專利名稱：特異于流感病毒h5亞型或者n1亞型的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)和治療禽流感病毒(“AIV”)的抗體和相關(guān)的結(jié)合蛋白。更具體 地，本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)和治療AIV的高致病性H5和m亞型的單克隆抗體及相關(guān)的結(jié) 合蛋白，以及涉及診斷、監(jiān)視和治療動(dòng)物和人體內(nèi)AIV感染的方法和產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
H5W禽流感病毒也許成為下一次流感流行的原因。每年甲型流感感染的爆發(fā)是持 續(xù)的公共健康威脅，新的流感毒株可以周期性呈現(xiàn)，人對(duì)于其具有較低的免疫性，導(dǎo)致破壞 性流行。1918年由Hmi流感病毒引起的“西班牙流感”爆發(fā)導(dǎo)致世界范圍內(nèi)超過(guò)4千萬(wàn)人 死亡。Hmi的來(lái)源也許是從鳥類直接傳染人，或者也許潛伏于中間宿主如豬或者仍未鑒別 的另一動(dòng)物宿主中(1)(在本文結(jié)尾處提供參考書目)。分別由H2N2和H3N2流感病毒引起 的1957年和1968年流感流行，可能源自重配事件(reassortment)，其中一或兩種適應(yīng)人的 病毒表面蛋白由禽流感毒株的蛋白質(zhì)置換(2)。H5m病毒具有感染史無(wú)前例范圍的宿主的能力，包括食肉動(dòng)物。1997年證實(shí)第 一例感染的人。高致病性H5m感染在禽類和人類中均發(fā)生。這是已發(fā)現(xiàn)的首次禽流感病 毒從鳥類直接傳播至人類。之后，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告，人H5m感染病例總數(shù)從 2003年在東南亞開始爆發(fā)至今已經(jīng)有281例，死亡169例。印度尼西亞在2005年6月報(bào)道 其首例人H5W病毒所致禽流感病例。迄今為止，這是唯一一個(gè)給出2007年報(bào)道的國(guó)家，截 至2007年3月共81例證實(shí)的人感染病例，其中63例死亡。流感病毒根據(jù)其核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原特異性分類。這些病毒主要被分為A、B 和C血清型，A型具有8個(gè)RNA節(jié)段，其編碼十個(gè)病毒蛋白。所有已知的A型流感病毒均源 自鳥類。這個(gè)類別的病毒可以感染其它物種，如馬、豬、貓頭鷹和海豹，并且對(duì)人類造成威 脅(23)。根據(jù)包膜糖蛋白的抗原性性質(zhì)，可以將A型流感病毒進(jìn)一步分為亞型，根據(jù)血凝 素(“HA”)分為Hl至H16亞型，根據(jù)神經(jīng)氨酸酶(“NA”)分為Nl至N9亞型(24，25，26)。 據(jù)信在HA1-HA2連接處的HA蛋白質(zhì)的蛋白酶解與禽流感毒株的病原性相關(guān)，而且在這個(gè)裂 解位點(diǎn)周圍疏水性氨基酸的存在是H5亞型的特點(diǎn)。此外，據(jù)信HA蛋白質(zhì)介導(dǎo)與宿主細(xì)胞 sialoside受體附著，隨后通過(guò)膜融合進(jìn)入細(xì)胞(27)，HA蛋白質(zhì)被認(rèn)為作為中和抗體的主 要靶位(26)。在急性呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)期間進(jìn)行檢測(cè)可以確定流感是否是爆發(fā)原因。在流感 季節(jié)，檢測(cè)呈現(xiàn)與流感一致的呼吸系統(tǒng)疾病的選擇患者可幫助確定流感是否存在于特定 患者群中，并且?guī)椭l(wèi)生保健人員確定怎樣使用其臨床判斷診斷和治療呼吸系統(tǒng)疾病?？?速流感檢測(cè)幫助確定是否使用抗病毒藥物。一些檢測(cè)如病毒培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反 應(yīng)(RT-PCR)以及血清學(xué)檢測(cè)是常規(guī)方法，但是不能及時(shí)獲得結(jié)果而為臨床醫(yī)生提供幫助 (3)。目前常用的大多數(shù)快速診斷檢測(cè)是基于單克隆抗體的免疫測(cè)定(3，4，5)。免疫熒光測(cè) 定(熒光抗體染色)是另一種快速流感病毒診斷檢測(cè)法，其可用于許多醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中，且通 ?？梢栽?-4小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果。首要的是特異性單克隆抗體產(chǎn)生是大多數(shù)常用的快速、靈敏性和有成本效益的診斷方法的基礎(chǔ)。區(qū)域性獨(dú)特的亞系的鑒別表明H5m病毒是地理學(xué)廣泛分布的，具有遺傳和抗原 性差異。種系發(fā)生學(xué)研究示出來(lái)自印尼的所有病毒形成H5m基因型Z病毒的一個(gè)獨(dú)特亞 系，提示這種爆發(fā)可能由于單一引入傳播遍及整個(gè)國(guó)家造成的(14，15)。獲得特異性識(shí)別 印尼流感分離株的單克隆抗體是非常有益的。獲得也覆蓋越南和新加坡流感分離株的這種 mAb也是非常有益的。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供特異性結(jié)合AIV的H5和m亞型的、特別是結(jié)合H5和 NlIndonesia AIV分離株的單克隆抗體(mAb)及相關(guān)的結(jié)合蛋白。單克隆抗體應(yīng)答的特異 性為有效診斷試劑提供基礎(chǔ)。