專利名稱：用于治療與帕金森氏病有關(guān)的癥狀的化合物的制作方法
用于治療與帕金森氏病有關(guān)的癥狀的化合物本發(fā)明涉及用于預(yù)防、改善和治療與帕金森氏病有關(guān)的癥狀的方法和手段。阿爾茨海默氏病(AD)和帕金森氏病(PD)是人類中癡呆和運(yùn)動(dòng)失調(diào)的最常見原 因。雖然AD的特征為自淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)衍生的淀粉樣蛋白β蛋白(形成所謂 的Αβ斑)的累積，但是PD患者形成α-突觸核蛋白(a-Syn，aSyn ；形成所謂的Lewy小 體)的病理累積。這兩種分子都被認(rèn)為是這些神經(jīng)變性性病癥的主要疾病起因。AD和PD 這兩種疾病都與神經(jīng)元和突觸連接的變性、特神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏、和錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)(它們的 非致病型式蛋白在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用)的異常累積有關(guān)。最近，在臨床上限定了與運(yùn)動(dòng)失調(diào)有關(guān)但臨床癥狀與AD的不同的一種新型癡呆， 即相關(guān)性癡呆或特發(fā)性帕金森綜合征。這種新癥狀被限定為具有Lewy小體的癡呆或具有 癡呆的帕金森氏病(DLB/PDD)。DLB/PDD占所有癡呆病例的多達(dá)25%，而且不得不被認(rèn)為是 老年人中癡呆的第二位最突出形式。該疾病的特征為與廣泛的淀粉樣蛋白沉積有關(guān)的分布 廣泛的Lewy小體病理的形成。分布廣泛的Lewy小體的這種存在使DLB/PDD病例與所有其 它形式的癡呆以及與其它運(yùn)動(dòng)失調(diào)區(qū)分開。對(duì)DLB/PDD的神經(jīng)學(xué)評(píng)估顯示在注意力方面、 在執(zhí)行功能方面、在記憶以及行為行為和運(yùn)動(dòng)改變方面的突出異常。當(dāng)前認(rèn)為aSyn和Αβ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有不同的，以及趨同的致病效果。認(rèn)為突觸核 蛋白比認(rèn)知功能更嚴(yán)重地影響運(yùn)動(dòng)功能，而淀粉樣蛋白β肽被描述為具有相反的影響。另 外，通過(guò)參與協(xié)同神經(jīng)變性途徑，aSYN和Αβ能更直接地相互作用。最近顯示了在臨床前 疾病模型中不同的病理分子(包括Αβ、τ以及aSyn)能互相加劇毒性效果，而且指示Aβ 在不同神經(jīng)變性性狀況中的重要功能。在一種最近的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物DLB/PDD模型中，顯示了 haSYN和hAPP這兩種分子在小鼠中的共表達(dá)導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)改變的發(fā)生，其伴有膽堿能神 經(jīng)元的損失和突觸囊泡的減少，廣泛淀粉狀蛋白斑(amyloid plaque)的形成，和haSYN免 疫反應(yīng)性神經(jīng)元內(nèi)纖絲內(nèi)含體(inclusion)。所有這些特征也見于DLB/PDD綜合征。帕金森氏病的癥狀的當(dāng)前療法涉及給患有所述疾病的患者施用多巴胺能藥。認(rèn)為 多巴胺能藥減輕帕金森氏病的癥狀，因?yàn)檎J(rèn)為這些癥狀是由腦中多巴胺的剝奪引起的。腦 中多巴胺的不足因此可通過(guò)給患者施用多巴胺能藥諸如多巴胺激動(dòng)劑或多巴胺前體例如 左旋多巴來(lái)補(bǔ)充。帕金森氏病沒有已建立的治愈，這意味著癥狀惡化，迫使隨疾病進(jìn)展而增 大藥物日劑量。另外，長(zhǎng)期使用劑量增大的左旋多巴導(dǎo)致發(fā)生運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥，諸如疲憊和不隨 意運(yùn)動(dòng)(運(yùn)動(dòng)障礙)。運(yùn)動(dòng)功能障礙的癥狀能通過(guò)左旋多巴處理來(lái)改善，尤其是與改進(jìn)其功效的其它化 合物組合。施用多巴胺能藥的主要缺點(diǎn)之一在于這些藥必須以規(guī)則間隔施用。另外，這些藥 只導(dǎo)致患者中多巴胺能藥的升高，不清除帕金森氏病的癥狀的原因，即a-Syn斑。本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供通過(guò)降低a-Syn沉積物的量來(lái)持續(xù)治療帕金森氏病癥 狀的工具(means)。本發(fā)明涉及一種包含用于治療和/或改善帕金森氏病運(yùn)動(dòng)癥狀的肽的化合物，所 述肽能結(jié)合特異于淀粉樣蛋白β肽(Αβ)的表位的抗體。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)針對(duì)淀粉樣蛋白β肽的抗體并因此可用來(lái)治療β-淀 粉樣變諸如阿爾茨海默氏病的化合物可用于治療和改善帕金森氏病的癥狀，特別是帕金森 氏病的運(yùn)動(dòng)癥狀。通過(guò)施用所述化合物而形成的抗體令人驚訝地降低a-Syn沉積物的量。如本文中使用的，“運(yùn)動(dòng)癥狀(motor symptoms) ”指關(guān)于帕金森氏病處理中的醫(yī)療 產(chǎn)品的臨床調(diào)查的EMEA指導(dǎo)方針(CPMP/EWP/563/95Rev. 1)中描述的那些影響患有所述疾 病的患者的運(yùn)動(dòng)行為以及影響患者的自主功能的帕金森氏病癥狀。這些癥狀包括但不限于 核心癥狀靜止性震顫(restingtremor)，運(yùn)動(dòng)徐緩(bradykinesia)，強(qiáng)直(rigidity)，體位 ^ll (postural instability) ^R^MW^L (stooped posture)，豆長(zhǎng)力β章胃(dystonia), 疲勞(fatigue)，細(xì)微運(yùn)動(dòng)靈巧性和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損impaired fine motor dexterity and motor coordination ()，整體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損(impaired gross motor coordination)，運(yùn)動(dòng) 缺乏(poverty ofmovement)(擺臂縮小(decreased arm swing))，靜坐不能(akathisia)， 言語(yǔ)問(wèn)題(speech problems)，諸如由肌肉控制缺失引起的嗓音柔和(softness of voice) ^Wi^llfii (slurred speech), 0 ! '^ ^ (loss of facial expression)，g (masking) ”，寫字過(guò)小(micrographia)，吞咽困難(difficulty swallowing)，性功能障礙 (sexual dysfunction),流誕(drooling)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“表位”指抗原受到特定抗體分子識(shí)別的免疫原性區(qū)。抗原 可擁有一個(gè)或多個(gè)表位，每一個(gè)均能夠結(jié)合識(shí)別該特定表位的抗體。術(shù)語(yǔ)“能結(jié)合特異于淀粉樣蛋白β肽的表位的抗體的肽”意味著所述肽能結(jié)合通 過(guò)給哺乳動(dòng)物施用淀粉樣蛋白β肽或其片段而生成的淀粉樣蛋白β肽特異性抗體。具有 所述結(jié)合能力的肽能夠在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)誘導(dǎo)淀粉樣蛋白β肽特異性抗體形成。后一類 抗體因此結(jié)合本發(fā)明的化合物以及淀粉樣蛋白β肽。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述淀粉樣蛋白β肽表位選自下組DAEFRH， EFRHDSGY, pEFRHDSGY, EVHHQKL, HQKLVF 和 HQKLVFFAED。特別優(yōu)選使用能夠結(jié)合針對(duì)/特異于前述天然存在淀粉樣蛋白β肽表位的抗體 的本發(fā)明化合物。