS和5g凹土AT加入到100mL的4mol/L的鹽酸溶液中，超聲振蕩 30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為鹽酸共 改性凹土-植物留醇HC1-AT-PS。
[0073] 2植物留醇側鏈降解反應
[0074]將鹽酸共改性凹土-植物甾醇HC1-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化。 [0075]其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0076] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0077] 添加共改性凹土-植物甾醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，鹽酸共改性凹土-植物甾 醇HC1-AT-PS 6g/L，pH 7.2。
[0078] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0079]對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS lg/L，pH 7.2。
[0080] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0081 ] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0082]分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0083]用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0084] 如表3所示，72h后，添加 HC1-AT-PS的AD摩爾生成率為55.14 ±0.72 %，是對照組 (13.01±0.41%)的4.23倍；12011后，添加!1(：1-厶1'-?5的厶0摩爾生成率為63.79±0.84%，是 對照組（25.87 ± 0.19 % )的2.47倍；168h后，添加 HC1-AT-PS的AD摩爾生成率為66.32 土 0 · 61 %，是對照組（28 · 34 ± 0 · 04 % )的2 · 34倍。
[0085] 表3 AD摩爾生成率 [0086]
[0087]實施例4:用酸共改性凹土-植物甾醇 [0088] 1底物的改性處理：
[0089] 將3g植物甾醇PS和5g凹土AT加入到100mL的4mol/L的磷酸溶液中，超聲振蕩 30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為磷酸共 改性凹土-植物留醇H3P〇4-AT-PS。
[0090] 2植物留醇側鏈降解反應
[0091]將磷酸共改性凹土-植物甾醇H3P〇4-AT_PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行反 應。
[0092]其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0093] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0094] 添加共改性凹土-植物甾醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，磷酸共改性凹土-植物甾 醇H 3P〇4-AT-PS 8g/L，
[0095] pH 7.2〇
[0096] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0097] 對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS 3g/L，pH 7.2。
[0098] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0099] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0100]分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0101]用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0102] 如表4所示，72h后，添加 H3P〇4-AT-PS的AD摩爾生成率為45.32 ± 0.58 %，是對照組 (8.43 ± 0.41 % )的5.38倍；120h后，添加 H3P〇4-AT-PS的AD摩爾生成率為54.85 ± 0.17 %，是 對照組（12.94±0.19% )的4.24倍；168h后，添加 H3P〇4-AT-PS的AD摩爾生成率為59.17 土 1 · 12%，是對照組（15 · 97±0 · 04% )的3 · 71倍。
[0103] 表4 AD摩爾生成率
[0104]
[0106] 實施例5:用酸共改性凹土-植物甾醇
[0107] 1底物的改性處理：
[0108] 將5g植物甾醇PS和3g凹土AT加入到100mL的4mol/L的硝酸溶液中，超聲振蕩 30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60°C干燥8h，研磨成細粉，即為硝酸共 改性凹土-植物留醇HN0 3-AT-PS。
[0109] 2植物留醇側鏈降解反應
[0110] 將硝酸共改性凹土-植物甾醇HN03-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行反 應。
[0111] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0112] 分枝桿菌菌種接種量為7 % (v/v)。
[0113] 添加共改性凹土-植物留醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，硝酸共改性凹土-植物甾 醇H3PO4-AT-PS 8g/L，pH 7.2。
[0114] 為了驗證共改性凹土-植物留醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0115] 對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS 5g/L，pH 7.2。
