本發(fā)明涉及光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放，具體涉及基于谷胱甘肽、光刺激的抗腫瘤藥物苯丁酸氮芥和熒光雙釋放體系的設(shè)計與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光作為一種“取之不盡，用之不竭”的外界刺激因素，無需依賴機體內(nèi)部生理環(huán)境的變化，能夠在特定的時間和空間控制光敏感類前藥釋放出活性藥物，是藥物釋放領(lǐng)域最受青睞的刺激手段之一。近年來，制備光敏感前藥的報道越來越多，其中香豆素類光敏基團具有易合成、易修飾、易檢測、光解速度快和明確的光解機理等優(yōu)勢，得到了廣泛的應(yīng)用。氮芥類藥物是應(yīng)用于臨床的一類廣譜性抗腫瘤藥物，對癌細胞的殺滅能力較強，但由于其本身藥代動力學性質(zhì)(毒副作用大、半衰期短、選擇性差、治療效率低等)的局限，使得它在抗腫瘤的臨床應(yīng)用上受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述缺陷，本論文以香豆素為母核，針對腫瘤細胞中過量表達的谷胱甘肽(gsh)，利用其特有的反應(yīng)性能，設(shè)計光敏感部位的“開-關(guān)”，并合成了具有靶向性的光敏感氮芥類衍生物，實現(xiàn)了抗腫瘤藥物釋放和熒光示蹤的雙重目的。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種式(cm-2)所示的化合物：

本發(fā)明還提供一種如式(cm-2)所示的化合物的制備方法，包括以下步驟：

將式(2-3)所示化合物溶解于dcm中，依次加入dmap，dcc，活化1-30min后得混合物，將苯丁酸氮芥溶于dcm中，再加入上述混合物中，反應(yīng)1～48小時，反應(yīng)全程在惰性氣體保護下進行，反應(yīng)液經(jīng)分離純化，得到式(cm-2)所示的化合物；

進一步，本發(fā)明所述式(2-3)所示化合物、dmap、dcc與苯丁酸氮芥物質(zhì)的量之比為1:0.2-2:1-2:1-2，優(yōu)選為1:1:1.2:1.2。

進一步，本發(fā)明所述dcm總體積用量推薦以式(2-3)所示化合物物質(zhì)的量計為10～50ml/mmol。

進一步，本發(fā)明所述分離純化方法為：反應(yīng)液加入dcm后用水洗滌，取有機相飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離，所用展開劑為dcm/meoh＝15:1或dcm/meoh＝12:1，收集目標組分，干燥，獲得式(cm-2)所示的化合物。

此外，本發(fā)明還提供一種式(cm-2)所示的化合物在制備響應(yīng)谷胱甘肽殺滅腫瘤細胞的光敏感靶向抗腫瘤前藥中的應(yīng)用。

進一步，所述腫瘤細胞優(yōu)選為子宮頸癌細胞hela、hepg2、mfc-7、f9或te-1細胞。

進一步，所述谷胱甘肽推薦以水溶液形式存在，濃度為1～10μmol/l。

更進一步，所述谷胱甘肽優(yōu)選為腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽。

本發(fā)明所述dcm為二氯甲烷；dmap為4-二甲氨基吡啶；dcc為二環(huán)己基碳二亞胺。

本發(fā)明的反應(yīng)路線如下：

本發(fā)明所述化合物(cm-2)可作為熒光監(jiān)測光敏感靶向抗腫瘤前藥，應(yīng)用于腫瘤細胞藥物釋放時的熒光監(jiān)測。所述的谷胱甘肽濃度的熒光檢測的方法為：以化合物(cm-2)作為熒光探針，與pbs緩沖溶液中的谷胱甘肽進行反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，測定在激發(fā)為365nm下的熒光強度變化，從而獲得谷胱甘肽濃度。

其次，以化合物(cm-2)作為熒光探針，與hela細胞進行孵化，然后加入外源谷胱甘肽進行熒光成像。

此外，本發(fā)明還制備了以下化合物k以進一步驗證前藥cm-2的選擇性及抗腫瘤活性。

本發(fā)明所述化合物(cm-2)可作為光敏感靶向抗腫瘤前藥，應(yīng)用于光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放。所述的藥物釋放過程的檢測方法為：以化合物(cm-2)作為光敏感靶向抗腫瘤前藥，與pbs緩沖溶液中的谷胱甘肽進行反應(yīng)，隨后對反應(yīng)液進行uv光照，取不同時段反應(yīng)液進行高效液相色譜分析，從而獲得藥物釋放過程。

其次，針對腫瘤細胞hela，hepg2給不同濃度前藥cm-2光照前后的細胞活性評價采用一種標準的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)方法。