衍生自其中的mAb和結(jié)合蛋白也可以用作治療劑。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了特異于H5亞型血凝素糖蛋白的線性和構(gòu)象表位或者m亞型 神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的線性和構(gòu)象表位的單克隆抗體及相關(guān)的結(jié)合蛋白。線性H5表位的mAb 能以良好的特異性和靈敏性檢測(cè)變性的樣品如福爾馬林固定的組織樣品中的H5W及其它 H5亞型病毒毒株，而靶向H5或者m構(gòu)象表位的那些mAb用于檢測(cè)未進(jìn)行預(yù)處理的組織如 冷凍組織樣品及其它生物學(xué)組織和體液中的H5m及其它m亞型病毒。H5表位的mAb和 Nl表位的mAb可以組合使用，以特異性診斷H5W病毒分離株。具體地，稱作5A5的mAb靶向H5亞型血凝素的線性表位。稱作5C5、2D9、4F8、1C1、 3B6、2F11、9C1和3H11的其它mAb靶向H5亞型血凝素的構(gòu)象表位。稱作8H12的mAb靶向 Nl亞型神經(jīng)氨酸酶的線性表位，稱作6C6和3D4的兩個(gè)抗體靶向附亞型神經(jīng)氨酸酶的構(gòu)象 表位。因此，本發(fā)明包含基本上具有如mAb 5A5對(duì)于線性H5亞型血凝素表位的免疫學(xué)結(jié)合 特性的結(jié)合蛋白，以及基本上具有如mAb 8H12對(duì)于線性m亞型神經(jīng)氨酸酶表位的免疫學(xué) 結(jié)合特性。本發(fā)明進(jìn)一步包含基本上具有如mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11 對(duì)于H5亞型血凝素構(gòu)象表位的免疫學(xué)結(jié)合特性的結(jié)合蛋白。本發(fā)明還包含基本上具有如 mAb 6C6或3D4對(duì)于m亞型神經(jīng)氨酸酶構(gòu)象表位的免疫學(xué)結(jié)合特性的結(jié)合蛋白。另一方面，本發(fā)明包含檢測(cè)樣品中H5亞型AIV的方法，包括檢測(cè)AIV與基本上具 有mAb 5々5、505、209、4 8、1(1、386、2 11、9(1或者3!111的免疫學(xué)結(jié)合特性的mAb或者結(jié)合 蛋白的結(jié)合。本發(fā)明還包含檢測(cè)樣品中附亞型AIV的方法，包括檢測(cè)AIV與基本上具有mAb 6C6、3D4或者8H12的免疫學(xué)結(jié)合特性的mAb或者結(jié)合蛋白的結(jié)合。具體地，本發(fā)明涉及利 用這種結(jié)合蛋白的免疫熒光測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定以及ELISA方法。識(shí)別H5亞型AIV的 抗體可以與識(shí)別附亞型AIV的抗體組合使用，以檢測(cè)H5W病毒。另一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)AIV的試劑盒，其包含基本上具有mAb5A5、5C5、2D9、 4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、3D4和/或6C6的免疫學(xué)結(jié)合特性的結(jié)合蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療感染H5AIV毒株如H5mAIV毒株的對(duì)象的方法，包括給予 這種對(duì)象有效量的一或多種基本上具有mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1、3H11、3D4或者6C6的 免疫學(xué)結(jié)合特性的單克隆抗體或者結(jié)合蛋白。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1D示出感染AIV H5N1的MDCK細(xì)胞與無(wú)病毒感染的MDCK細(xì)胞的IFA圖像 對(duì)比。圖IA是在MDCK細(xì)胞中檢測(cè)到H5W的圖像。在圖IB中，紫外光與正常光的合并示出由病毒感染的各個(gè)細(xì)胞與未感染細(xì)胞的對(duì)比。如圖IC所示，在無(wú)病毒感染的MDCK細(xì)胞 上無(wú)熒光信號(hào)。圖ID示出在與圖IC相同的細(xì)胞上紫外光與正常光的合并。圖2A和2B示出MDCK細(xì)胞上流感病毒的單克隆抗體中和活性。在圖2A中，在單 克隆抗體中和H5m病毒感染后用FITC熒光染色MDCK細(xì)胞。在圖2B中，用FITC熒光染色 MDCK細(xì)胞而無(wú)H5m病毒感染的單克隆抗體中和。圖3A和3B示出SDS-PAGE和蛋白印跡，用以鑒別mAb與線性化重組HAl之間的 結(jié)合。在圖3A中，在SDS-PAGE凝膠中，HAl為大約37kD，表達(dá)的GST-標(biāo)記的HAl為大約 61kD。單獨(dú)GST為26kD。在圖3B中，蛋白印跡示出重組HAl與mAB 5A5反應(yīng)。除了在61kD 的主要條帶之外還存在較小的條帶，提示當(dāng)GST-HAl在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的降解。泳道1， 無(wú)IPTG-誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌樣品；泳道2和3，大腸桿菌中IPTG-誘導(dǎo)的GST-HAl表達(dá); 泳道4，純化的GST樣品。圖4A和4B例證了 mAb 5A5的線性表位作圖。圖4A是血凝素蛋白HAl的示意圖， 示出表達(dá)不同長(zhǎng)度HAl片段的克隆構(gòu)建體以及其與mAb5A5的反應(yīng)性。