因此，依照本發(fā)明的化合物可包含具有所述氨基酸序列的肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物優(yōu)選不包含具有氨基酸序列 DAEFRH, EFRHDSGY, pEFRHDSGY, EVHHQKL, HQKLVF 和 HQKLVFFAED 的肽，但也結(jié)合淀粉樣蛋白 β特異性抗體。為了鑒定此類抗體誘導(dǎo)肽，可使用噬菌體文庫(kù)和肽文庫(kù)。當(dāng)然，也有可能通過(guò)使用 組合化學(xué)的手段來(lái)鑒定此類肽。所有這些方法都涉及使肽集合的肽接觸淀粉樣蛋白β肽 特異性抗體的步驟?？梢苑蛛x并測(cè)序(如果相應(yīng)肽的氨基酸序列未知的話)集合中結(jié)合所 述抗體的肽。在下文中，列出了能夠在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)淀粉樣蛋白β抗體形成的肽。這些肽也 可用于減輕帕金森氏病的癥狀。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，肽包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7,(式 I)其中&為G或具有羥基的氨基酸或帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選甘氨酸(G)，谷氨酸 (E)，酪氨酸(Y)，絲氨酸(S)或天冬氨酸(D)，&為疏水性的氨基酸或帶正電荷的氨基酸，優(yōu)選天冬酰胺(N)，異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，纈氨酸(V)，賴氨酸(K)，色氨酸(W)，精氨酸(R)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或丙氨 酸㈧，X3為帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，X4為芳香族的氨基酸或疏水性的氨基酸或亮氨酸(L)，優(yōu)選酪氨酸(Y)，苯丙氨酸
(F)或亮氨酸(L)，X5為組氨酸(H)，賴氨酸(K)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，優(yōu)選組氨酸 (H)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，且X6不存在或?yàn)榻z氨酸( ，蘇氨酸(T)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)， 谷氨酸(E)，精氨酸(R)，異亮氨酸(I)，賴氨酸(K)，酪氨酸(Y)，或甘氨酸(G)，優(yōu)選蘇氨酸 (T)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，精氨酸(R)，異亮氨酸(I)或甘氨酸(G)，X7不存在或?yàn)槿魏伟被?，?yōu)選脯氨酸(P)，酪氨酸(Y)，蘇氨酸(T)，谷氨酰胺 (Q)，丙氨酸(A)，組氨酸(H)或絲氨酸(S)，優(yōu)選EIDYHR，ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DI-DYRR，DLDYRR, DVDYRR, DKELRI，DffELRI，YREFFI，YREFRI，YAEFRG,EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG, DRELRI，DKELKI，DRELKI， GREFRN, EYEFRG, DffEFRDA, SffEFRT, DKELR, SFEFRG, DAEFRffP, DNEFRSP, GSEFRDY, GAEFRFT, SAEFRTQ, SAEFRAT, SffEFRNP, SffEFRLY, SffELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, S SEFRVS, DffEFRD, DAELRY, DffELRQ, SLEFRF, GPEFRff, GKEFRT, AYEFRH, DKE(Nle)R, DKE(Nva)R 或 DKE(Cha)R。依照本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，所述肽包含氨基酸序列X1RX2DX3 (X4) n (X5) m (X6) ο，(式 11)，其中\(zhòng)為異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)，X2為色氨酸(W)或酪氨酸⑴，X3為蘇氨酸⑴，纈氨酸(V)，丙氨酸㈧，甲硫氨酸(M)，谷氨酰胺(Q)或甘氨酸
(G)，X4為脯氨酸⑵，丙氨酸㈧，酪氨酸⑴，絲氨酸⑶，半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)，X5為脯氨酸⑵，亮氨酸(L)，甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)，X6為半胱氨酸(C)，n，m禾口 ο獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選IRWDTP (C)，VRffDVYP (C)，IRYDAPL (C)，IRYDMAG (C)，IRffDTSL (C)，IRffDQP (C)， IRffDG (C)或 IRWDGG(C)。本發(fā)明的化合物的肽可包含氨基酸序列EX1WHX2X3(X4)n(X5)m(式 III)，其中\(zhòng)為纈氨酸(V)，精氨酸(R)或亮氨酸(L)，X2為精氨酸(R)或谷氨酸(E)，X3為丙氨酸(A)，組氨酸(H)，賴氨酸(K)，亮氨酸(L)，酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)，X4為脯氨酸(P)，組氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸X5為半胱氨酸(C)，η和m獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選EVWHRHQ (C)，ERffHEKH (C)，EVffHRLQ (C)，ELffHRYP (C)，ELffHRAF (C)，ELffHRA (C)，EVffHRG(C), EVffHRH(C)禾口 ERWHEK(C)，優(yōu)選 EVWHRHQ(C)，ERffHEKH(C), EVffHRLQ(C), ELffHRYP(C)或 ELWHRAF(C)。依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，肽包含氨基酸序列QDFRHY(C)， SEFKHG (C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT (C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C)， LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NffFPHP (C), EEFKYS (C), NELRHST (C)， GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)， EDffFFffH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)， ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)， QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)， SAMRHSL(C)，TPLMFffH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)， AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)， EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)， TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH, SEFKH(C)，(C)HEFRH 或 HEFRH(C)。