本發(fā)明涉及光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放,具體涉及基于谷胱甘肽、光刺激的抗腫瘤藥物苯丁酸氮芥和熒光雙釋放體系的設(shè)計與應(yīng)用。
背景技術(shù):
光作為一種“取之不盡,用之不竭”的外界刺激因素,無需依賴機體內(nèi)部生理環(huán)境的變化,能夠在特定的時間和空間控制光敏感類前藥釋放出活性藥物,是藥物釋放領(lǐng)域最受青睞的刺激手段之一。近年來,制備光敏感前藥的報道越來越多,其中香豆素類光敏基團具有易合成、易修飾、易檢測、光解速度快和明確的光解機理等優(yōu)勢,得到了廣泛的應(yīng)用。氮芥類藥物是應(yīng)用于臨床的一類廣譜性抗腫瘤藥物,對癌細胞的殺滅能力較強,但由于其本身藥代動力學性質(zhì)(毒副作用大、半衰期短、選擇性差、治療效率低等)的局限,使得它在抗腫瘤的臨床應(yīng)用上受到限制。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了克服上述缺陷,本論文以香豆素為母核,針對腫瘤細胞中過量表達的谷胱甘肽(gsh),利用其特有的反應(yīng)性能,設(shè)計光敏感部位的“開-關(guān)”,并合成了具有靶向性的光敏感氮芥類衍生物,實現(xiàn)了抗腫瘤藥物釋放和熒光示蹤的雙重目的。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種式(cm-2)所示的化合物:
本發(fā)明還提供一種如式(cm-2)所示的化合物的制備方法,包括以下步驟:
將式(2-3)所示化合物溶解于dcm中,依次加入dmap,dcc,活化1-30min后得混合物,將苯丁酸氮芥溶于dcm中,再加入上述混合物中,反應(yīng)1~48小時,反應(yīng)全程在惰性氣體保護下進行,反應(yīng)液經(jīng)分離純化,得到式(cm-2)所示的化合物;
進一步,本發(fā)明所述式(2-3)所示化合物、dmap、dcc與苯丁酸氮芥物質(zhì)的量之比為1:0.2-2:1-2:1-2,優(yōu)選為1:1:1.2:1.2。
進一步,本發(fā)明所述dcm總體積用量推薦以式(2-3)所示化合物物質(zhì)的量計為10~50ml/mmol。
進一步,本發(fā)明所述分離純化方法為:反應(yīng)液加入dcm后用水洗滌,取有機相飽和氯化鈉洗滌,無水硫酸鈉干燥,過濾,旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物,經(jīng)薄層層析分離,所用展開劑為dcm/meoh=15:1或dcm/meoh=12:1,收集目標組分,干燥,獲得式(cm-2)所示的化合物。
此外,本發(fā)明還提供一種式(cm-2)所示的化合物在制備響應(yīng)谷胱甘肽殺滅腫瘤細胞的光敏感靶向抗腫瘤前藥中的應(yīng)用。
進一步,所述腫瘤細胞優(yōu)選為子宮頸癌細胞hela、hepg2、mfc-7、f9或te-1細胞。
進一步,所述谷胱甘肽推薦以水溶液形式存在,濃度為1~10μmol/l。
更進一步,所述谷胱甘肽優(yōu)選為腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽。
本發(fā)明所述dcm為二氯甲烷;dmap為4-二甲氨基吡啶;dcc為二環(huán)己基碳二亞胺。
本發(fā)明的反應(yīng)路線如下:
本發(fā)明所述化合物(cm-2)可作為熒光監(jiān)測光敏感靶向抗腫瘤前藥,應(yīng)用于腫瘤細胞藥物釋放時的熒光監(jiān)測。所述的谷胱甘肽濃度的熒光檢測的方法為:以化合物(cm-2)作為熒光探針,與pbs緩沖溶液中的谷胱甘肽進行反應(yīng),產(chǎn)生熒光,測定在激發(fā)為365nm下的熒光強度變化,從而獲得谷胱甘肽濃度。
其次,以化合物(cm-2)作為熒光探針,與hela細胞進行孵化,然后加入外源谷胱甘肽進行熒光成像。
此外,本發(fā)明還制備了以下化合物k以進一步驗證前藥cm-2的選擇性及抗腫瘤活性。
本發(fā)明所述化合物(cm-2)可作為光敏感靶向抗腫瘤前藥,應(yīng)用于光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放。所述的藥物釋放過程的檢測方法為:以化合物(cm-2)作為光敏感靶向抗腫瘤前藥,與pbs緩沖溶液中的谷胱甘肽進行反應(yīng),隨后對反應(yīng)液進行uv光照,取不同時段反應(yīng)液進行高效液相色譜分析,從而獲得藥物釋放過程。
其次,針對腫瘤細胞hela,hepg2給不同濃度前藥cm-2光照前后的細胞活性評價采用一種標準的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)方法。
本發(fā)明基于香豆素光敏感的特性,成功設(shè)計合成了谷胱甘肽激活的光刺激苯丁酸氮芥前藥的釋放體系,改善了藥物苯丁酸氮芥的不良藥代動力學。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)的核磁氫譜。
圖2為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入gsh、cys、hcy水溶液的熒光光譜。
圖3為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下的熒光強度與谷胱甘肽濃度之間的關(guān)系。
圖4為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下與谷胱甘肽反應(yīng)的熒光強度與隨時間變化的關(guān)系