圖4B是突變的血凝 素HAl片段的示意圖，示出表達(dá)HAl片段上不同突變的克隆構(gòu)建體以及其與mAb 5A5的反應(yīng)性。圖5A和5B示出mAb 6C6或3D4與表達(dá)的重組附之間的典型反應(yīng)。圖5A示出在 Sf9細(xì)胞中檢測(cè)的表達(dá)的重組m。在圖5B中，紫外光與正常光的合并示出各個(gè)細(xì)胞。圖6A和6B示出SDS-PAGE和蛋白印跡以驗(yàn)證表達(dá)的NA。圖7A、7B和7C示出MDCK細(xì)胞上流感病毒的單克隆抗體中和活性。在圖7A中，在 單克隆抗體中和H5m病毒感染之后通過(guò)顯微鏡觀測(cè)MDCK細(xì)胞。在圖7B中，在作為CPE陽(yáng) 性對(duì)照的未經(jīng)單克隆抗體中和H5W病毒感染的條件下，通過(guò)顯微鏡觀測(cè)MDCK細(xì)胞。在圖 7C中，在作為CPE陰性對(duì)照的不存在病毒和mAb的條件下示出MDCK細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及特異性結(jié)合AIV H5亞型血凝素糖蛋白或者AIV m亞型神經(jīng)氨酸酶糖 蛋白的mAb及相關(guān)的抗原結(jié)合蛋白。具體地，所述mAb或者相關(guān)的抗原結(jié)合蛋白具有如下抗 體的免疫學(xué)結(jié)合特性mAb 5A5，由在2007年7月10日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 保藏的保藏號(hào)為PTA-8528的雜交瘤5A5產(chǎn)生，mAb 5C5，由在2007年7月10日在ATCC中 保藏的保藏號(hào)為PTA-8529的雜交瘤5C5產(chǎn)生，mAb 6C6，由在2007年7月10日在ATCC中 保藏的保藏號(hào)為PTA-8526的雜交瘤6C6產(chǎn)生，mAb 2D9，由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9396的雜交瘤2D9產(chǎn)生，mAb 4F8，由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9397的雜交瘤4F8產(chǎn)生，mAb ICl，由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9398的雜交瘤ICl產(chǎn)生，mAb 3B6,由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9399的雜交瘤3B6產(chǎn)生，mAb 3D4，由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9395的雜交瘤3D4產(chǎn)生，mAb8H12,由在2008年7月29日在ATCC中保 藏的保藏號(hào)為PTA-9394的雜交瘤8H12產(chǎn)生，mAb 2F11，由在2008年7月16日在ATCC中 保藏的保藏號(hào)為PTA-9373的雜交瘤2F11產(chǎn)生，mAb 9C1，由在2008年7月16日在ATCC中 保藏的保藏號(hào)為PTA-9372的雜交瘤9C1產(chǎn)生，或mAb 3H11，由在2008年7月16日在ATCC 中保藏的保藏號(hào)為PTA-9374的雜交瘤3H11產(chǎn)生。所有保藏物均根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定 而進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步包含這些雜交瘤，且提供了本發(fā)明的mAb和結(jié)合蛋白的持續(xù)來(lái)源。
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本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)和診斷H5亞型AIV感染的方法以及包含本發(fā)明mAb或者 結(jié)合蛋白的試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)給予有效量的本發(fā)明的一或多種抗體或者相關(guān) 的結(jié)合蛋白治療H5或者NlAIV毒株感染對(duì)象的方法。具體地，在這個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì) 象感染H5W亞型AIV印尼分離株。本發(fā)明的抗體也可以作為預(yù)防措施給予處于可能發(fā)生 流感流行事件中的對(duì)象。在這種情況中，給予抗體的有效量是用于治療H5或者NlAIV感染 的量的大約一半。在本文中使用的各個(gè)術(shù)語(yǔ)具有如下含義。所有語(yǔ)法形式的術(shù)語(yǔ)mAb或者相關(guān)的結(jié)合蛋白的“免疫學(xué)結(jié)合特性”是指所述mAb 或者結(jié)合蛋白對(duì)其抗原的特異性、親和性和交叉反應(yīng)性。術(shù)語(yǔ)“線性表位”是指形成抗體結(jié)合位點(diǎn)的具有大約4-12個(gè)氨基酸的連續(xù)序列。 本發(fā)明mAb的線性表位優(yōu)選在由HAl病毒基因編碼的血凝素蛋白的大約第260至大約第 269位氨基酸的區(qū)域中。