專利名稱：獲得無賦形劑抗體溶液的方法
獲得無賦形劑抗體溶液的方法本發(fā)明涉及通過超濾-滲濾獲得無賦形劑抗體溶液的方法?？贵w分子，作為蛋白質(zhì)藥物類別的一部分，極易發(fā)生物理和化學(xué)降解，諸如變性和聚集、脫酰胺、氧化和水解。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性受到該蛋白質(zhì)自身特性(例如氨基酸序列)以及外部影響因素(諸如溫度、溶劑PH、賦形劑、界面或剪切率)的影響。所以，限定最佳的配制條件以保護蛋白質(zhì)免于在生產(chǎn)、貯存和施用過程中發(fā)生降解反應(yīng)是重要的。(Manning, Μ. C.，K. Patel 等(1989)，“蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性(Stability of protein pharmaceuticals)，，，Pharm Res 6(11) :903-18 ；Zheng, J. Y.禾口 L. J. Janis (2005)，"pH、 緩沖液種類和貯存溫度對人源化單克隆抗體的理化穩(wěn)定性的影響(Influence of pH， buffer species， and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298)，，，Int J Pharm.)抗體經(jīng)由皮下(s.c.)或肌內(nèi)(i.m.)途徑施用要求在最終制劑中具有高的蛋白質(zhì)濃度，因為s. c.或i.m.途徑經(jīng)常需要高劑量以及有限的給藥體積。(Siire， S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)，“研制蛋白質(zhì)高濃縮物制劑的挑戰(zhàn)(Challenges in the development of high protein concentration formulations)J Pharm Sci 93(6) 1390-402 ；Roskos, L. K.，C. G. Davis等(2004)，“治療性單克隆抗體的臨床藥理學(xué)(The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies)”， Drug Development Research 61(3) :108-120.)蛋白質(zhì)高濃縮物的大規(guī)模生產(chǎn)可以通過超濾方法、干燥方法(諸如冷凍干燥或噴霧干燥)和沉淀方法實現(xiàn)。(Shire, S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)， “研制蛋白質(zhì)高濃縮物制劑的挑戰(zhàn)(Challenges in the development of high protein concentration formulations)，，，J Pharm Sci 93(6) :1390_402o )Andya等(美國專利6，267, 958、美國專利6，85，940)描述了一種穩(wěn)定的抗體凍干制劑，將其用適當(dāng)?shù)南♂岓w積重構(gòu)以達到需要的濃度。該制劑包含凍干保護劑、緩沖劑和表面活性劑。膜過濾是生命科學(xué)中廣泛使用的一項技術(shù)，最常用于蛋白質(zhì)的分離、純化或濃縮。根據(jù)膜的類型，可以將其分為微濾(膜孔徑大小為0.1-10 μ m)或超濾(膜孔徑大小為0.001-0. 1 μ m)。超濾膜用于濃縮溶解的分子(蛋白質(zhì)、肽類、核酸類、碳水化合物和其它生物分子)、脫鹽或交換緩沖劑和粗分級(gross fractionation)。超濾膜截留大于膜孔徑的分子，而可100%透過的較小的分子諸如鹽、溶劑和水自由通過膜。有兩種主要的膜過濾方法單通/死端/直流過濾PFF)，在該方法中待過濾的流體垂直地指向膜；錯流/切向流過濾(TFF)，在該方法中流體以與膜表面呈切向的方向流動。