依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，肽包含氨基酸序列(X1) ^X2X3X4FX5X6 (X7) n(式 IV)，其中\(zhòng)為絲氨酸(S)，丙氨酸㈧或半胱氨酸(C)，)(2為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸 (M)，X3為異亮氨酸⑴，酪氨酸⑴，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，X4為亮氨酸(L)，精氨酸( ，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，纈氨酸(V)，組氨酸(H)， 酪氨酸(Y)，異亮氨酸(I)，賴氨酸(K)甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，&為丙氨酸(A)，苯丙氨酸(F)，組氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸( ，谷氨酸(E)， 異亮氨酸(I)，谷氨酰胺⑴)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G)X6為任何氨基酸殘基，X7為半胱氨酸(C)，m和η獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選SGEYVFH(C) , SGQLKFP(C) , SGQIffFR(C) , SGEIHFN(C)，GQIffFIS(C), GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELffFP(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)， GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIffFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)， GSLFFffP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)， GQIQFPL(C) , GEIKFDH(C) , GEIQFGA(C) , GELFFEK(C) , GEIRFEL(C) , GEIYFER(C)， SGEIYFER(C)，AGEIYFER(C)或(C)GEIYFER。依照本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，肽包含氨基酸序列(X1) ^X2X3X4X5FX6 (X7) n(式 V)，其中&為絲氨酸⑶，蘇氨酸⑴或半胱氨酸(C)，X2為谷氨酰胺(Q)，蘇氨酸⑴或甲硫氨酸(M)，X3為賴氨酸⑷或精氨酸(R)，X4為亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，X5為色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或異亮氨酸(I)，
X6為天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)，X7為半胱氨酸(C)，η和m獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選SHTRLYF (C)，HMRLFFN (C)，SHQRLffF (C)，HQKMIFA (C)，HMRMYFE (C)，THQRLffF (C) 或 HQKMIF(C)。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，肽包含氨基酸序列AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)， QLPLFVL(C)或 NDAKIVF(C)。依照本發(fā)明的化合物優(yōu)選為多肽/肽且包含4-30個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選5-25個(gè)氨 基酸殘基，更優(yōu)選5-20個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的化合物也可以是包含4-30個(gè)氨基酸殘基的多肽的一部分。展現(xiàn)對(duì)淀粉樣蛋白β抗體的親和力的肽可被認(rèn)為是模擬表位。依照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ) “模擬表位(mimotope) ”指具有拓?fù)鋵W(xué)與它所模擬的表位等同的構(gòu)象的分子。模擬表位結(jié)合 抗體免疫特異性結(jié)合期望抗原的相同抗原結(jié)合區(qū)。模擬表位會(huì)在宿主中引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答， 其能與它所模擬的抗原起反應(yīng)。模擬表位還可在涉及表位和結(jié)合所述表位的抗體的體外抑 制測(cè)定法(例如ELISA抑制測(cè)定法)中起它所模擬的表位的競(jìng)爭(zhēng)物的作用。然而，本發(fā)明 的模擬表位可不必在體外抑制測(cè)定法中阻止或競(jìng)爭(zhēng)它所模擬的表位的結(jié)合，盡管它能夠在 給哺乳動(dòng)物施用時(shí)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。包含此類模擬表位(還有上文列出的那些)的本 發(fā)明化合物具有避免形成自身反應(yīng)性T細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榛衔锏碾木哂信c天然存在淀粉 樣蛋白β肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。本發(fā)明的模擬表位/肽可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法來(lái)合成生成，或是作 為分離的肽或作為另一肽或多肽的一部分?；蛘?，肽模擬表位可以在生成肽模擬表位的微 生物中生成，然后分離并(如果想要的話)進(jìn)一步純化。肽模擬表位可以在微生物諸如細(xì) 菌，酵母或真菌中，在真核細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中，或在重組病毒載體諸如腺病 毒，痘病毒，皰疹病毒，Simliki森林病毒，桿狀病毒，噬菌體，辛德畢斯病毒或仙臺(tái)病毒中生 成。用于生成肽模擬表位的合適細(xì)菌包括大腸桿菌(E. coli)，枯草桿菌(B. subtilis)或 能夠表達(dá)肽諸如肽模擬表位的任何其它細(xì)菌。用于表達(dá)肽模擬表位的合適酵母類型包括釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),假絲 酵母屬(Candida)，巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)或能夠表達(dá)肽的任何其它酵母。 相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域公知的。用于分離和純化重組生成的肽的方法也是本領(lǐng)域公知的，而 且包括例如凝膠過(guò)濾，親和層析，離子交換層析等。為了便于分離肽模擬表位，可生成融合多肽，其中肽模擬表位翻譯融合(共價(jià)連 接)至能夠通過(guò)親和層析來(lái)分離的異源多肽。典型的異源多肽為His標(biāo)簽(例如His6;6 個(gè)組氨酸殘基)，GST標(biāo)簽(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)等。融合多肽不見便于純化模擬表位， 而且還能防止模擬表位多肽在純化期間被降解。如果想要在純化后除去異源多肽，那么融 合多肽可在肽模擬表位與異源多肽之間的接合處包含切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)由受到該位點(diǎn)處 的氨基酸序列特異性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列組成。本發(fā)明的模擬表位還可在它們的N和/或C端處或附近修飾，使得在所述位置處 結(jié)合半胱氨酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨 酸殘基用于經(jīng)二硫鍵來(lái)環(huán)化肽。