結(jié)合mAb或者結(jié)合蛋白形式的線性表位可以是變性蛋白質(zhì)，其基本 上沒(méi)有三級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)構(gòu)象表位是指在H5亞型血凝素糖蛋白或者m亞型神經(jīng)氨酸酶糖蛋白中以其 天然三維形式存在的mAb或者相關(guān)的結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)結(jié)合蛋白是指包括如下所述那些的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括本發(fā)明mAb的抗 原結(jié)合位點(diǎn)或者具有本發(fā)明mAb的免疫學(xué)結(jié)合特性的mAb的抗原結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明有利地提供了通過(guò)用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫 動(dòng)物制備具有mAb 5A5的結(jié)合特性的單克隆抗體、通過(guò)用AIV亞型H5N2 (A/chicken/ Singapore/98)免疫動(dòng)物制備具有mAb 5C5的結(jié)合特性的單克隆抗體、或者通過(guò)用AIV亞 型H7m (A/chicken/Singapore/94)免疫動(dòng)物制備具有mAb 6C6的結(jié)合特性的單克隆抗體 的方法。本發(fā)明進(jìn)一步有利地提供了通過(guò)用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免 疫動(dòng)物制備具有mAb2D9和mAb 3B6的結(jié)合特性的單克隆抗體的方法。本發(fā)明還提供了通 過(guò)用親代禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004/H5m在第205位氨基酸具有由賴氨酸突變?yōu)?甲硫氨酸的逃逸突變株免疫動(dòng)物制備具有mAb 2F11或者9C1的結(jié)合特性的單克隆抗體的 方法,或者通過(guò)用AIV亞型A/Indonesia/CDC669/2206/H5m免疫動(dòng)物制備具有mAb 3H11 的結(jié)合特性的單克隆抗體的方法。本發(fā)明另外提供了通過(guò)用AIV亞型H7W (A/chicken/ Singapore/94)免疫動(dòng)物制備具有mAb 3D4和mAb 8H12的結(jié)合特性的單克隆抗體的方法， 以及通過(guò)用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫動(dòng)物制備mAb 4F8和ICl的方 法。任何這種抗原均可用作免疫原以產(chǎn)生具有希望的免疫學(xué)結(jié)合特性的抗體。這種抗體包 括但不限于包含 mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、6C6 或者 3D4 的抗 原結(jié)合序列的單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和蛋白質(zhì)。本發(fā)明的mAb可以通過(guò)持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)產(chǎn)生。這種方 法包括但不限于最初由Kohler and Milstein(Nature 256:495-497)在1975年揭示的雜 交瘤技術(shù)，以及三源雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4:72)以及EBV-雜交瘤技術(shù)以產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc. ,pp 77-96 (1985))?？梢允褂萌丝贵w 且其可以通過(guò)使用人雜交瘤獲得(Cote et al.，1983，Proc. Nat，1. Acad. Sci. U. S. Α. ,80 2026-2030)或者通過(guò)用EBV病毒在體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞獲得(Cole et al. , 1985,Monoclonal
11Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96)。此外，可以使用產(chǎn)生“嵌合抗 體”或者“人源化抗體”的技術(shù)(Morrison et al.，1984，J. Bacteriol. 159-870 ；Neuberger et al.，1984，Nature 312:604-608 ；Takeda et al.，1985，Nature314 :452_454)，通過(guò)導(dǎo)入 來(lái)自本發(fā)明小鼠抗體分子如 mAb 5C5、5A5、6C6、2D9、4F8、1C1、3B6、3D4、8H12、2F11、9C1 或 者3H11的序列與來(lái)自具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因產(chǎn)生所述抗體。嵌合抗體 是含有人Fc部分和小鼠(或者其它非人動(dòng)物)Fv部分的那些抗體。人源化抗體是在人抗體 中摻入小鼠(或者其它非人動(dòng)物)互補(bǔ)決定簇(CDR)的那些抗體。嵌合抗體和人源化抗體 均是單克隆抗體。優(yōu)選這種人或者人源化嵌合抗體用于人類疾病的體內(nèi)診斷或者治療中。根據(jù)本發(fā)明，可以對(duì)產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4，946，778)加以調(diào)整，以提 供本發(fā)明的單鏈抗體。本發(fā)明的另一實(shí)施方案利用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(Huse et al., 1989，Science 246 1275-1281)，以快速及簡(jiǎn)便地鑒別對(duì)于本發(fā)明的抗體具有希望的特異 性的單克隆Fab片段或者其衍生物或者類似物。