一種將多肽或蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)至微球上的偶聯(lián)方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01310236062. 8申請日為2013年06月17日發(fā)明名稱為"一 種將含氨基的分子共價偶聯(lián)至微球上的偶聯(lián)方法"的中國專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生化和臨床檢驗領(lǐng)域。具體而言,本發(fā)明涉及一種共價偶聯(lián)方法。更 具體而言,涉及一種將含氨基的分子共價偶聯(lián)到微球上的偶聯(lián)方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在傳統(tǒng)免疫比濁法當(dāng)中,如果樣本中待檢測的抗原或抗體濃度太低、或者分子量 過小,則抗原-抗體復(fù)合物極難形成濁度,除非放置比較長的時間。如要形成較大的復(fù)合 物,則抗原和抗體的用量也相應(yīng)增加。鑒于上述缺陷,便發(fā)展出了膠乳增強免疫比濁法。
[0004] 膠乳增強免疫比濁法利用生物化學(xué)方法將抗體(或抗原)與微球結(jié)合。當(dāng)樣本中 待檢測的抗原(或抗體)與標(biāo)記到微球上的抗體(或抗原)相結(jié)合時,便形成了抗原-抗 體-膠乳顆粒復(fù)合物。這無疑改善了濁度的形成,增強了反應(yīng)吸光度。利用生化分析儀進 行比濁測定,整個分析過程只需幾分鐘,該方法與傳統(tǒng)免疫比濁法比較其靈敏度更高。
[0005] 在進行膠乳增強免疫比濁法過程中,需要將抗體(或抗原)與微球進行結(jié)合。結(jié) 合方式可以分為兩大類:物理吸附或共價偶聯(lián)。其中物理吸附是靠蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏 水基團與微球表面的疏水基團間的相互作用,將抗原或抗體吸附到微球表面。共價偶聯(lián)法 是通過蛋白質(zhì)與微球表面的化學(xué)基團發(fā)生反應(yīng),將蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)在微球上。
[0006] 共價偶聯(lián)法由于特異性好、易保存、分散性良好等特點,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于體外診斷 試劑中。市面上可見多種類型的微球,其中最為常見的是聚苯乙烯膠乳顆粒。很多膠乳顆 粒表面帶有化學(xué)基團包括但不限于羧基、氨基、酰肼、醛基、環(huán)氧基、巰基、羥基、金屬基、硅 羥基。這些基團,經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng),可以共價偶聯(lián)上各種生物分子。其中,羧基膠乳顆???以采用多種策略進行活化,產(chǎn)生能夠和蛋白質(zhì)中的親核基團(如氨基)發(fā)生偶聯(lián)的反應(yīng)性 中間體。
[0007]目前為止,用于將蛋白質(zhì)以及其它含氨基的分子偶聯(lián)到羧基膠乳顆粒上最常見的 反應(yīng)策略是水溶性碳二亞胺(EDC,1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳二亞胺)介導(dǎo)的方法。 該方法可以通過兩種模式來進行:一步法;或者兩步法。
[0008] 在一步法中,EDC直接加到蛋白質(zhì)與微球混合液中,羧基膠乳顆粒被水溶性EDC激 活而產(chǎn)生中間體酯,中間體酯可以直接與蛋白上的氨基發(fā)生反應(yīng)。
[0009] 在兩步法中,先用EDC激活膠乳顆粒,再進一步加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)或 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)來生成另一個二級中間體酯(NHS-酯或Sulfo-NHS 酯)。和一步法的中間體酯相比,NHS-酯或Sulfo-NHS酯在結(jié)構(gòu)上更加穩(wěn)定。因此,兩步法 的產(chǎn)量通常更高(GregT.Hermanson.BioconjugateTechniques.AcademicPress,2010)。
[0010] 偶聯(lián)過程中,由于大多數(shù)蛋白質(zhì)上同時存在有很多氨基(如賴氨酸、精氨酸殘基) 和羧基(如絲氨酸、蘇氨酸殘基),過量的EDC容易介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間發(fā)生自我聚合,兩步法能 夠克服這種缺陷,但是由于步驟繁多,不僅增加了時間成本,企業(yè)還不得不編寫更多的SOP文件(操作規(guī)程文件)、不得不引入更多的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。顯然,從現(xiàn)代化的大規(guī)模生產(chǎn)的 角度而言,兩步法不是一種經(jīng)濟有效的方式。
