一種胎盤多能干細胞提取制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種胎盤多能干細胞提取方法，包括以下步驟：無菌條件下獲取胎盤組織，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗、碘伏消毒、生理鹽水充分沖洗胎盤，至少三次；將胎盤組織剪成1×1×1mm3碎片，置于無菌離心管中，利用0.25％胰蛋白酶和0.2％Ⅳ型膠原酶消化胎盤組織碎片，離心收集得細胞沉淀，將細胞沉淀重懸于含體積分數(shù)為10％的胎牛血清α?MEM培養(yǎng)基，常規(guī)方法凍存；流式細胞學(xué)分析：CD73、CD90和CD105細胞表達。本發(fā)明在無菌條件下獲取胎盤，接著對胎盤進行PBS反復(fù)沖洗、胎盤表面消毒、生理鹽水沖洗胎盤一系列預(yù)處理，保證獲取的胎盤新鮮，便于保證胎盤組織中多能干細胞的活性。
【專利說明】
一種胎盤多能干細胞提取制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胎盤多能干細胞提取制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細胞可自我更新，并且能夠分化為各種細胞系。這些細胞可分為胚胎干細胞(ESC)和非胚胎干細胞或成體干細胞(ASC)。后者不能再分化為各種組織(多能的)，并且其增殖速度低于胚胎干細胞。因此，胚胎干細胞的應(yīng)用性優(yōu)于成體干細胞的應(yīng)用性。對動物和人類的初步研究表明，可以通過移植在體外培養(yǎng)的干細胞，可緩解某些疾病的癥狀，例如糖尿病、帕金森氏病、肝功能衰竭和充血性心力衰竭。然而，由于諸多原因，例如伴隨人類胚胎干細胞的使用而產(chǎn)生的倫理問題，以及我們對該領(lǐng)域的極為有限的知識，該領(lǐng)域進展緩慢。由于上述缺點，人們已經(jīng)開始使用來自人類骨髓的成體干細胞治療某些癌癥，例如血癌(白血病)。然而，因為需要侵入式的外科手術(shù)、大量專家和專業(yè)中心，這一療法并不能被系統(tǒng)地應(yīng)用，并且仍然取決于臨床醫(yī)生的意愿。一些研究者正開發(fā)細胞療法，該療法基于分離自臍帶的干細胞。然而，從臍帶中所能提取的干細胞數(shù)量相當(dāng)少，這使得這一過程漫長而昂貴。此外，分離自臍帶的干細胞并不能與每一位受體免疫系統(tǒng)相容，這會引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致移植排斥。
[0003]胎盤中含有多種干細胞，包括間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、內(nèi)皮干細胞和未知功能的多潛能干細胞等。
[0004]間充質(zhì)干細胞，英文名稱為mesenchymal stem cells(MSC)，也有其它名稱，如骨髓基質(zhì)細胞、脂肪干細胞、多潛能基質(zhì)細胞等，是指單個或一群符合國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的細胞。間充質(zhì)干細胞存在于多種組織和器官中，包括骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、腦、骨質(zhì)等，體內(nèi)外均具有向骨、軟骨和脂肪組織分化的能力，具有免疫調(diào)節(jié)、造血支持、促血管新生等作用。
[0005]造血干細胞是指尚未發(fā)育成熟的細胞，是所有造血細胞和免疫細胞的起源，它不僅可以分化為紅細胞、白細胞、和血小板，還可以跨系統(tǒng)分化為各種組織器官的細胞，具有自我更新多向分化和歸巢潛能。一般造血干細胞來源于三個渠道:骨髓造血干細胞;外周血造血干細胞;臍帶血造血干細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種胎盤多能干細胞提取制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]—種胎盤多能干細胞提取方法，包括以下步驟:
[0009](I)預(yù)處理:無菌條件下獲取胎盤組織，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗，去除胎盤血，使用碘伏消毒臍帶及胎盤表面;生理鹽水充分沖洗殘留臍帶和胎盤，至少三次；
[0010](2)胎盤多能干細胞分離培養(yǎng):將胎盤組織剪成I X I X Imm3碎片，將胎盤組織碎片置于無菌離心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型膠原酶消化胎盤組織碎片，去除組織留取消化液，離心收集得細胞沉淀，將細胞沉淀重懸于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清α-ΜΕΜ培養(yǎng)基，在37°C，體積分數(shù)為5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)60h后半量換液，去除未貼壁細胞，每5天換液一次，常規(guī)方法凍存；
[0011](3)免疫表達:流式細胞學(xué)分析:⑶73、⑶90和⑶105細胞表達。
[0012]所述步驟(2)胎盤組織碎片在37°C溫度下消化30min。
[0013]所述步驟(2)離心條件為:1500r/min，離心5min。