本發(fā)明基于香豆素光敏感的特性，成功設(shè)計合成了谷胱甘肽激活的光刺激苯丁酸氮芥前藥的釋放體系，改善了藥物苯丁酸氮芥的不良藥代動力學。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)的核磁氫譜。

圖2為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入gsh、cys、hcy水溶液的熒光光譜。

圖3為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下的熒光強度與谷胱甘肽濃度之間的關(guān)系。

圖4為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下與谷胱甘肽反應(yīng)的熒光強度與隨時間變化的關(guān)系

圖5為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入谷胱甘肽和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。

a圖(1.gly,2.ala,3.ser,4.gln,5.thr,6.val,7.leu,8.ile,9.met,10.phe,11.trp,12.asp,13.asn,14,glu,15.hcy,16.cys,17.gsh)；b圖(1.zn(ii),2.na(i),3.mg(ii),4.k(i),4.fe(iii),5.fe(ii),6.cu(ii),7.ca(ii),8.pb(ii),9.pb(0),10.gsh)

圖6為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下和谷胱甘肽反應(yīng)之后，在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜圖。

圖中，cm-1u為：

圖7為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下經(jīng)谷胱甘肽處理之后分別在光照和暗場下的藥物釋放情況。

圖8為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)的抗hela和hepg2細胞增殖活性。

圖9為本發(fā)明實施例1制得的前藥(cm-2)在子宮頸癌細胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1前藥(cm-2)的合成

將化合物2-3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中，完全溶解后，加入1.5當量dmap，2.5當量dcc，活化10min后，將2.2當量苯丁酸氮芥溶于5mldcm注入瓶中，反應(yīng)過夜。向瓶中加入50mldcm,并水洗(3×30ml)，飽和氯化鈉洗(2×30ml)，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物cm-2，所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率83％。核磁氫譜見圖1。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.85(d,j＝8.1hz,3h),7.42(dd,j＝16.4,8.4hz,6h),7.08(d,j＝8.7hz,4h),6.97–6.88(m,4h),6.68–6.60(m,4h),6.33(s,2h),5.25(d,j＝1.2hz,4h),5.16(d,j＝3.6hz,4h),3.71(t,j＝6.9hz,8h),3.63(dd,j＝10.6,3.9hz,8h),2.60(t,j＝7.5hz,4h),2.47(t,j＝7.5hz,4h),2.02–1.89(m,5h),1.36(s,22h).

實施例1前藥(cm-2)的合成

將化合物2-3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中，完全溶解后，加入0.1當量dmap，1當量dcc，活化10min后，將1當量苯丁酸氮芥溶于5mldcm注入瓶中，反應(yīng)過夜。向瓶中加入50mldcm,并水洗(3×30ml)，飽和氯化鈉洗(2×30ml)，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物cm-2，所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率65％。

實施例3對照化合物k的合成

將化合物3(100mg)投入到含有30mldcm的三口燒瓶中，完全溶解后，加入0.2當量dmap，1.2當量dcc，活化30分鐘，將1.2當量的苯丁酸氮芥溶于10mldcm注入瓶中，反應(yīng)24小時。向瓶中加入50mldcm，水洗(3×30ml)，飽和氯化鈉洗(2×30ml)，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸除去有機溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物純的產(chǎn)物k，所用展開劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1-3，收率51％。

實施例4實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入0mm和100μm谷胱甘肽水溶液濃度的熒光光譜檢測。

將含有5μm前藥(cm-2)的pbs緩沖液中，分別加入谷胱甘肽(gsh)gsh、半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)，在37℃水浴搖床反應(yīng)，與此同時，將含有前藥(cm-2)，h2o2的pbs溶液作為對照組，實驗設(shè)置三組平行。酶標儀檢測其熒光強度，如圖2從熒光譜圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，相比較于cys和hcy，gsh對化合物前藥(cm-2)具有更好的選擇性。

實施例5實施例2制得的對照樣品k在ph為7.4條件下加入100μm谷胱甘肽水溶液濃度的熒光光譜檢測。

將含有5μm化合物k的pbs緩沖液中，分別加入谷胱甘肽(gsh)gsh、半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)，在37℃水浴搖床反應(yīng)，與此同時，將含有前藥(cm-2)，h2o2的pbs溶液作為對照組，實驗設(shè)置三組平行。經(jīng)酶標儀檢測，并沒有出現(xiàn)熒光強度增強的現(xiàn)象，從而證明前藥cm-2對gsh具有極高的選擇性。

實施例6實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下的熒光強度與谷胱甘肽濃度之間的關(guān)系檢測。

將化合物(cm-2)與不同濃度的谷胱甘肽在水浴搖床下反應(yīng)，通過酶標儀檢測熒光強度變化。與此同時，將等量的超純水與化合物(cm-2)在同等條件下反應(yīng)，作為空白對照組。從圖3中可以看出，當谷胱甘肽濃度在0-100μm的范圍內(nèi)時，(cm-2)在460nm處的熒光強度隨谷胱甘肽濃度的增加而增強；當gsh濃度為100μm時，熒光強度達到最大。