TFF通過再循環(huán)截留物 (retentate)解決膜堵塞問題。在大分子濃縮中，膜富集想要的生物種類的含量。由外部手段產(chǎn)生的壓力迫使液體通過半透膜。大于膜的標(biāo)稱截留分子量(MWCO)的溶質(zhì)被截留。所需的壓力可以通過使用壓縮氣體、泵抽、離心或毛細管作用產(chǎn)生。通過交替進行超濾和再稀釋或者通過連續(xù)的超濾和稀釋以保持恒定的體積從溶液中除去小分子形成滲濾方法。超濾對于除去或交換鹽、糖、非水溶劑或快速改變離子和PH環(huán)境是理想的。一般來說，超濾裝置包含進料溶液(feed solution)，該進料溶液含有大分子(例如抗體)、溶質(zhì)(諸如緩沖劑成分、鹽、氨基酸或糖)和溶劑(例如水)，經(jīng)由外力(例如通過泵抽)使其通過超濾盒(ultrafiltration cassette)。進料流被分離成濾液流和截留物流。該濾液由溶劑和能夠通過半透膜的所有溶質(zhì)組成，并離開系統(tǒng)循環(huán)。大分子被截留在截留物流中，并回到進料槽(feed tank)中。在濃縮方法中，溶劑被不斷地除去，并且大分子濃度增加，而能夠通過膜的溶質(zhì)的濃度保持不變。在滲濾方法中，通過向進料槽中加入滲濾緩沖液來補償排出的濾液體積。滲濾緩沖液包含不同于初始進料溶液的溶質(zhì)組分。大分子的濃度保持不變，而從初始進料組合物到滲濾緩沖液組合物，溶質(zhì)組成在不斷地變化。濃縮和滲濾這兩種方法可以以不同的順序結(jié)合起來。美國專利6，566，329描述了人生長激素凍干制劑的生產(chǎn)，其中使用脫鹽柱作為中間方法步驟進行hGH脫鹽得到不含鹽和其它賦形劑的hGH純水溶液。本項工作的范圍為研制凍干制劑，其限制于最大濃度為70mg/mL的低溶解性的hGH，并且使用了脫鹽柱。WO 99/55362教導(dǎo)了 IGF-I的噴霧干燥制劑。應(yīng)用純rhIGH_l作為其制備一個中間體。然而，使用透析盒進行緩沖液交換，并得到在水中的純IGF-1，其表現(xiàn)出強混濁和沉淀，即強烈的不穩(wěn)定信號，并且IGF-I在水中的溶解度與最大溶解度為2%ig/mL的含有賦形劑的制劑相比明顯降低。Gokarn 等，J. Pharm. Sci. 2007 年 11 月 19 0,97(8) :3051-3066 顯示了高濃度抗體制劑的自我緩沖能力，因此證明了從蛋白質(zhì)制劑中排除緩沖劑成分的可能性。然而， 為確保所述抗體制劑的穩(wěn)定性和等滲性，向無緩沖劑制劑中加入山梨醇是必要的。在 W02006/138181中，Gokarn等也描述了高濃度抗體制劑的自我緩沖能力，其中簡述了使用分子排阻色譜法、透析和/或切向流過濾(超濾-滲濾)，但是，僅在抗衡離子的存在下，制備除去殘留緩沖劑的無緩沖劑組合物的方法。本發(fā)明的目的是開發(fā)用于制備無賦形劑抗體溶液的方法，其不具有現(xiàn)有技術(shù)的缺點或者至少部分地避免了這些缺點。通過如獨立權(quán)利要求所述的方法可以達到這一目的。將含有各種溶質(zhì)(諸如緩沖鹽、鹽、氨基酸、糖或糖醇)的抗體溶液通過滲濾進行緩沖液對純水的交換，導(dǎo)致僅由抗體和溶劑組成的溶液。任選地，可以在滲濾步驟之前和之后加入濃縮步驟。令人驚訝的是，所獲得的抗體的無賦形劑蛋白質(zhì)制劑在滲濾和濃縮過程中保持總體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。本發(fā)明的第一個方面涉及超濾和滲濾除抗體外含有至少一種溶質(zhì)的抗體溶液的方法，該方法包括用溶劑滲濾抗體溶液并使所述的混合物與半透膜接觸，以便使在抗體溶液中存在的且具有低于膜的截留分子量(MWCO)的分子量的至少一種溶質(zhì)通過膜，同時截留抗體，從而獲得僅含有抗體和溶劑的改良的抗體溶液。優(yōu)選地，所述的溶劑為水，并且至少一種溶質(zhì)選自緩沖鹽、鹽、氨基酸、糖和糖醇。