含有抗體分子獨(dú)特型的抗體片段可以通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這種片段包括但 不限于F(ab’)2片段，其可以通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生；Fab’片段，其可以通過(guò) 還原F (ab’)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生；以及Fab片段，其可以通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理 抗體分子而產(chǎn)生。這種抗體片段可以從本發(fā)明的任何多克隆或者單克隆抗體中產(chǎn)生。在抗體的產(chǎn)生中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)篩選希望的抗體，所述技術(shù)例如放射 免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾心”免疫測(cè)定、免疫放射測(cè)定、凝膠擴(kuò)散沉淀反 應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、原位免疫測(cè)定(例如使用膠體金、酶或者放射性同位素標(biāo)記)、蛋白印 跡、沉淀反應(yīng)、凝集試驗(yàn)(例如凝膠凝集試驗(yàn)、凝血試驗(yàn))、免疫熒光測(cè)定以及免 疫電泳測(cè) 定。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)一抗上的標(biāo)記檢測(cè)抗體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò) 檢測(cè)二抗或者其它試劑與一抗的結(jié)合檢測(cè)一抗。在再一個(gè)實(shí)施方案中，二抗是標(biāo)記的。本 領(lǐng)域已知在免疫測(cè)定中檢測(cè)結(jié)合的方式，且包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。前述抗體可用于本領(lǐng)域已知關(guān)于檢測(cè)或者定位H5或者m亞型AIV的方法中，例 如蛋白印跡、ELISA、放射性免疫測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定等。本文揭示的技 術(shù)可用于定性和定量確定H5亞型AIV，以及用于診斷和監(jiān)視病毒感染的動(dòng)物或者人。本發(fā)明還包括定性和/或定量確定H5亞型AIV的測(cè)定和檢測(cè)試劑盒。這種測(cè)定 系統(tǒng)和檢測(cè)試劑盒可包含標(biāo)記的成分，所述標(biāo)記的成分例如通過(guò)用放射性原子、熒光基團(tuán) 或者酶標(biāo)記、與本發(fā)明的mAb或者相關(guān)的結(jié)合蛋白或者其結(jié)合配體結(jié)合而制備。這種測(cè)定 或者檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步可包含試劑、稀釋劑和使用說(shuō)明書，這些為免疫測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，根據(jù)選擇的方法如“競(jìng)爭(zhēng)性”、“夾心”、“DASP”等方 法，這種試劑盒至少含有本發(fā)明的HlAb或者相關(guān)的結(jié)合蛋白、檢測(cè)所述HlAb或者相關(guān)的結(jié)合 蛋白與生物學(xué)樣品中的AIV免疫特異性結(jié)合的工具，以及使用說(shuō)明書。所述試劑盒也可以 含有陽(yáng)性和陰性對(duì)照物。它們可以被設(shè)計(jì)為與自動(dòng)分析儀或者自動(dòng)免疫組織化學(xué)玻片染色
設(shè)備一起使用。本發(fā)明的測(cè)定試劑盒可進(jìn)一步包含可以被標(biāo)記或者可以被提供用于附著于固體 支持物(或者附著于固體支持物)的二抗或者結(jié)合蛋白。這種抗體或者結(jié)合蛋白可例如是 結(jié)合AIV的抗體或結(jié)合蛋白。這種二抗或者結(jié)合蛋白可以是多克隆或者單克隆抗體。
H5亞型血凝素或者m亞型神經(jīng)氨酸酶蛋白的單克隆抗體可以通過(guò)用AIV或者其 H5或m蛋白或片段免疫動(dòng)物而制備。制備H5亞型血凝素蛋白的抗體的優(yōu)選方法是擴(kuò)增 H5亞型HAl基因，隨后表達(dá)該基因，回收并純化H5亞型重組蛋白以及將該純化的蛋白質(zhì)用 作免疫原。例如，通過(guò)用可獲得的毒株接種雞胚以增殖H5mAIV，隨后分離該病毒RNA。通 過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增HAl基因，然后將其克隆進(jìn)桿狀病毒載體中，用于 在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)H5蛋白質(zhì)。然后可將如此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)用于免疫小鼠或者其它合適物 種，以產(chǎn)生雜交瘤。相似的程序可用于獲得m蛋白質(zhì)以產(chǎn)生雜交瘤。篩選雜交瘤產(chǎn)生能特異性結(jié)合H5或m蛋白質(zhì)的高親和性mAb的能力，并將其與 其它AIV亞型區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)具有病毒中和能力的抗體能識(shí)別H5亞型血凝素蛋白 中的構(gòu)象表位。