本發(fā)明的模擬表位還可用于各種測(cè)定法和試劑盒，特別是免疫學(xué)測(cè)定法和試劑 盒。因此，特別優(yōu)選的是，模擬表位可以是另一肽或多肽的一部分，特別是在免疫學(xué)測(cè)定法 中用作報(bào)告物的酶。此類報(bào)告酶包括例如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。依照本發(fā)明的模擬表位優(yōu)選是它們的氨基酸序列不同于Αβ或Αβ片段的氨基 酸序列的抗原性多肽。在這個(gè)方面，本發(fā)明的模擬表位可不僅包含一種或多種天然存在氨 基酸殘基的氨基酸替代，而且還可包含一種或多種非天然氨基酸(即不是來(lái)自20種“經(jīng)典 的”氨基酸)的氨基酸替代或者它們可以完全由此類非天然氨基酸裝配而成。此外，本發(fā) 明誘導(dǎo)針對(duì)及結(jié)合 A β 1-40/42，A β ρΕ3-40/42, A β 3-40/42，A β 11-40/42，A β pEl 1-40/42 和Αβ 14-40/42(及Αβ自氨基酸位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12和13開始的其它N端 截短形式)抗體的抗原可以由D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的組合裝配而成，而且 任選，它們可以通過(guò)進(jìn)一步修飾，環(huán)閉合或衍生化而進(jìn)行了改變。合適的抗體誘導(dǎo)性抗原可 以自商品化肽文庫(kù)提供。優(yōu)選的是，這些肽為至少7個(gè)氨基酸，且優(yōu)選的長(zhǎng)度可以長(zhǎng)達(dá)16， 優(yōu)選長(zhǎng)達(dá)14或20個(gè)氨基酸(例如5至16個(gè)氨基酸殘基)。依照本發(fā)明，然而，也可很好地 采用更長(zhǎng)的肽作為抗體誘導(dǎo)性抗原。另外，本發(fā)明的模擬表位也可以是多肽的一部分，并因 此在它們的N和/或C端包含至少一個(gè)別的氨基酸殘基。為了制備本發(fā)明的模擬表位(即本文中公開的抗體誘導(dǎo)性抗原)，當(dāng)然，噬菌體文 庫(kù)，肽文庫(kù)也是合適的，例如通過(guò)組合化學(xué)的手段生成的或通過(guò)用于最多變的結(jié)構(gòu)的高通 量篩選技術(shù)的手段獲得的(Display :A LaboratoryManual，Carlos F. Barbas等編；Willats WG, Phage display !practicalities andprospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec. ；50 (6) 837-54)。另外，依照本發(fā)明，也可采用基于核酸的抗Αβ 1-40/42，Αβ ρΕ3_40/42， Aβ 3-40/42，Aβ 11-40/42，Aβ pEl 1-40/42 和 Αβ 14-40/42 抗體誘導(dǎo)性抗原(“適體 (aptamer)”)，而且這些也可以用最多變的(寡核苷酸)文庫(kù)(例如具有2-180個(gè)核酸殘基) (例如 Burgstaller et al.，Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700 ；Famulok et al. , Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599 ；Mayer et al. ,PNAS 98 UOOl)，4961-4965 ；等) 找到。在基于核酸的抗體誘導(dǎo)性抗原中，核酸主鏈可例如通過(guò)天然磷酸二酯化合物或也通 過(guò)硫代磷酸酯或組合或化學(xué)變異(例如像PNA)來(lái)提供，其中依照本發(fā)明可主要采用U, T， A，C，G，H和mC作為堿基?？梢勒毡景l(fā)明使用的核苷酸的2’ -殘基優(yōu)選為H，0H, F，Cl，NH2, 0-甲基，0-乙基，0-丙基或0- 丁基，其中核酸還可別不同的修飾，即例如用保護(hù)基團(tuán)修飾， 就像它們通常在寡核苷酸合成中被采用的。如此，基于適體的抗體誘導(dǎo)性抗原也是本發(fā)明 范圍內(nèi)的優(yōu)選抗體誘導(dǎo)性抗原。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，化合物偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載體，優(yōu)選KLH(匙 孔蟲威血藍(lán)蛋白)，破傷風(fēng)類毒素，清蛋白結(jié)合蛋白，牛血清清蛋白，樹狀聚物(MAP ；Biol. Chem. 358 581)，肽接頭(或側(cè)翼區(qū))以及 Singh et al.，Nat. Biotech. 17(1999)， 1075-1081 (特別是該文件表 1 中的那些)，和 0' Hagan etal.，Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003)，727-735 (特別是其中記載的內(nèi)源免疫強(qiáng)化性化合物和投遞系統(tǒng)) 中記載的佐劑物質(zhì)，或其混合物。此語(yǔ)境中的偶聯(lián)化學(xué)(例如經(jīng)由異雙功能化合物，諸如 GMBS，當(dāng)然還有其它的，如 “Biocojuugate Techniques", Greg Τ· Hermanson 中記載的)可 選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的反應(yīng)。此外，疫苗組合物可以與佐劑，優(yōu)選低溶解度的鋁組合物，特別是氫氧化鋁一起配制。當(dāng)然，也可以使用像MF59磷酸鋁，磷酸鈣，細(xì)胞因子(例如 IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡聚物，LPS, MPL，聚磷腈，乳狀 液(例如弗氏，SAF)，脂質(zhì)體，病毒體，ISC0M，蝸形物(cochleates)，PLG微粒，Poloxamer顆 粒，病毒樣顆粒，熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，突變體毒素(例如LTK63和LTR72)， 微粒和/或聚合脂質(zhì)體這些佐劑。本發(fā)明的化合物優(yōu)選經(jīng)選自下組的接頭結(jié)合至載體或佐劑NHS-聚(氧化乙烯) (PEO)(例如NHS-PEO4-馬來(lái)酰亞胺)。包含本發(fā)明化合物(模擬表位，肽)和藥學(xué)可接受載體的疫苗可通過(guò)任何合適的 應(yīng)用模式(例如i.d.，i. v，i.p.，i.m.，鼻內(nèi)，口服，皮下，等)及在任何合適的投遞裝置中 施用(0，Hagan et al. , Nature Reviews, Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本 發(fā)明的化合物優(yōu)選為靜脈內(nèi)，皮下，皮內(nèi)或肌肉內(nèi)施用而配制(參見例如“Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations，，，Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc,2004)o依照本發(fā)明的藥物(疫苗)以0. Ing至10mg，優(yōu)選IOng至lmg，特別是IOOng至 100 μ g,或者例如 IOOfmol 至 ΙΟμπιοΙ，優(yōu)選 IOpmol 至 lymol，特別是 IOOpmol 至 IOOnmol 的量含有依照本發(fā)明的化合物。典型地，疫苗還可含有輔助物質(zhì)，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，帕金森氏病的運(yùn)動(dòng)癥狀選自下組靜止性震顫， 運(yùn)動(dòng)徐緩，強(qiáng)直，體位不穩(wěn)，彎腰體位，張力障礙，疲勞，細(xì)微運(yùn)動(dòng)靈巧性和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損，整 體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損，運(yùn)動(dòng)缺乏(擺臂縮小)，靜坐不能，言語(yǔ)問(wèn)題，面部表情喪失，寫字過(guò)小，吞 咽困難，性功能障礙和流涎。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及依照本發(fā)明的化合物在制備用于治療、預(yù)防和/或改善 帕金森氏病運(yùn)動(dòng)癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及一種用于治療和/或改善帕金森氏病的癥狀，特別是運(yùn) 動(dòng)癥狀的方法。本發(fā)明在下面的附圖和實(shí)施例中進(jìn)一步例示，然而，不限于此。