[0116] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0117] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0118] 分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0119] 用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0120] 如表5所示，72h后，添加 HN03-AT-PS的AD摩爾生成率為23.07 ± 0.32 %，是對照組 (6.49 ±0.31 % )的3.55倍；120h后，添加 HN03-AT-PS的AD摩爾生成率為37.20 ± 1.42 %，是 對照組（10 · 29 ± 0 · 12% )的3 · 61倍；168h后，添加 HN03-AT-PS的AD摩爾生成率為39 · 08 土 1 ·52%，是對照組（15·07±0·15%)的2.59倍。
[0121] 表5 AD摩爾生成率
[0122]
[0124]實施例6:用堿共改性凹土-植物甾醇
[0125] 1底物的改性處理：
[0126] 將lg植物甾醇PS和5g凹土AT加入到100mL的4mol/L的氫氧化鈉溶液中，超聲振蕩 30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為氫氧化 鈉共改性凹土-植物留醇Na0H-AT-PS。
[0127] 2植物留醇側鏈降解反應
[0128] 將氫氧化鈉共改性凹土-植物留醇Na0H-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行 反應。
[0129] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0130] 分枝桿菌菌種接種量為7 % (v/v)。
[0131] 添加共改性凹土-植物留醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，氫氧化鈉共改性凹土-植 物甾醇NaOH-AT-PS 6g/L，pH 7.2。
[0132] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0133] 對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS lg/L，pH 7.2。
[0134] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0135] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0136] 分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0137] 用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0138] 如表6所示，72h后，添加 NaOH-AT-PS的AD摩爾生成率為50.45 ± 0.25 %，是對照組 (13.01±0.41%)的3.88倍；12011后，添加似0!1-厶1'-?5的厶0摩爾生成率為57.22±0.47%，是 對照組（25.87 ± 0.19% )的2.21倍；168h后，添加 NaOH-AT-PS的AD摩爾生成率為60.31 土 0 · 94 %，是對照組（28 · 34 ± 0 · 04 % )的2 · 13倍。
[0139] 表6 AD摩爾生成率
[0140]
[0142]實施例7:用堿共改性凹土-植物甾醇
[0143] 1底物的改性處理：
[0144] 將2g PS和3g AT加入到100mL的4mol/L的氫氧化鉀溶液中，超聲振蕩30min， 5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60 °C干燥8h，研磨成細粉，即為氫氧化鉀共改 性凹土-植物甾醇K0H-AT-PS。
[0145] 2植物留醇側鏈降解反應
[0146] 將氫氧化鉀共改性凹土-植物留醇K0H-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行 反應。
[0147] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0148] 分枝桿菌菌種接種量為7% (v/v)。
[0149] 添加共改性凹土-植物留醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，氫氧化鉀共改性凹土-植 物甾醇KOH-AT-PS 5g/L，pH 7.2。
[0150] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0151] 對照組發(fā)酵體系為：葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS 2g/L，pH 7.2。
[0152] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0153] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0154] 分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0155] 用lmL的乙酸乙酯超聲萃取發(fā)酵液0.5h，離心（12000Xg，2min)，取乙酸乙酯相 0· lmL于1.5mL eppendorf管中，自然風干后加 lmL的流動相，離心（12000Xg，2min)后進行 HPLC分析。色譜條件:Phenomenex C18柱，流動相為甲醇:水(4:1)，流速為lmL/min，柱溫為 30°C，檢測波長為254nm。
[0156] 如表7所示，72h后，添加 KOH-AT-PS的AD摩爾生成率為47.22 ±0.34%，是對照組 (10.05 ±0.41 % )的4.70倍；120h后，添加 K0H-AT-PS的AD摩爾生成率為53.09 ± 0.53 %，是 對照組（14.77 ± 0.19 % )的3.60倍；168h后，添加 K0H-AT-PS的AD摩爾生成率為57.83 土 0 · 64 %，是對照組（20 · 22 ± 0 · 24 % )的2 · 86倍。
[0157] 表7 AD摩爾生成率
[0158]
[0159] 實施例8:用表面活性劑共改性凹土-植物甾醇
[0160] 1底物的改性處理：
[0161] 將2g PS和lg AT加入到100mL含有O.Olg表面活性劑改性溶液中（十六烷基三甲基 溴化銨)溶液中，超聲振蕩30min，5000r/min離心10min，用去離子水洗至中性，60°C干燥8h， 研磨成細粉，即為表面活性劑共改性凹土-植物留醇CTAB-AT-PS。