用于本發(fā)明的抗體的實例為免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG的特征在于含有兩條重鏈和兩條輕鏈，并且這些分子包含兩個抗原結(jié)合位點。所述的抗原結(jié)合位點包含由重鏈的部分(VH)和輕鏈的部分(VL)組成的“可變區(qū)”。通過VH域和VL域的并列(juxtaposition)形成抗原-結(jié)合位點。關(guān)于抗體分子或免疫球蛋白分子的一般信息也可參見常見的教科書，如Abkis “細胞和分子免疫學(xué)(Cellular and MolecularImmunology) ”，W. B. Sounders 公司 O003)。上文所述的超濾和滲濾除抗體外含有至少一種溶質(zhì)的抗體溶液的方法優(yōu)選致使產(chǎn)生抗體濃度為30-280mg/mL、更優(yōu)選為80-200mg/mL的無賦形劑抗體溶液。上文所述的方法可以用來制備液體或干燥形式的最終產(chǎn)品。因此，本發(fā)明方法還包含將所述的僅含有抗體和溶劑的抗體溶液加工成凍干物、穩(wěn)定的液體制劑和/或重構(gòu) (reconstituted)制劑的步驟?？贵w優(yōu)選是單克隆抗體，尤其優(yōu)選是選自IgGl、IgG2或IgG4的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個方面涉及通過本發(fā)明方法可獲得的純化的抗體溶液。優(yōu)選地，所述的抗體為單克隆抗體，甚至更優(yōu)選當(dāng)所述的抗體為單克隆抗體時，其選自IgGl、IgG2或 IgG4。本發(fā)明的第三個方面涉及通過凍干上文所述的本發(fā)明的純化的抗體溶液得到的凍干的抗體制劑。定義術(shù)語“無賦形劑抗體溶液”或“僅含有抗體和溶劑的抗體溶液”意指含有抗體的水溶液，其中小分子溶質(zhì)僅以至多為檢測限的濃度(例如至多到0. 02-0. OSmM的范圍)存在。 也就是說，使用用于檢測它們的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)，所述的含有抗體的水溶液基本上無任何超過特定檢測限的小分子溶質(zhì)。術(shù)語“截留物”意指含有截留的蛋白質(zhì)的溶液。術(shù)語“進料”意指進入超濾盒的溶液。在通過半透膜期間，進料被分離成截留物和濾液。術(shù)語“濾液”意指通過膜的溶液，其含有沒有被膜截留的溶劑和溶質(zhì)。術(shù)語“滲濾”意指向產(chǎn)品中加入洗滌流體并用膜過濾裝置過濾該產(chǎn)品，其導(dǎo)致產(chǎn)品中可過濾組分的濃度降低，即這些物質(zhì)被洗脫出來，而產(chǎn)品中的不可過濾的組分不一定會被濃縮或者產(chǎn)品不一定會變粘稠。所用的洗滌流體為在產(chǎn)品之外的洗滌流體，諸如單獨供給的水或溶劑。術(shù)語“膜超濾”意指使用半透膜按照分子大小、形狀和/或電荷分離水溶液中的種類(species)的壓力改變的、對流方法。本文所用的術(shù)語“抗體”與術(shù)語“抗體分子”同義，其在本發(fā)明中包括抗體分子，如完全免疫球蛋白分子，例如 IgMs, IgDs, IgEs, IgAs 或 IgGs (如 IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3 或 IgG4)，和這些免疫球蛋白分子的部分，如Fab-片段、Fab，-片段、F(ab)2_片段、嵌合F(ab)2 或嵌合Fab’片段、嵌合Fab-片段或分離的VH-或CDR-區(qū)(所述的分離的VH-或CDR-區(qū)為例如被整合或設(shè)計進相應(yīng)的“骨架區(qū)”)。相應(yīng)地，術(shù)語“抗體”也包括免疫球蛋白的已知亞型和修飾體，如單鏈抗體或單鏈Fv片段(scAB/scFv)或雙特異性抗體構(gòu)建體，所述的亞型和修飾體的特征為包含至少一個如本文所定義的糖基化的VH區(qū)。這種亞型或修飾體的具體實例可以是VH-VL或VL-VH模板中的sc (單鏈)抗體，其中所述的VH包含本文所述的糖基化。