這個(gè)發(fā)現(xiàn)得自在Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞或者雞胚中1_2次選擇循 環(huán)之后在存在每種中和mAb的條件下病毒逃逸突變株的產(chǎn)生。通過(guò)RT-PCR從這些中和逃 逸突變株中克隆所述HAl基因并測(cè)序，以鑒別點(diǎn)突變。在這組抗體中，在mAb 5C5、2F11、9C1 和3H11中發(fā)現(xiàn)中和表位。使用凝血抑制試驗(yàn)證實(shí)中和逃逸能力。HAl含有338個(gè)氨基酸，包括具有16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。為了研究線性表位在蛋 白質(zhì)上的分布，有利地檢測(cè)截短的和突變的片段與mAb的結(jié)合，例如通過(guò)蛋白印跡或者相 似技術(shù)檢測(cè)?？梢澡b別線性表位，其是mAb的結(jié)合靶位，在使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè) 如在福爾馬林固定的組織中存在的變性的H5亞型蛋白中具有良好性能。以這種方式對(duì)H5 亞型mAb作圖提供了進(jìn)一步研究和更有效地臨床診斷感染性H5mAIV的平臺(tái)。本發(fā)明還提供了對(duì)于AIV H5血凝素和m神經(jīng)氨酸酶分子的抗原性結(jié)構(gòu)的更好的 了解。本發(fā)明的HlAb及相關(guān)的結(jié)合蛋白提供了在冷凍切片和生物學(xué)樣品中檢測(cè)這種高致病 性病毒的方式和方法。檢測(cè)石蠟切片中的病毒的能力具有重要意義。在大多數(shù)情況中，感染的組織切片 中的AIV抗原由于固定過(guò)程而被破壞。福爾馬林和乙醇具有除去脂質(zhì)包膜和包膜糖蛋白包 括血凝素的潛力，因此增加了病毒抗原檢測(cè)的難度。因此，本發(fā)明這種形式的診斷具有提供 更安全和更精確診斷AIV感染的動(dòng)物和人體組織的潛力。如在下文實(shí)施例中例證，mAb 5A5對(duì)于福爾馬林固定的組織中的病毒抗原是是高 效且靈敏的。這種抗體使得感染區(qū)域易于在光學(xué)顯微鏡下被觀測(cè)到?？贵w5A5不具有血 凝素抑制作用或者病毒中和活性；然而其在免疫熒光測(cè)定和蛋白印跡分析中呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié) 果，觀測(cè)到相應(yīng)于重組H5m-HA蛋白(MW 36kDa)的強(qiáng)條帶。MAb 8H12對(duì)于福爾馬林固定的組織中的病毒抗原也是高效和靈敏的。這個(gè)抗體也 使得感染區(qū)域易于在光學(xué)顯微鏡下被觀測(cè)到。相反，mAb5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 對(duì)于冷凍組織切片 是高效的，但是在福爾馬林固定的組織中未檢測(cè)到抗原。這些結(jié)果提示著兩組mAb與不同 的病毒表位反應(yīng)。通過(guò)表位作圖，確定mAb 5A5和8H12靶向線性表位。僅當(dāng)對(duì)組織進(jìn)行強(qiáng) 力熱處理時(shí)，它們可以檢測(cè)病毒抗原。在這種嚴(yán)苛的抗原提取方法中，病毒的表面蛋白被破 壞，使得病毒的核蛋白被暴露。因此，靶向線性表位的mAb對(duì)于冷凍組織切片不起作用。確定單克隆抗體5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 靶向 H5N1 病 毒的構(gòu)象表位。表位作圖用于對(duì)mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1和3H11作出這種確定；對(duì)mAb 6C6和3D4的確定是基于所述抗體不能識(shí)別來(lái)自SDS-PAGE的變性的神經(jīng)氨酸酶。這些抗體
13能結(jié)合且識(shí)別病毒抗原，而不用對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)先處理。本發(fā)明提供了檢測(cè)AIV的H5和m亞型的便利的高特異性且靈敏的方式和方法。 一種這樣的方式和方法是ELISA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，mAb5A5、5C5、2D9、4F8、lCl、3B6、 2F11、9C1和3H11單獨(dú)或者組合地用作捕獲抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mAb 5A5與5C5的組合與單獨(dú) 使用抗體或者本文所述其它組合相比在檢測(cè)H5亞型AIV中提供高光密度讀數(shù)。不受理論 的約束，對(duì)于這些結(jié)果的一種可能的解釋是這兩種抗體與HAl蛋白上的不同表位反應(yīng)且是 不同的抗體亞類，因此提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果單獨(dú)使用抗體，可以使用選擇的抗體例如作為捕獲抗體，且與辣根過(guò)氧化物 酶(HRP)綴合的相同抗體可用作檢測(cè)抗體。6C6、3D4和8H12抗體可相似地用作捕獲抗體以 檢測(cè)AIVWm亞型毒株。構(gòu)象表位的單克隆抗體保持重要的生物學(xué)功能，如凝血抑制作用和中和活性，而 針對(duì)線性表位的mAb也有利于診斷應(yīng)用。因此，使用分別針對(duì)線性和構(gòu)象表位的mAb 5A5 以及mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11，可以明顯提高ELISA方法的靈敏性。