圖5為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入谷胱甘肽和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。
a圖(1.gly,2.ala,3.ser,4.gln,5.thr,6.val,7.leu,8.ile,9.met,10.phe,11.trp,12.asp,13.asn,14,glu,15.hcy,16.cys,17.gsh);b圖(1.zn(ii),2.na(i),3.mg(ii),4.k(i),4.fe(iii),5.fe(ii),6.cu(ii),7.ca(ii),8.pb(ii),9.pb(0),10.gsh)
圖6為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下和谷胱甘肽反應(yīng)之后,在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜圖。
圖中,cm-1u為:
圖7為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下經(jīng)谷胱甘肽處理之后分別在光照和暗場下的藥物釋放情況。
圖8為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)的抗hela和hepg2細胞增殖活性。
圖9為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在子宮頸癌細胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
實施例1前藥(cm-2)的合成
將化合物2-3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中,完全溶解后,加入1.5當量dmap,2.5當量dcc,活化10min后,將2.2當量苯丁酸氮芥溶于5mldcm注入瓶中,反應(yīng)過夜。向瓶中加入50mldcm,并水洗(3×30ml),飽和氯化鈉洗(2×30ml),無水硫酸鈉干燥,過濾,旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物,經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物cm-2,所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)=15:1,收率83%。核磁氫譜見圖1。
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.85(d,j=8.1hz,3h),7.42(dd,j=16.4,8.4hz,6h),7.08(d,j=8.7hz,4h),6.97–6.88(m,4h),6.68–6.60(m,4h),6.33(s,2h),5.25(d,j=1.2hz,4h),5.16(d,j=3.6hz,4h),3.71(t,j=6.9hz,8h),3.63(dd,j=10.6,3.9hz,8h),2.60(t,j=7.5hz,4h),2.47(t,j=7.5hz,4h),2.02–1.89(m,5h),1.36(s,22h).
實施例1前藥(cm-2)的合成
將化合物2-3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中,完全溶解后,加入0.1當量dmap,1當量dcc,活化10min后,將1當量苯丁酸氮芥溶于5mldcm注入瓶中,反應(yīng)過夜。向瓶中加入50mldcm,并水洗(3×30ml),飽和氯化鈉洗(2×30ml),無水硫酸鈉干燥,過濾,旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物,經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物cm-2,所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)=15:1,收率65%。
實施例3對照化合物k的合成
將化合物3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中,完全溶解后,加入0.2當量dmap,1.2當量dcc,活化30分鐘,將1.2當量的苯丁酸氮芥溶于10mldcm注入瓶中,反應(yīng)24小時。向瓶中加入50mldcm,水洗(3×30ml),飽和氯化鈉洗(2×30ml),無水硫酸鈉干燥,過濾,旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物,經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物k,所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)=15:1-3,收率51%。
實施例4實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入0mm和100μm谷胱甘肽水溶液濃度的熒光光譜檢測。
將含有5μm前藥(cm-2)的pbs緩沖液中,分別加入谷胱甘肽(gsh)gsh、半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy),在37℃水浴搖床反應(yīng),與此同時,將含有前藥(cm-2),h2o2的pbs溶液作為對照組,實驗設(shè)置三組平行。酶標儀檢測其熒光強度,如圖2從熒光譜圖中我們可以發(fā)現(xiàn),相比較于cys和hcy,gsh對化合物前藥(cm-2)具有更好的選擇性。
實施例5實施例2制得的對照樣品k在ph為7.4條件下加入100μm谷胱甘肽水溶液濃度的熒光光譜檢測。