圖1顯示用于本發(fā)明篩選方法的文庫(kù)4的各肽成員。圖2顯示用DAEFRH的模擬表位進(jìn)行的抑制測(cè)定法。圖3顯示用DAEFRH的其它表位進(jìn)行的另一種抑制測(cè)定法。圖4和5描述用依照本發(fā)明的模擬表位肽實(shí)施的抑制測(cè)定法的結(jié)果。圖 6 至 9 顯示分別用模擬表位Jft 4011-4018，4019-4025，4031-4038 和 4061-4064 實(shí)施的抑制測(cè)定法的結(jié)果。圖10顯示單克隆抗體MV-001對(duì)特定肽和重組蛋白的結(jié)合；圖11顯示單克隆抗體MV-003對(duì)特定肽和重組蛋白的結(jié)合；圖12顯示單克隆抗體MV-004對(duì)特定肽和重組蛋白的結(jié)合；圖13顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白 片段的模擬表位進(jìn)行的典型結(jié)合測(cè)定法；圖14顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白 片段的模擬表位進(jìn)行的典型抑制測(cè)定法；圖15顯示通過(guò)模擬表位免疫接種(注射的肽/無(wú)關(guān)的肽)引發(fā)的免疫應(yīng)答的體 內(nèi)表征的例子；
圖16顯示通過(guò)針對(duì)淀粉樣蛋白β片段的模擬表位免疫接種引發(fā)的免疫應(yīng)答的體 內(nèi)表征的例子；圖17顯示通過(guò)針對(duì)全長(zhǎng)的模擬表位免疫接種引發(fā)的免疫應(yīng)答的體內(nèi)表征的例子圖18顯示被淀粉狀蛋白斑占據(jù)的面積。以一個(gè)月間隔通過(guò)8.(接種給182576注 射6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的模擬表位疫苗。對(duì)照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉狀 蛋白斑占據(jù)的面積顯示為對(duì)照組的百分比。Grl...對(duì)照組；Gr2...接受p4381 ;Gr3...接 受 p4390 ；Gr4...接受 p4715。圖19顯示被淀粉狀蛋白斑占據(jù)的面積。以一個(gè)月間隔通過(guò)8.(接種給182576注 射6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的AFFIT0PE疫苗。對(duì)照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉 狀蛋白斑占據(jù)的面積顯示為對(duì)照組的百分比。Grl...對(duì)照組；Gr2...接受p4395。圖20顯示單克隆抗體MV-002對(duì)特定肽和重組蛋白的結(jié)合。圖21顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白 片段的模擬表位進(jìn)行的典型結(jié)合測(cè)定法。圖22顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白 片段的模擬表位進(jìn)行的典型抑制測(cè)定法。圖23顯示通過(guò)模擬表位免疫接種(注射的肽/無(wú)關(guān)的肽)引發(fā)的免疫應(yīng)答的體 內(nèi)表征的例子。圖M顯示通過(guò)針對(duì)淀粉樣蛋白β片段和sAPPa的模擬表位免疫接種引發(fā)的免 疫應(yīng)答的體內(nèi)表征的例子。圖25顯示通過(guò)針對(duì)全長(zhǎng)A β 40/42的模擬表位免疫接種引發(fā)的免疫應(yīng)答的體內(nèi)表 征的例子。圖沈顯示被淀粉狀蛋白斑占據(jù)的面積。以一個(gè)月間隔通過(guò)s. c接種給Tg2576注 射6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的模擬表位疫苗。對(duì)照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉 狀蛋白斑占據(jù)的面積顯示為對(duì)照組的百分比。Grl...對(duì)照組；Gr2...接受p4675。圖27顯示a-突觸核蛋白陽(yáng)性內(nèi)含體。A.對(duì)照處理動(dòng)物；B. AD模擬表位處理動(dòng) 物；A和B展示對(duì)a-突觸核蛋白染色的皮質(zhì)切片。陽(yáng)性染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞，包括椎體和非 椎體神經(jīng)元。箭頭指示A和B中內(nèi)含體的兩個(gè)典型例子。C.皮質(zhì)和海馬(作為皮質(zhì)指示) 中的內(nèi)含體的數(shù)目。圖觀顯示神經(jīng)元密度。圖片展示對(duì)NeuN染色的皮質(zhì)切片。陽(yáng)性染色顯示神經(jīng)元 細(xì)胞，包括椎體和非椎體神經(jīng)元。A.指示對(duì)照處理動(dòng)物；B.顯示AD模擬表位處理動(dòng)物。C 和D.顯示皮質(zhì)和海馬中NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目。
實(shí)施例實(shí)施例1:生成單克隆抗體(mAb)，以檢測(cè)帶游離N端(無(wú)N端天冬氨酸)的由 A β 42衍生的肽物質(zhì)給小鼠免疫接種在CFA(第一次注射)和IFA(強(qiáng)化注射)中乳化的連接至蛋白 質(zhì)牛血清清蛋白BSA(以利用半抗原-載體效應(yīng))的6聚物肽DAEFRH(天然N端Αβ 42序 列)。通過(guò)ELISA (經(jīng)DAEFRH肽包被的ELISA板)來(lái)檢測(cè)DAEFRH肽特異性、抗體生成性雜 交瘤。肽SEVKMDAEFRH(天然N端延長(zhǎng)序列，APP衍生的，含有A β 42衍生序列DAEFRH)用作陰性對(duì)照肽排除識(shí)別延長(zhǎng)肽的雜交瘤，因?yàn)樗鼈儾粎^(qū)分在N端帶游離天冬氨酸的A β 42 衍生肽與不含游離天冬氨酸的APP衍生肽DAEFRH。實(shí)施例2 通過(guò)抑制測(cè)定法來(lái)鑒定模擬表位3. 1.文庫(kù)抑制測(cè)定法(見下文)中采用的肽文庫(kù)披露于WO 2004/062556。3.2.抑制測(cè)定法圖2和3描述用5個(gè)文庫(kù)(如WO 2004/062556中記載的)中包括的及自其獲得 的模擬表位肽實(shí)施的抑制測(cè)定法的結(jié)果。模擬表位肽與初始表位競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體的識(shí)別。 初始表位和模擬表位肽在C端含有一個(gè)額外的C供偶聯(lián)至蛋白質(zhì)載體(如果想要的話)。使用下面的肽肽1737肽3001肽3002肽3003肽3004肽3005肽3006肽3007肽3008肽3009月太3010月太3011操作過(guò)程將ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH (C端用C延長(zhǎng)并偶聯(lián)至牛血清 清蛋白BSA)以0. 1 μ g/ml肽-BSA的濃度包被(100 μ 1/孔，12h，4°C )。用PBS/BSA 封閉 后(200μ 1/孔，12h，4°C)，將板用PBS/Tween清洗3次。然后，于37°C添加生物素化的單克 隆抗體(1 2000，50 μ 1/孔)和肽(50 μ 1/孔)以 50，5，0. 5，0. 05，0. 005，和 0. 0005 μ g/ ml，放置20分鐘。將板用PBS/Tween清洗3次，并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親 合素一起溫育(100 μ 1/孔，30min, RT)。將板用PBS/Tween清洗5次，并與ABTS+H202 一起 溫育(0. 1 % w/v, 10-45min)，并用檸檬酸終止反應(yīng)，接著進(jìn)行光度法評(píng)估(波長(zhǎng)405nm)。正如預(yù)期的及在圖2中看到的，肽1737DAEFRH能與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH 競(jìng)爭(zhēng)，并因此抑制單克隆抗體的識(shí)別。另外，顯示了肽3003不能抑制單克隆抗體結(jié)合初始 表位。相反，肽3001，3002，3004，3005，3006，和3007(不同程度地)阻斷表位識(shí)別。雖然 肽3004只在高濃度(50 μ g/ml)時(shí)是抑制性的，但是肽3001，3006，和3007是強(qiáng)抑制性的， IC50 小于 0. 5 μ g/ml。肽 3002 和 3005 是“中等”抑制劑，IC50 大于 0. 5 μ g/ml。正如預(yù)期的及在圖3中看到的，肽1737DAEFRH在另外實(shí)施的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中能成功地 與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體識(shí)別。另外，顯示了肽3010和3011在所測(cè) 試的濃度不是抑制性的，而肽3008和3009是(相對(duì))弱抑制劑，IC50小于5 μ g/ml。表1簡(jiǎn)要地總結(jié)了文庫(kù)(如記載的)中包括的及自其獲得的模擬表位的抑制能