實施例7實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下與谷胱甘肽反應(yīng)的熒光強度與隨時間變化的關(guān)系檢測。

將加入了前藥(cm-2)及gsh的pbs緩沖液，實驗設(shè)置三組平行，置于水浴搖床中，反應(yīng)不同時間，酶標儀檢測熒光強度變化(圖4)；與此同時，將化合物前藥(cm-2)及等量超純水加入到pbs緩沖液中，作為對照組。將從圖中可以看出，在0-10min范圍內(nèi)，前藥(cm-2)在460nm處的熒光強度隨時間的增加不斷增高，在20min時熒光值達到最大。

實施例8實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下加入谷胱甘肽和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。

將前藥(cm-2)和不同氨基酸、金屬離子反應(yīng)，實驗設(shè)置三組平行。通過酶標儀檢測其波長為460nm時的熒光強度，從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，化合物前藥(cm-2)對gsh具有優(yōu)異的專一性，反應(yīng)之后熒光強度有著較強的變化，除了cys和hcy會發(fā)生一定的作用外，其它氨基酸以及金屬離子并不會誘導產(chǎn)生熒光。

實施例9實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下和谷胱甘肽反應(yīng)之后，在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜檢測。

將化合物(cm-2)和谷胱甘肽加入到pbs緩沖液中(ph＝7.4)，37℃水浴搖床中反應(yīng)，取樣進行高效液相色譜分析。然后將反應(yīng)液置于紫外光照射條件下繼續(xù)反應(yīng)，每隔兩分鐘分別取樣進行，進行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖6所示。

實施例10實施例1制得的前藥(cm-2)在ph為7.4條件下經(jīng)谷胱甘肽處理之后分別在光照和暗場下的藥物釋放情況。

將反應(yīng)液置于光照條件下反應(yīng)5min，取樣，進行高效液相色譜檢測，然后將反應(yīng)液置于暗場中反應(yīng)5min，取樣，進行高效液相色譜檢測，如此交替進行60min。通過計算峰面積比值變化，計算藥物釋放率如圖7，結(jié)果表明，被谷胱甘肽激活的抗腫瘤前藥(cm-2)只有在光照條件下才能分解釋放活性藥物。

實施例11實施例1制得的前藥(cm-2)的抗hela和hepg2細胞增殖活性

對化合物前藥(cm-2)，利用mtt法選用人宮頸癌細胞hela、人肝癌細胞hepg2、對其進行體外抗腫瘤細胞活性檢測研究其抗腫瘤作用。如上述圖8所示，其中，“(cell+uv)+chlorambucil”表示細胞先被uv照射一段時間之后再加入苯丁酸氮芥，然后孵育24小時?！?cell+uv)+cm-2”表示細胞先uv照射15min后加入化合物cm-2，然后孵育24h。“(cell+cm-2)+uv”表示細胞先加入化合物cm-2孵育12小時后，進行光照15min，之后再次孵育12h。每組設(shè)置三個平行，通過實驗組與空白對照組吸光度的比值，計算出藥物對腫瘤細胞存活率的影響。從圖8中可以明顯看出：苯丁酸氮芥對腫瘤細胞的殺滅能力明顯較小，原因是藥物濃度較低，無法對腫瘤細胞造成有效的殺滅濃度。而對于化合物cm-2而言，細胞存活率無明顯變化，說明化合物cm-2對細胞無明顯毒性，但是，當化合物cm-2在細胞中孵育一段時間后，再給予其光照，然后在孵育一段時間后，產(chǎn)生了對腫瘤細胞明顯的毒性，藥物濃度在5μm時細胞存活率低于50％，說明經(jīng)修飾后的抗腫瘤前藥cm-2較苯丁酸氮芥有了靶向性，并且發(fā)揮藥效達到殺滅腫瘤細胞的目的。

實施例12前藥(cm-2)在子宮頸癌細胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。

由于在谷胱甘肽作用及光照后所釋放的香豆素為強熒光染料，我們嘗試通過共聚焦顯微鏡觀察藥物在腫瘤細胞內(nèi)的分布情況，實驗結(jié)果如圖9所示。其中，圖a為未經(jīng)處理的對照組，圖b為加藥孵育12h后的共聚焦細胞成像圖，圖c為加藥孵育12h之后，谷胱甘肽處理30min。由圖可以看出，化合物可以被細胞攝取，并且可通過此時的細胞形態(tài)來判斷是否釋放苯丁酸氮芥。

實驗證明，在谷胱甘肽濃度提高的情況下，我們能夠看到細胞中的熒光信號也在變強。說明我們的物質(zhì)能夠響應(yīng)細胞內(nèi)的谷胱甘肽。