將含有5μm化合物k的pbs緩沖液中,分別加入谷胱甘肽(gsh)gsh、半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy),在37℃水浴搖床反應(yīng),與此同時,將含有前藥(cm-2),h2o2的pbs溶液作為對照組,實驗設(shè)置三組平行。經(jīng)酶標儀檢測,并沒有出現(xiàn)熒光強度增強的現(xiàn)象,從而證明前藥cm-2對gsh具有極高的選擇性。
實施例6實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下的熒光強度與谷胱甘肽濃度之間的關(guān)系檢測。
將化合物(cm-2)與不同濃度的谷胱甘肽在水浴搖床下反應(yīng),通過酶標儀檢測熒光強度變化。與此同時,將等量的超純水與化合物(cm-2)在同等條件下反應(yīng),作為空白對照組。從圖3中可以看出,當谷胱甘肽濃度在0-100μm的范圍內(nèi)時,(cm-2)在460nm處的熒光強度隨谷胱甘肽濃度的增加而增強;當gsh濃度為100μm時,熒光強度達到最大。
實施例7實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下與谷胱甘肽反應(yīng)的熒光強度與隨時間變化的關(guān)系檢測。
將加入了前藥(cm-2)及gsh的pbs緩沖液,實驗設(shè)置三組平行,置于水浴搖床中,反應(yīng)不同時間,酶標儀檢測熒光強度變化(圖4);與此同時,將化合物前藥(cm-2)及等量超純水加入到pbs緩沖液中,作為對照組。將從圖中可以看出,在0-10min范圍內(nèi),前藥(cm-2)在460nm處的熒光強度隨時間的增加不斷增高,在20min時熒光值達到最大。
實施例8實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入谷胱甘肽和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。
將前藥(cm-2)和不同氨基酸、金屬離子反應(yīng),實驗設(shè)置三組平行。通過酶標儀檢測其波長為460nm時的熒光強度,從圖5中可以發(fā)現(xiàn),化合物前藥(cm-2)對gsh具有優(yōu)異的專一性,反應(yīng)之后熒光強度有著較強的變化,除了cys和hcy會發(fā)生一定的作用外,其它氨基酸以及金屬離子并不會誘導產(chǎn)生熒光。
實施例9實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下和谷胱甘肽反應(yīng)之后,在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜檢測。
將化合物(cm-2)和谷胱甘肽加入到pbs緩沖液中(ph=7.4),37℃水浴搖床中反應(yīng),取樣進行高效液相色譜分析。然后將反應(yīng)液置于紫外光照射條件下繼續(xù)反應(yīng),每隔兩分鐘分別取樣進行,進行高效液相色譜分析,結(jié)果如圖6所示。
實施例10實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下經(jīng)谷胱甘肽處理之后分別在光照和暗場下的藥物釋放情況。
將反應(yīng)液置于光照條件下反應(yīng)5min,取樣,進行高效液相色譜檢測,然后將反應(yīng)液置于暗場中反應(yīng)5min,取樣,進行高效液相色譜檢測,如此交替進行60min。通過計算峰面積比值變化,計算藥物釋放率如圖7,結(jié)果表明,被谷胱甘肽激活的抗腫瘤前藥(cm-2)只有在光照條件下才能分解釋放活性藥物。
實施例11實施例1制得的前藥(cm-2)的抗hela和hepg2細胞增殖活性
對化合物前藥(cm-2),利用mtt法選用人宮頸癌細胞hela、人肝癌細胞hepg2、對其進行體外抗腫瘤細胞活性檢測研究其抗腫瘤作用。如上述圖8所示,其中,“(cell+uv)+chlorambucil”表示細胞先被uv照射一段時間之后再加入苯丁酸氮芥,然后孵育24小時?!?cell+uv)+cm-2”表示細胞先uv照射15min后加入化合物cm-2,然后孵育24h。“(cell+cm-2)+uv”表示細胞先加入化合物cm-2孵育12小時后,進行光照15min,之后再次孵育12h。每組設(shè)置三個平行,通過實驗組與空白對照組吸光度的比值,計算出藥物對腫瘤細胞存活率的影響。從圖8中可以明顯看出:苯丁酸氮芥對腫瘤細胞的殺滅能力明顯較小,原因是藥物濃度較低,無法對腫瘤細胞造成有效的殺滅濃度。而對于化合物cm-2而言,細胞存活率無明顯變化,說明化合物cm-2對細胞無明顯毒性,但是,當化合物cm-2在細胞中孵育一段時間后,再給予其光照,然后在孵育一段時間后,產(chǎn)生了對腫瘤細胞明顯的毒性,藥物濃度在5μm時細胞存活率低于50%,說明經(jīng)修飾后的抗腫瘤前藥cm-2較苯丁酸氮芥有了靶向性,并且發(fā)揮藥效達到殺滅腫瘤細胞的目的。
實施例12前藥(cm-2)在子宮頸癌細胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。
由于在谷胱甘肽作用及光照后所釋放的香豆素為強熒光染料,我們嘗試通過共聚焦顯微鏡觀察藥物在腫瘤細胞內(nèi)的分布情況,實驗結(jié)果如圖9所示。其中,圖a為未經(jīng)處理的對照組,圖b為加藥孵育12h后的共聚焦細胞成像圖,圖c為加藥孵育12h之后,谷胱甘肽處理30min。由圖可以看出,化合物可以被細胞攝取,并且可通過此時的細胞形態(tài)來判斷是否釋放苯丁酸氮芥。
實驗證明,在谷胱甘肽濃度提高的情況下,我們能夠看到細胞中的熒光信號也在變強。說明我們的物質(zhì)能夠響應(yīng)細胞內(nèi)的谷胱甘肽。