DAEFRH DKELRI DffELRI YREFFI YREFRI YAEFRG EAEFRG DYEFRG ELEFRG SFEFRG DISFRG DIGffRG力
0139]表1模擬表位的抑制能力0140]肽3001DKELRI強(qiáng)0141]肽3002DffELRI中等0142]肽3003YREFFI無(wú)0143]肽3004YREFRI弱0144]肽3005YAEFRG中等0145]肽3006EAEFRG強(qiáng)0146]肽3007DYEFRG強(qiáng)0147]肽3008ELEFRG弱0148]肽3009SFEFRG弱0149]肽3010DISFRG無(wú)0150]肽3011DIGffRG無(wú)
0151]實(shí)施例3 本發(fā)明篩選的其它模擬表位的抑制測(cè)定法
0152]抑制測(cè)定法
0153]圖4和5描述用如WO 2004/062556中記載的5個(gè)文庫(kù)中包括的及自其獲得的模 擬表位肽實(shí)施的抑制測(cè)定法的結(jié)果。模擬表位肽與初始表位競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體的識(shí)別。初始 表位和模擬表位肽在C端(位置7)含有一個(gè)額外的C供偶聯(lián)至蛋白質(zhì)載體(如果想要的 話)°使用下面的肽肽1737 DAEFRH (初始表位+C)肽1234 KKELRI肽1235 DRELRI肽1236 DKELKI肽1237 DRELKI肽1238 DKELR肽1239 EYEFRG肽1241 DffEFRDA肽4002 SffEFRT肽4003 GREFRN肽4004 WHWSffR操作過(guò)程將ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH(C端用C延長(zhǎng)并偶聯(lián)至牛血 清清蛋白 BSA)以 0. 1 μ g/ml 肽-BSA 的濃度包被(100 μ 1/ 孔，12h，4°C )。用 PBS/BSA 1 % 封閉后00(^1/孔，1池，4°0，將板用？85/1^擾11清洗3次。然后，生物素化的單克隆抗體 (1 2000，50μ 1/孔)和肽(50μ 1/孔)以不同濃度于37°C添加，放置20分鐘。將板用 PBS/Tween清洗3次，并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親合素一起溫育(100 μ 1/孔， 30min，RT)。將板用 PBS/Tween 清洗 5 次，并與 ABTS+H202 一起溫育(0. 1 % w/v，10_45min)， 并用檸檬酸終止反應(yīng)，接著進(jìn)行光度法評(píng)估(波長(zhǎng)405nm)。
正如預(yù)期的及在圖4中看到的，肽1737DAEFRH能與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH 競(jìng)爭(zhēng)，并因此抑制單克隆抗體的識(shí)別。另外，顯示了肽4004不能抑制單克隆抗體結(jié)合初始 表位。相反，肽4002和4003(不同程度地)阻斷表位識(shí)別。雖然肽4003只在相對(duì)較高濃 度(10μ g/ml)時(shí)是抑制性的，但是肽4002是強(qiáng)抑制性的，IC50小于0. 4μ g/ml。正如預(yù)期的及在圖5中看到的，肽1737DAEFRH在另外實(shí)施的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中能成功地 與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體的識(shí)別。另外，顯示了肽1234在所測(cè)試的濃 度是強(qiáng)抑制性的，而肽1235，1236，1237，1238，1239和1241 (不同程度地)阻斷表位識(shí)別。 肽1235，1238和1241是強(qiáng)抑制劑，IC5tl小于0. 5 μ g/ml，而肽1236和1237是(相對(duì))較弱 抑制劑，IC50大于5 μ g/ml。肽1239是中等抑制劑，IC50大于0. 5 μ g/ml。表2簡(jiǎn)要地總結(jié)了文庫(kù)(如記載的)中包括的及自其獲得的模擬表位的抑制能 力表2 模擬表位的抑制能力
0172]肽1234KKELRI無(wú)0173]肽1235DRELRI強(qiáng)0174]肽1236DKELKI弱0175]肽1237DRELKI弱0176]肽1238DKELR強(qiáng)0177]肽1239EYEFRG中等0178]肽1241DffEFRDA強(qiáng)0179]肽4002SffEFRT強(qiáng)0180]肽4003GREFRN弱0181]肽4004WHWSffR無(wú)圖4和5中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，除了各種6聚物肽(如這里和之前顯示的)之外，5 聚物肽(即肽1238DKELR)和7聚物肽(即肽1241DWEFRDA)可用作基于模擬表位的阿爾茨 海默氏病疫苗中的表位。實(shí)施例4 本發(fā)明的和WO 2006/005707中披露的模擬表位的抑制測(cè)定法文庫(kù)如TO 2006/005707中所述獲得模擬表位。下面的測(cè)定法使用下面的肽肽1737DAEFRH初始表位
肽4011DAEFRffP7聚物S
肽4012DNEFRSP7聚物S
肽4013GSEFRDY7聚物m
肽4014GAEFRFT7聚物m
肽4015SAEFRTQ7聚物S
肽4016SAEFRAT7聚物S
肽4017SWEFRNP7聚物S
肽4018SWEFRLY7聚物S
肽4019SWFRNP6聚物-
肽4020SWELRQA7聚物S
肽4021SVEFRYH7聚物S
肽4022SYEFRHH7聚物S
肽4023SQEFRTP7聚物S
肽4024SSEFRVS7聚物S
肽4025DWEFRD6聚物S
肽4031DAELRY6聚物S
肽4032DWELRQ6聚物S
肽4033SLEFRF6聚物S
肽4034GPEFRff6聚物S
肽4035GKEFRT6聚物S
肽4036AYEFRH6聚物m
肽4037VPTSALA7聚物-
肽4038ATYAYffN7聚物-
另外，抑制測(cè)定法使用下面的5聚物肽(具有非天然氨基酸)
肽4061DKE(tBuGly)R 5 聚物-
肽4062DKE (Nle)R5聚物m
肽4063DKE(Nva)R5聚物m