相 似地，使用分別針對(duì)附神經(jīng)氨酸酶的線性和構(gòu)象表位的mAb 8H12以及mAb 6C6和3D4，可 以明顯提高ELISA方法的靈敏性。使用兩種mAb的方法也可以用于開發(fā)檢測(cè)H5和m病毒 的其它免疫學(xué)方法，例如通過(guò)點(diǎn)_印跡(dot-blot)和原位雜交方法。本發(fā)明的優(yōu)選ELISA測(cè)試在印尼H5WAIV感染的禽類和人體中能檢測(cè)出HA抗原， 表明本發(fā)明在檢測(cè)禽和人H5M感染中的用途。本發(fā)明的H5亞型和m亞型mAb具有優(yōu)于目前作為診斷工具的其它方法的優(yōu)勢(shì)。 首先，mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1 和 3H11 對(duì)于高感染性 H5 亞型 AIV 具有高 特異性，且除了 9ClmAb之外所有mAb均示出識(shí)別所有或者幾乎所有已知的H5m印尼株。 此外，mAb6C6、3D4和8H12對(duì)于附亞型AIV是高特異性的，且可以用于診斷附亞型病毒感 染，包括所有或者幾乎所有已知的H5W印尼株。這種高特異性單克隆抗體代表禽流感診 斷領(lǐng)域的突破。在本發(fā)明之前，未報(bào)到有單克隆抗體可以檢測(cè)所有或者幾乎所有印尼H5W 病毒。而除了一種抗體之外，本發(fā)明的所有單克隆抗體均示出識(shí)別在最近兩年內(nèi)在印尼收 集的所有或者基本所有H5m病毒。MAb 6C6、3D4或者8H12可以與mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、 1C1、3B6、2F11或者3H11組合使用(一起或相繼使用)，以確認(rèn)一特定的分離株是H5W分 離株。此外，所述mAb在感染的福爾馬林固定組織以及血清學(xué)檢測(cè)如HI和IFA中檢測(cè)及精 確定位H5病毒抗原的能力呈現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。再者，這些mAb提供了檢測(cè)H5和NlAIV感染 的安全且便利的診斷方法。冷凍的切片玻片可以低溫長(zhǎng)期貯存，且便于感染的進(jìn)一步診斷 和監(jiān)視。本發(fā)明的抗體因此可用于診斷H5W感染。如下文論述，本發(fā)明的mAb也可用于治 療H5W感染。因此，本發(fā)明的mAb在遏制潛在流感流行中是非常有效的工具。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及H5禽流感的中和逃逸突變株。術(shù)語(yǔ)中和逃逸突變株 是指由在編碼血凝素的基因中的點(diǎn)突變產(chǎn)生的突變病毒，所述點(diǎn)突變導(dǎo)致H5或者m病毒 中抗原漂移，且影響中和表位。中和逃逸突變株可以逃避在中和其親代病毒中有效的某些 單克隆抗體的中和作用。在逃逸突變株的人工篩選中，將親代病毒與某一中和抗體一起保 溫并接種于宿主如MDCK細(xì)胞或者雞胚中。在2-3次篩選循環(huán)之后，克隆所述中和mAb的逃 逸突變株，并對(duì)其進(jìn)行HAl基因測(cè)序。突變的氨基酸通過(guò)與親代病毒序列對(duì)比而確定，且 突變的位點(diǎn)精確示出包含由所述中和mAb識(shí)別的中和表位的氨基酸之一。在本發(fā)明中，通過(guò)5C5中和單克隆抗體從A/Indonesia/CDC669/H5NlAIV中產(chǎn)生5C5逃逸突變株。所述突 變位點(diǎn)列于下文實(shí)施例3和表4中。通過(guò)2F11中和單克隆抗體從A/Vietnam/UOSAOOV H5N1中產(chǎn)生2F11逃逸突變株。通過(guò)9C1中和單克隆抗體從A/Vietnam/1203/2004/H5m的 K189M突變株中產(chǎn)生9C1逃逸突變株。此外，3H11、2F9和9C1逃逸突變株從A/Indonesia/ ⑶C669/2006/H5m中產(chǎn)生。所述突變位點(diǎn)在下文實(shí)施例3和表4中列出。中和逃逸突變株與其親代病毒不同，其不再可以由特異性結(jié)合親代病毒的某些中 和抗體識(shí)別。鑒于此，根據(jù)上述教導(dǎo)，這些突變株可用于免疫小鼠以產(chǎn)生新的單克隆抗體。 在新的mAb中，可以篩選出精確識(shí)別突變表位的單克隆抗體，并將其用于提供對(duì)于不同于 親代病毒的禽流感病毒的互補(bǔ)監(jiān)視。通過(guò)重復(fù)這種方法通過(guò)幾個(gè)世代，可以發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的 逃逸突變株，以及獲得進(jìn)一步的中和抗。這些抗體可用于本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予本發(fā)明的抗體和相關(guān)的結(jié)合蛋白以治療 受累于H5AIV感染的對(duì)象，特別是AIV的H5W亞型感染對(duì)象。本發(fā)明的抗體和相關(guān)的結(jié)合 蛋白在流感流行或者潛在流行的情況中也可以作為預(yù)防措施給予對(duì)象。所述抗體及相關(guān)的 結(jié)合蛋白可以以單一劑量或者重復(fù)給予，任選以緩釋形式給予?？梢酝ㄟ^(guò)使所述抗體到達(dá) 治療對(duì)象體內(nèi)其作用部位的任何方式給予，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、口服或者經(jīng)鼻給 予。典型地，所述抗體在藥物可接受的稀釋劑或者載體如無(wú)菌水溶液中給予，且所述組合物 可進(jìn)一步包含一或多種穩(wěn)定劑、佐劑、增溶劑、緩沖液等。