[0011] 相比較而言,一步法的步驟簡單快捷,更適合大規(guī)模生產(chǎn)。但是,自我聚合現(xiàn)象會 相對比較嚴(yán)重,這無疑導(dǎo)致了原材料的浪費、成本增加。并且,制備出來的試劑空白值較高, 可以想象這勢必會有損產(chǎn)品的空白檢測限和靈敏度。此外,傳統(tǒng)一步法制備的試劑在測繪 標(biāo)準(zhǔn)曲線時線性較差,從而最終影響到待測樣本的測定值。因此,本領(lǐng)域仍需要一種改進的 一步偶聯(lián)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0012] 發(fā)明人將只有兩步法中才使用的NHS引入到一步法當(dāng)中時,出乎意料地發(fā)現(xiàn),通 過這種方法所制備的試劑不僅空白低、線性也得到顯著改善。并且,Sulfo-NHS比NHS顯示 出了更加優(yōu)越的效果。
[0013] 因此,根據(jù)本發(fā)明的一個方面,提供一種將含氨基的分子共價偶聯(lián)至微球上的偶 聯(lián)方法,其包括步驟:
[0014] 1)提供微球;
[0015] 2)提供含氨基的分子;
[0016] 3)將微球與含氨基的分子混合均勻,獲得微球與含氨基的分子的混合物;
[0017] 4)使步驟3)混合物同時接觸碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺,進行共價偶聯(lián)反 應(yīng);
[0018] 5)收獲偶聯(lián)有含氨基的分子的微球,
[0019] 其中所述步驟1)和步驟2)的順序是可互換的。
[0020] 在一些實施方式中,所述微球為羧基修飾的聚苯乙烯膠乳顆粒。
[0021] 本發(fā)明所用微球可以是任何合適的市售微球,比如BangsLaboratories、Sigma、 Roche、Gibco、Merck、Amresco、Invitrogen、Millipore等供應(yīng)商都提供有各種型號、規(guī)格 的羧基修飾的聚苯乙烯膠乳顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解,自行制備的羧基修飾的聚苯 乙烯膠乳顆粒也可以用于實施本發(fā)明。
[0022] 在一些實施方式中,所述微球直徑為80nm至250nm。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解,本發(fā)明的實施并不依賴于微球的尺寸,只要其表面修飾有羧基基團就可以用于實施本 發(fā)明。微球供應(yīng)商提供各種不同尺寸的微球,在膠乳增強免疫比濁檢測領(lǐng)域當(dāng)中,常見微球 的尺寸為80nm至250nm。在一個具體的實施方式中,所用微球直徑為150或200nm。
[0023] 在一些實施方式中,所述含氨基的分子選自多肽或蛋白質(zhì)。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解,在偶聯(lián)過程中,羧基微球經(jīng)活化之后產(chǎn)生能夠和親核基團(如氨基)發(fā)生偶聯(lián)的 反應(yīng)性中間體。鑒于此,理論上而言,任何含有氨基的分子都能通過本申請的方法共價偶聯(lián) 至羧基微球上。在免疫比濁檢測的領(lǐng)域當(dāng)中,通常的做法是將蛋白質(zhì)或多肽偶聯(lián)至微球上, 以便于借此檢測樣本中的待測分子。所述蛋白質(zhì)或多肽包括但不限于抗原、抗體、酶、配體、 受體。在一個【具體實施方式】中,將抗體偶聯(lián)至微球上。在一個【具體實施方式】中,將多肽偶聯(lián) 至微球上。
[0024] 在一些實施方式中,步驟1)可以按照現(xiàn)有技術(shù)中的一步法操作進行。例如,將微 球懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中來提供微球,也可以按照微球供應(yīng)商推薦的方法來提供微球???用的緩沖液包括,但不限于,MES緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液、或者上述 緩沖液的組合。緩沖液pH可以在pH5-8范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)膠 乳顆粒的類型自行確定緩沖液類型及其pH范圍,也可以采用微球供應(yīng)商推薦的緩沖液。在 一個具體的實施方式中,將微球懸浮在MES溶液pH6-7的緩沖液中來提供微球。
[0025] 在一些實施方式中,步驟2)可以按照現(xiàn)有技術(shù)中的一步法操作進行。例如,將含 氨基的分子溶解在適當(dāng)?shù)木彌_液中。在一個【具體實施方式】中,將抗體溶解在PH7. 4的PBS 緩沖液中來提供含氨基的分子。但是,應(yīng)當(dāng)理解本申請的方法并不限于此,可用的緩沖液包 括,但不限于,MES緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液、或者上述緩沖液的組合。 緩沖液pH可以在pH5-8范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)待偶聯(lián)的分子自行 確定適當(dāng)?shù)木彌_液類型及其pH范圍。
[0026] 在一些實施方式中,使微球和含氨基的分子的混合物同時接觸碳二亞胺和N-羥 基琥珀酰亞胺,進行共價偶聯(lián)反應(yīng)。傳統(tǒng)一步法僅采用碳二亞胺一種化合物作為偶聯(lián)劑。和 傳統(tǒng)一步法相比,本申請的方法還同時引入了N-羥基琥珀酰亞胺。N-羥基琥珀酰亞胺是在 兩步法當(dāng)中才會用到的。兩步法中,碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺是彼此分開,先后加入 至反應(yīng)體系中的。與兩步法不同,本申請的方法是使微球和含氨基的分子的混合物同時接 觸碳二亞胺和