肽4064DKE((Cha)R5聚物m(s 強(qiáng)抑制，m 中等抑制；-無(wú)抑制)操作過(guò)程將ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH(C端用C延長(zhǎng)并偶聯(lián)至牛血 清清蛋白 BSA)以 0. 1 μ g/ml 肽-BSA 的濃度包被(100 μ 1/ 孔，12h，4°C )。用 PBS/BSA 1 % 封閉后00(^1/孔，1池，4°0，將板用？85/1^擾11清洗3次。然后，生物素化的單克隆抗體 (1 2000，50μ 1/孔)和肽(50μ 1/孔)以不同濃度于37°C添加，放置20分鐘。將板用 PBS/Tween清洗3次，并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親合素一起溫育(100 μ 1/孔， 30min，RT)。將板用 PBS/Tween 清洗 5 次，并與 ABTS+H202 一起溫育(0. 1 % w/v，10_45min)， 并用檸檬酸終止反應(yīng)，接著進(jìn)行光度法評(píng)估(波長(zhǎng)405nm)。正如預(yù)期的及在圖6 (顯示肽4011-4018)中看到的，肽1737DAEFRH能與 板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH競(jìng)爭(zhēng)，并因此抑制單克隆抗體的識(shí)別。另外，顯示了肽 4012DNEFRSP，4013GSEFRDY，和4014GAEFRFT能中等抑制單克隆抗體結(jié)合初始表位。相反， 肽 4011DAEFRWP，4015SAEFRTQ，4016SAEFRAT，4017STOFRNP，和 401SSTOFRLY (不同程度地) 強(qiáng)烈阻斷表位識(shí)別。正如預(yù)期的及在圖7(顯示肽4019-4025)中呈現(xiàn)的，肽1737DAEFRH在另外實(shí)施 的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中能成功地與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體的識(shí)別。另外， 顯示了肽4019SWFRNP在所測(cè)試的濃度不是抑制性的，而肽4020SWELRQA，4021SVEFRYH， 4022SYEFRHH, 4023SQEFRTP, 4024SSERFVS 和 4025DWEFRD (不同程度地)阻斷表位識(shí)別。肽 4021，4022，4023，4024和4025是強(qiáng)抑制劑，IC50小于0. 5 μ g/ml，而肽4020是中等抑制劑， IC5。大于 0.5 μ g/ml。
16
正如預(yù)期的及在圖8(肽4031-4038)中看到的，肽1737DAEFRH在第三個(gè)獨(dú)立 的實(shí)驗(yàn)中能成功地與板結(jié)合型BSA偶聯(lián)肽DAEFRH競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體識(shí)別。另外，顯示 了肽4037VPTSALA和4038ATYAYWN在所測(cè)試的濃度不是抑制性的，而肽4031DAELRY， 4032DWELRQ, 4033SLEFRF, 4034GPEFRW, 4035GKEFRT 和 4036AYEFRH(不同程度地)阻斷表位 識(shí)別。肽4031，4032，4033，4034和4035是相對(duì)較強(qiáng)抑制劑，IC50小于0. 5 μ g/ml，而肽4036 是(相對(duì))較弱抑制劑，IC50大于0. 5 μ g/ml。在下面的表中，描述了通過(guò)使用AD模擬表位引發(fā)的免疫應(yīng)答的其它例子。表1中 列出的所有肽都引起針對(duì)全長(zhǎng)Αβ和/或其片段的特異性免疫反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種化合物，包含用于治療、預(yù)防和/或改善帕金森氏病運(yùn)動(dòng)癥狀的肽，所述肽能結(jié) 合特異于淀粉樣蛋白β肽(Αβ)的表位的抗體。
2.依照權(quán)利要求1的化合物，其特征在于所述淀粉樣蛋白β肽的表位選自下組 DAEFRH, EFRHDSGY, pEFRHDSGY, EVHHQKL, HQKLVF 和 HQKLVFFAED。
3.依照權(quán)利要求1或2的化合物，其特征在于所述肽不具有氨基酸序列DAEFRH， EFRHDSGY, pEFRHDSGY, EVHHQKL, HQKLVF 和 HQKLVFFAED。
4.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 X1X2X3X4X5X6X7, (式I)其中&為G或具有羥基的氨基酸或帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選甘氨酸(G)，谷氨酸(E)， 酪氨酸(Y)，絲氨酸( 或天冬氨酸(D)，&為疏水性的氨基酸或帶正電荷的氨基酸，優(yōu)選天冬酰胺(N)，異亮氨酸(I)，亮氨酸 (L)，纈氨酸(V)，賴氨酸(K)，色氨酸(W)，精氨酸(R)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或丙氨酸 (A),&為帶負(fù)電荷的氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，&為芳香族的氨基酸或疏水性的氨基酸或亮氨酸(L)，優(yōu)選酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F) 或亮氨酸(L)，X5為組氨酸(H)，賴氨酸(K)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或精氨酸( ，優(yōu)選組氨酸(H)， 苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，且X6不存在或?yàn)榻z氨酸( ，蘇氨酸(T)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，谷氨 酸(E)，精氨酸(R)，異亮氨酸(I)，賴氨酸(K)，酪氨酸(Y)，或甘氨酸(G)，優(yōu)選蘇氨酸(T)， 天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，精氨酸(R)，異亮氨酸(I)或甘氨酸(G)，X7不存在或?yàn)槿魏伟被?，?yōu)選脯氨酸(P)，酪氨酸(Y)，蘇氨酸(T)，谷氨酰胺⑴)，丙 氨酸(A)，組氨酸(H)或絲氨酸(S)，優(yōu)選 EIDYHR， ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DI-DYRR， DLDYRR, DVDYRR, DKELRI，DffELRI，YREFFI，YREFRI，YAEFRG,EAEFRG,DYEFRG,ELEFRG,DRELRI，DKELKI，DRELKI， GREFRN, EYEFRG, DffEFRDA, SffEFRT, DKELR, SFEFRG, DAEFRffP, DNEFRSP, GSEFRDY, GAEFRFT, SAEFRTQ, SAEFRAT, SffEFRNP, SffEFRLY, SffELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, SSEFRVS, DffEFRD, DAELRY, DffELRQ, SLEFRF, GPEFRff, GKEFRT, AYEFRH, DKE(Nle)R, DKE(Nva)R 或 DKE(Cha)R。
5.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)0,(式 II)，其中&為異亮氨酸⑴或纈氨酸(V)， X2為色氨酸(W)或酪氨酸⑴，X3為蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)，丙氨酸(A)，甲硫氨酸(M)，谷氨酰胺(Q)或甘氨酸(G)， X4為脯氨酸(P)，丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)，絲氨酸(S)，半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)， X5為脯氨酸(P)，亮氨酸(L)，甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)， X6為半胱氨酸(C)， 11，111和0獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選 IRWDTP(C)， VRffDVYP(C)， IRYDAPL(C)， IRYDMAG(C)， IRffDTSL(C)， IRffDQP(C)，IRffDG (C)或 IRWDGG(C)。
6.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 EX1WHX2X3(X4)n(X5)m(式 III)，其中&為纈氨酸(V)，精氨酸(R)或亮氨酸(L)， X2為精氨酸(R)或谷氨酸(E)，X3為丙氨酸(A)，組氨酸(H)，賴氨酸(K)，亮氨酸(L)，酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)， )(4為脯氨酸(P)，組氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸 X5為半胱氨酸(C)， η和m獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選 EVWHRHQ(C)，ERffHEKH(C)，EVffHRLQ (C)，ELffHRYP (C)，ELffHRAF (C)，ELffHRA(C)， EVffHRG(C), EVffHRH(C)禾口 ERWHEK(C)，優(yōu)選 EVWHRHQ(C)，ERffHEKH(C), EVffHRLQ(C), ELffHRYP(C)或 ELWHRAF(C)。