[0162] 2植物留醇側鏈降解反應
[0163] 將表面活性劑共改性凹土-植物留醇CTAB-AT-PS添加到分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進 行反應。
[0164] 其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂 0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，pH 7.2。
[0165] 分枝桿菌菌種接種量為7 % (v/v)。
[0166] 添加共改性凹土-植物甾醇的發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨 0.05g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，表面活性劑共改性凹土-植物甾醇CTAB-AT-PS3g/L，pH 7.2。
[0167] 為了驗證共改性凹土-植物甾醇對制備雄烯二酮AD的促進效果，同時設立對照組 實驗：
[0168] 對照組發(fā)酵體系為:葡萄糖10g/L，檸檬酸2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，硫酸鎂0.5g/ L，磷酸氫二鉀0.5g/L，磷酸氫二銨3.5g/L，植物留醇PS 2g/L，pH 7.2。
[0169] 將兩組發(fā)酵體系一起放置于29°C環(huán)境下，140r/min振蕩培養(yǎng)168h得到兩組發(fā)酵 液。
[0170] 3AD摩爾生成率比對結果：
[0171] 分別取兩組發(fā)酵液，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。
[0172] 72h后，添加 CTAB-AT-PS的AD摩爾生成率為40.77 ± 0.12 %，是對照組（10.05 土 0.41 % )的4.06倍；120h后，添加 CTAB-AT-PS的AD摩爾生成率為48.69 ± 1.97 %，是對照組 (14.77±0.19%)的3.29倍；16811后，添加(7^8-厶1'-?5的厶0摩爾生成率為53.84±0.72%，是 對照組（20 · 22 ± 0 · 24 % )的2 · 66倍。
[0173] 表1 AD摩爾生成率
[0174]
[0175] 以上對本發(fā)明的部分實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施 例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進 等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在于：投加植物留醇進行 反應前預先將植物留醇與凹土進行共改性形成共改性凹土-植物甾醇。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述共改性凹土-植物留醇為酸共改性凹土-植物留醇、硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物甾 醇、堿共改性凹土-植物留醇和表面活性劑共改性凹土-植物留醇中的一種。3. 根據(jù)權利要求2所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的質量比為1:0.1~5。4. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述酸共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質量比1: 〇. 1~5加 入到酸溶液中，所述酸溶液為硫酸、鹽酸、硝酸或磷酸中的一種，超聲振蕩，離心水洗至中 性，干燥后研磨成細粉。5. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述硅烷偶聯(lián)劑共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質量比1: 0.1~5加入到pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入硅烷偶聯(lián)劑，所述硅烷偶聯(lián)劑為3-氨基丙基 三乙氧基硅燒KH550，超聲振蕩，離心水洗至無硅烷偶聯(lián)劑，干燥后研磨成細粉。6. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述堿共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質量比1: 〇. 1~5加 入到堿溶液中，所述堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液，超聲振蕩，離心水洗至中性， 干燥后研磨成細粉。7. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法，其特征在 于:所述表面活性劑共改性凹土-植物留醇的改性步驟為:將植物留醇和凹土按照質量比1: 0.1~5加入到表面活性劑改性溶液中，所述表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨，超聲振 蕩后，離心水洗至無表面活性劑，干燥后研磨成細粉。8. 根據(jù)權利要求4-7中任一所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法， 其特征在于:所述共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的最適添加比例為1:1~ 3〇9. 利用權利要求1-7中任意所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法在 植物留醇側鏈降解反應中的應用。10. 根據(jù)權利要求9所述的一種用于植物留醇側鏈降解反應的底物處理方法在植物甾 醇側鏈降解反應中的應用，其特征在于:所述共改性凹土-植物留醇投入濃度為1~40g/L， 所述共改性凹土-植物留醇所投入的植物留醇與凹土的質量比優(yōu)選為1:1~3,所述共改性 凹土-植物留醇最適添加濃度為1.5~10g/L。
【文檔編號】C12P33/16GK105907828SQ201610270775
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】申雁冰, 王敏, 劉晶晶, 湯睿, 駱健美, 鄭宇
【申請人】天津科技大學