[0014]所述步驟(2)中0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型膠原酶的體積比為1:1。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明在無菌條件下獲取胎盤，接著對胎盤進行PBS反復(fù)沖洗、胎盤表面消毒、生理鹽水沖洗胎盤一系列預(yù)處理，保證獲取的胎盤新鮮，便于保證胎盤組織中多能干細胞的活性，利用0.25%胰蛋白酶和0.1 %1型膠原酶消化胎盤組織碎片，多能干細胞的分離效率高。
【具體實施方式】
[0016]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0017]實施例1
[0018]配制D-Hanks液:800ml新鮮制作的三蒸水中，依次加入氯化鈉8.00g、氯化鉀0.40g、磷酸氫二鈉0.06g、磷酸二氫鉀0.06g、碳酸氫鈉0.35g，苯酸紅0.02g，完全溶解后不足雙蒸水至100ml，測定pH7.2-7.4，分裝250ml玻璃瓶，高壓滅菌20min，室溫冷卻，4°C保存，用時加熱至37°C。
[0019]配制胰蛋白酶液:稱取胰蛋白酶250mg，EDTA20mg ；取80mlD_Hanks液，將胰蛋白酶完全溶解，補加D-Hanks液至10ml，并加入EDTA溶液溶解，其終濃度為0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液，用0.Ium的慮器抽濾除菌置于4°C冰箱備用。
[°02°] 配制IV型膠原酶:取膠原酶IV型原液0.2ml，加入D-Hanks液至10ml，用0.1um的濾器抽濾除菌，置于4 °C冰箱備用。
[0021]—種胎盤多能干細胞提取方法，包括以下步驟:
[0022](I)預(yù)處理:無菌條件下獲取胎盤組織，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗，去除胎盤血，使用碘伏消毒臍帶及胎盤表面;生理鹽水充分沖洗殘留臍帶和胎盤，至少三次；
[0023](2)胎盤多能干細胞分離培養(yǎng):將胎盤組織剪成I X I X Imm3碎片，將胎盤組織碎片置于無菌離心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型膠原酶消化胎盤組織碎片，0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型膠原酶的體積比為1:1，37°C溫度下消化30min，去除組織留取消化液，離心收集得細胞沉淀，離心條件為:1500r/min，離心5min，將細胞沉淀重懸于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清α-ΜΕΜ培養(yǎng)基，在37 V，體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)60h后半量換液，去除未貼壁細胞，每5天換液一次，常規(guī)方法凍存；
[0024](3)免疫表達:流式細胞學(xué)分析:⑶73、⑶90和⑶105細胞表達。
[0025]在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0026]以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的【具體實施方式】。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。
【主權(quán)項】
1.一種胎盤多能干細胞提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)預(yù)處理:無菌條件下獲取胎盤組織，經(jīng)PBS反復(fù)沖洗，去除胎盤血，使用碘伏消毒臍帶及胎盤表面;生理鹽水充分沖洗殘留臍帶和胎盤，至少三次； (2)胎盤多能干細胞分離培養(yǎng):將胎盤組織剪成IX I X Imm3碎片，將胎盤組織碎片置于無菌離心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型膠原酶消化胎盤組織碎片，去除組織留取消化液，離心收集得細胞沉淀，將細胞沉淀重懸于含體積分數(shù)為10 %的胎牛血清α-ΜΕΜ培養(yǎng)基，在37 0C，體積分數(shù)為5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)60h后半量換液，去除未貼壁細胞，每5天換液一次，常規(guī)方法凍存； (3)免疫表達:流式細胞學(xué)分析:⑶73、⑶90和⑶105細胞表達。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤多能干細胞提取方法，其特征在于，所述步驟(2)胎盤組織碎片在37°C溫度下消化30min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤多能干細胞提取方法，其特征在于，所述步驟(2)離心條件為:1500r/min，離心5min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤多能干細胞提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中.0.25%胰蛋白酶和0.2% IV型膠原酶的體積比為1:1。
【文檔編號】C12N5/073GK105969722SQ201610570529
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】張正亮
【申請人】安徽惠恩生物科技股份有限公司