7.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列QDFRHY(C)， SEFKHG (C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY (C), LMFRHN(C), SAFRHH(C)， LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C) , QFKHDL(C), NffFPHP(C), EEFKYS (C), NELRHST(C), GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)， EDffFFffH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)， ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)， QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)， SAMRHSL(C)，TPLMFffH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)， AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)， EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)， TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH, SEFKH(C)，(C)HEFRH 或 HEFRH(C)。
8.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 (X1)mGX2X3X4FX5X6(X7)n(式 IV)，其中&為絲氨酸(S)，丙氨酸㈧或半胱氨酸(c)，&為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)， X3為異亮氨酸(I)，酪氨酸(Y)，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，X4為亮氨酸(L)，精氨酸( ，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，纈氨酸(V)，組氨酸(H)，酪氨 酸(Y)，異亮氨酸(I)，賴氨酸(K)，甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，X5為丙氨酸㈧，苯丙氨酸(F)，組氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)，谷氨酸(E)，異 亮氨酸(I)，谷氨酰胺⑴)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G) X6為任何氨基酸殘基， X7為半胱氨酸(C)， m和η獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選 SGEYVFH(C)，SGQLKFP (C)，SGQIffFR (C)，SGEIHFN(C)，GQIffFIS(C)，GQIIFQS (C)， GQIRFDH (C)，GEMWFAL (C)，GELQFPP (C)，GELffFP (C)，GEMQFFI (C)，GELYFRA (C)，GEIRFAL (C)， GMIVFPH(C)，GEIffFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，GSLFFffP(C)， GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C), GEIQFGA(C), GELFFEK(C), GEIRFEL(C), GEIYFER(C), SGEIYFER(C), AGEIYFER(C)或(C)GEIYFER。
9.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 (X1)mHX2X3X4X5FX6(X7)n(式 V)，其中&為絲氨酸⑶，蘇氨酸⑴或半胱氨酸(C)， X2為谷氨酰胺(Q)，蘇氨酸⑴或甲硫氨酸(M)， X3為賴氨酸⑷或精氨酸(R)， X4為亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，X5為色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或異亮氨酸(I)， &為天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)， X7為半胱氨酸(C)， η和m獨(dú)立地為0或1，優(yōu)選 SHTRLYF (C)，HMRLFFN (C)，SHQRLffF (C)，HQKMIFA (C)，HMRMYFE (C)，THQRLffF (C)或 HQKMIF(C)。
10.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列 AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)，QLPLFVL(C)或 NDAKIVF(C)。
11.依照權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的化合物，其特征在于該化合物為多肽且包含4-30個(gè)氨基酸殘基。
12.依照權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的化合物，其特征在于該化合物偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載 體，優(yōu)選KLH(匙孔i威血藍(lán)蛋白)。
13.依照權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的化合物，其特征在于該化合物為皮下，皮內(nèi)，或肌肉內(nèi) 施用而配制。
14.依照權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的化合物，其特征在于該化合物與佐劑，優(yōu)選氫氧化鋁 一起配制。
15.依照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的化合物，其特征在于該化合物以0.Ing至10mg，優(yōu)選 IOng至lmg，特別是IOOng至10 μ g的量包含在藥物中。
16.依照權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的化合物，其特征在于所述帕金森氏病運(yùn)動(dòng)癥狀選自下 組靜止性震顫，運(yùn)動(dòng)徐緩，強(qiáng)直，體位不穩(wěn)，彎腰體位，張力障礙，疲勞，細(xì)微運(yùn)動(dòng)靈巧性和 運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損，整體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)受損，運(yùn)動(dòng)缺乏(擺臂縮小)，靜坐不能，言語(yǔ)問(wèn)題，面部表情 喪失，寫字過(guò)小，吞咽困難，性功能障礙和流涎。
17.依照權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的化合物在制備用于治療、預(yù)防和/或改善帕金森氏病 運(yùn)動(dòng)癥狀的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含用于治療、預(yù)防和/或改善帕金森氏病運(yùn)動(dòng)癥狀的肽的化合物，所述肽能結(jié)合特異于淀粉樣蛋白β肽(Aβ)的表位的抗體。
文檔編號(hào)A61P25/16GK102123726SQ200980131367
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者弗蘭克·馬特納, 沃爾特·施密特, 馬庫(kù)斯·曼德勒 申請(qǐng)人:阿費(fèi)里斯股份公司