也考慮例如在VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL, VH-VL-VL-VH模板中的雙特異性scFvs。 術(shù)語“抗體”還包含雙抗體(diabodies)和包含連接到至少一個抗原結(jié)合部分/肽的作為載體的抗體Fc域的分子，例如在WO 00/24782中所述的肽抗體。在本發(fā)明制劑中可以包含的抗體尤其是重組產(chǎn)生的抗體。這些抗體可以在哺乳動物細胞-培養(yǎng)系統(tǒng)例如在CHO細胞中產(chǎn)生?？贵w分子可以通過下文所述的例如用于純化特異性糖基化抗體亞型的色譜步驟和過濾步驟的序列進行進一步的純化。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑相關(guān)的術(shù)語“凍干物”表示由本身為本領(lǐng)域公知的冷凍-干燥法生產(chǎn)的制劑。通過冷凍然后在真空下升華除去溶劑(例如水)，并在升高的溫度下脫附殘留的水。在制藥領(lǐng)域，凍干物通常具有大約0.1-5% (w/w)的殘留水分，以粉末或物理上穩(wěn)定的餅狀物的形式存在。凍干物的特征在于加入重構(gòu)介質(zhì)后溶解。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑相關(guān)的術(shù)語“重構(gòu)制劑”表示凍干的并通過加入重構(gòu)介質(zhì)再溶解的制劑。重構(gòu)介質(zhì)包括但不限于注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、 氯化鈉溶液(例如0.9% (w/v) NaCl)，葡萄糖溶液(例如5 %葡萄糖)、含有表面活性劑的溶液(例如0. 01%聚山梨醇20)、pH緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖溶液)和其組合。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑相關(guān)的術(shù)語“穩(wěn)定的液體制劑”表示在生產(chǎn)、 貯存和應(yīng)用過程中保持其物理和化學(xué)完整性的制劑。在Reubsaet, J. L.，J. H. Beijnen 等(1998)，“用于研究蛋白質(zhì)和肽類降解-化學(xué)不穩(wěn)定性的分析技術(shù)(Analytical techniq ues used to study the degradation of proteins and peptides :chemical instability) ”，J Pharm Biomed Anal 17(6-7) :955-78和Wang，W. (1999)，“液體蛋白質(zhì)藥物的不穩(wěn)定性、穩(wěn)定化和配制(Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals) 'Mnt J Pharm 185(2) :1四_88 中提供和綜述了用來評價蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)。穩(wěn)定性可以通過在選定的氣候條件下貯存選定的時間，通過應(yīng)用物理應(yīng)力(諸如以選定的振搖頻率振搖選定的時間)或者通過在選定的速率和溫度下反復(fù)凍融進行評價。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑相關(guān)的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”表示依從當(dāng)前藥物國際管理要求的制劑。藥學(xué)上可接受的制劑含有通常公認用于預(yù)期應(yīng)用途徑和安全濃度范圍的賦形劑。此外，其在生產(chǎn)、貯存和應(yīng)用期間應(yīng)提供足夠的穩(wěn)定性。而且，用于腸胃外應(yīng)用途徑的制劑應(yīng)考慮對比人血液組成的等滲性和euhydric pH要求。無賦形劑抗體溶液的制備避免了在抗體溶液的生產(chǎn)和貯存過程中賦形劑誘導(dǎo)的不穩(wěn)定性，并避免故意存在于處理溶液或制劑中的抗衡離子的使用。賦形劑通常在抗體制劑中作為添加劑使用，其也可能含有低水平的雜質(zhì)，所述的雜質(zhì)可能導(dǎo)致抗體分子的化學(xué)不穩(wěn)定性反應(yīng)。例如，蔗糖在蛋白質(zhì)制劑中常用作穩(wěn)定劑，據(jù)報道其含有低痕量的金屬離子，所述的金屬離子可能導(dǎo)致甲硫氨酸殘基氧化(Rowe RC, Sheskey PJ, Owen SC, Q005)藥物賦形劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第 5版APhA Publications)。 而且，賦形劑可能與加工設(shè)備的表面相接觸，其導(dǎo)致浸出液的蓄積。例如，氯化鈉在蛋白質(zhì)制劑中也常用作等滲劑，據(jù)報道它的存在在較高的溫度下當(dāng)與不銹鋼表面接觸后會增加治療性抗體的氧化(Lam 等，(1997) J. Pharm. Sci. 86(11) :1250-1255)。高度濃縮的無賦形劑抗體制劑的制備避免了不恰當(dāng)?shù)馁x形劑組合物的制備。在低離子強度和蛋白質(zhì)高濃度下的緩沖液交換導(dǎo)致透過超濾膜的緩沖離子分布不均。這種后果(所謂的Dorman效應(yīng))導(dǎo)致作為蛋白質(zhì)濃度函數(shù)的緩沖劑濃度的改變和制劑pH的變化 (Stoner ^ (2004) J. Pharm. Sci. 93 (9) :2332-2342)。通過向無賦形劑抗體溶液中加入指定量的儲備緩沖溶液，無賦形劑抗體溶液的制備可以用作制備更精確的抗體制劑的初始步馬聚ο
而且，該方法確保在完成從原料藥到最終藥物產(chǎn)品的制備方法鏈期間在抗體制劑中使用相同的賦形劑質(zhì)量。適當(dāng)?shù)哪み^濾條件可以由技術(shù)人員確定。對于濃縮之前的使用注射用水的滲濾， 蛋白質(zhì)溶液與滲濾溶液的比值應(yīng)為至少2，更優(yōu)選至少3或尤其優(yōu)選5或10。對于根據(jù)本發(fā)明的滲濾和超濾，適當(dāng)?shù)臑V液流速可以為l-lOOL/m !，優(yōu)選l-SOL/m !，對于截留物，流速為2-60L/ma!，優(yōu)選3-50L/ma!，尤其優(yōu)選8-35L/ma!。膜優(yōu)選是超濾膜；適當(dāng)?shù)慕亓舴肿恿靠梢詾棣?lOOkD，優(yōu)選5-100kD，尤其優(yōu)選30-50kD。過濾可以在I-IOOpsi、優(yōu)選10_90psi、 尤其優(yōu)選15-70psi的跨膜壓(TMP)下進行。
實施例實施例1通過外力(例如通過泵抽)使含有大分子(例如抗體)、溶質(zhì)(諸如緩沖劑成分、 鹽、氨基酸或糖)和溶劑(例如水)的進料溶液通過超濾盒。進料流被分離成濾液流和截留物流。濾液由溶劑和能夠通過半透膜的所有溶質(zhì)組成，并離開系統(tǒng)循環(huán)。大分子被截留在截留物流中并回到進料槽。在濃縮方法中，溶劑被不斷地除去，并且大分子濃度增加，而能夠通過膜的溶質(zhì)的濃度保持不變。在滲濾方法中，通過向進料槽中加入滲濾緩沖液來補償排出的濾液體積。滲濾緩沖液包含不同于初始進料溶液的溶質(zhì)組分。大分子的濃度保持不變，而從初始進料組合物到滲濾緩沖液組合物，溶質(zhì)組成在不斷地變化。濃縮和滲濾這兩種方法可以以不同的順序結(jié)合起來。起始溶液由在20mM組氨酸緩沖液中濃度為大約50-60mg/mL的抗β淀粉樣肽的 IgG(如PCT/EP2006/011914的實施例1中所述的抗體Α)組成。首先預(yù)濃縮抗體物質(zhì)，然后滲濾，隨后在無賦形劑抗體溶液中濃縮達到最終目標(biāo)濃度。采用無其它賦形劑的注射用水 (WFI)進行滲濾。滲濾緩沖液與蛋白質(zhì)溶液的比值為至少5。半透膜由再生纖維素組成，具有400cm2的膜面積和30kD MWCO0表5列出在根據(jù)本發(fā)明的方法期間得到的方法參數(shù)的概述。表1至表4列出用于表明方法之后和方法期間物質(zhì)的完整性的物質(zhì)參數(shù)諸如體積(L)、 蛋白質(zhì)濃度(g/L)、蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)、pH、在截留物中每克蛋白質(zhì)的重量克分子滲透壓濃度 (mOsm/g)、濾液中的重量克分子滲透壓濃度(mOsm/kg)、收率(％ )、緩沖液濃度(mM)以及通過分子排阻色譜法測定的單體含量(％ )。在整個方法中由于除去了可滲透的溶質(zhì)，截留物中每克蛋白質(zhì)的重量克分子滲透壓濃度顯著降低了。使用分子排阻(SE)-HPLC方法測定緩沖劑濃度，并表明緩沖液賦形劑基本上被除去了，低于分析方法的限度。通過方法后濾液中重量克分子滲透壓濃度值小于 5m0sm/kg也可以間接表明無賦形劑。表1超濾/滲濾(UFDF)運行(Run) 070813A，超濾之前和之后的制劑參數(shù)
權(quán)利要求
1.超濾和滲濾除抗體外含有至少一種溶質(zhì)的抗體溶液的方法，該方法包括用溶劑滲濾該抗體溶液，并使所述的混合物與半透膜接觸以便使抗體溶液中存在的且分子量低于膜截留分子量的至少一種溶質(zhì)通過膜，同時截留抗體從而獲得僅含有抗體和溶劑的抗體溶液。
2.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中溶劑為水。
3.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所述的僅含有抗體和溶劑的抗體溶液具有30-280mg/mL、優(yōu)選50_200mg/mL的抗體濃度。
4.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其還包括將所述的僅含有抗體和溶劑的抗體溶液加工成穩(wěn)定的液體制劑的步驟。
5.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其還包括將所述的僅含有抗體和溶劑的抗體溶液加工成凍干物或重構(gòu)制劑的步驟。
6.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中至少一種溶質(zhì)選自緩沖鹽、鹽、氨基酸、糖和糖醇。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中半透膜是超濾膜，優(yōu)選具有2-50kD的截留分子量。
8.如前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中抗體是單克隆抗體，優(yōu)選選自IgGl、 IgG2 或 IgG4。
9.通過前述權(quán)利要求中任意一項所述的方法可獲得的純化的抗體溶液。
10.前述權(quán)利要求中任意一項所述的純化的抗體溶液，其中抗體是單克隆抗體，優(yōu)選選自 IgGl、IgG2 或 IgG4。
11.基本上如上文所述的方法和純化的抗體，尤其參考上述實施例。
全文摘要
本發(fā)明涉及超濾和滲濾除抗體外含有至少一種溶質(zhì)的抗體溶液的方法，該方法包括用溶劑滲濾抗體溶液，并使所述的混合物與半透膜接觸以便使抗體溶液中存在的且分子量小于膜截留分子量的至少一種溶質(zhì)通過膜，同時截留抗體以便獲得僅含有抗體和溶劑的改良抗體溶液。
文檔編號A61K39/395GK102245206SQ200980149229
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者H-C·馬勒, R·米勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司