在治療時(shí)根據(jù)治療對(duì)象的個(gè)體需 要以及考慮到如對(duì)象的年齡、體重、一般狀況及其癥狀的性質(zhì)和程度以及給予的治療頻率 等因素，確定精確的給予方法、成分和特定劑量。一般地，當(dāng)給予所述抗體治療受累于H5AIV 感染的患者時(shí)，所述抗體的給予劑量在大約0. lmg/kg至大約lmg/kg體重范圍內(nèi)。典型地， 當(dāng)作為預(yù)防措施給予時(shí)，給予劑量降低大約一半，即在大約0. 05mg/kg至大約0. 5mg/kg體 重范圍內(nèi)。為了進(jìn)行治療，可以給予本發(fā)明的單一中和抗體或者結(jié)合蛋白，或者可以給予兩 或多種抗體的組合。如果已經(jīng)產(chǎn)生中和逃逸突變株的一或多個(gè)世代的抗體，上述本發(fā)明的 這些抗體可以作為治療性抗體混合物給予。優(yōu)選用作治療劑的抗體包括5C5、2D9、2F11、 9CU3H11 和 4F8mAb。提供了如下實(shí)施例以例證本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施模式。本發(fā)明不限于所述實(shí)施例，而 是與所附權(quán)利要求書的整個(gè)范圍一致。實(shí)施例1 雜交瘤的產(chǎn)生除了 H5m/PR8之外，所有活的野生型H5W流感病毒均得自印尼。H5m/PR8得自 美國(guó)疾病控制中心。其是非病原性重組病毒，含有在越南感染人的AIV H5m病毒的HA和 NA 基因(A/Vietnam/1203/2004)。 H5N2(A/chicken/Singapore/98)和 H7m(A/chicken/ Singapore/94)得自新加坡農(nóng)糧獸醫(yī)局(AVA)。這些病毒原種用于感染9天和11天齡的含 胚雞卵(Chew’ sPoultry Farm，新加坡)，并使其復(fù)制兩個(gè)世代。然后，吸取尿囊液并使用 凝血試驗(yàn)(HA)確定病毒效價(jià)。失活的H5m (A/goose/Guangdong/97)用于RNA提取，以通 過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增 HAl 基因。將 Madin Darby 腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34)在具有 10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基中在37°C在具有5% CO2條件下生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)含有病毒的尿囊液在10，OOOrpm離心30分鐘除去碎片，隨后在40，OOOrpm
對(duì)上清超離心3小時(shí)，從而對(duì)病毒進(jìn)行純化。將病毒沉淀懸浮于PBS中。
使用蛋白質(zhì)A 親和性層析柱(Sigma Aldrich ；St. Louis, MO, USA)和 Immunopure IgM 純化試劑盒(Pierce Biotechnology ；Rockford, IL, USA)，根據(jù)廠商 指導(dǎo)從澄清液中純化單克隆抗體。使用ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies ； Wilmington, DE, USA)測(cè)量抗體濃度。使用體積為0. 2ml的失活的禽流感病毒H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者 H7N1 (A/chicken/Singapore/94)以及油性佐劑Montanide ISA563 (S印pic，法國(guó))對(duì)BALB/ c小鼠進(jìn)行免疫接種。在第0、14、28和42天通過(guò)腹膜內(nèi)注射給予。收集來(lái)自經(jīng)免疫的小鼠 的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，并且如DeSt. Groth and Scheidigger所述融合產(chǎn)生雜交 瘤(16)。在用次黃嘌呤_氨喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基選擇之后，通過(guò)免疫熒光測(cè)定(IFA) 檢測(cè)在14天后示出明顯生長(zhǎng)的雜交瘤的培養(yǎng)基中抗H5m/PR8-感染的MDCK細(xì)胞的特異性 抗體的存在情況。通過(guò)限制性稀釋克隆選擇的雜交瘤，再次鑒別，第二次克隆，以及通過(guò)IFA 再次檢測(cè)。一旦確定，則將該雜交瘤在組織培養(yǎng)中增殖，并且在液氮中冷凍以進(jìn)一步使用。從中獲得本發(fā)明的每種特異性單克隆抗體的雜交瘤是根據(jù)這些一般程序制成的。實(shí)施例2 通過(guò)IFA篩選mAb使用免疫熒光測(cè)定檢測(cè)抗體與抗原靶之間的相互作用。將已經(jīng)過(guò)夜感染流感病毒 (H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者 H7m (A/chicken/Singapore/94)的 MDCK 細(xì)胞在 96 孔平板中用PBS-T (在PBS中0. 05% Tween-20，pH 7. 4)漂洗。通過(guò)將細(xì)胞在預(yù)冷的100% 乙醇中保溫10分鐘進(jìn)行固定。將該細(xì)胞在PBS-T中洗滌3次，然后在BSA.PBS-T中保 溫30分鐘以阻斷與抗體的非特異性結(jié)合。然后將其與100 μ L雜交瘤培養(yǎng)液在96孔平板 中在室溫保溫2小時(shí)或者在4°C保溫過(guò)夜。將細(xì)胞用PBS-T洗滌并與1 100稀釋度的二 抗_熒光標(biāo)記的山羊/兔抗小鼠抗體(DakoCytomation，USA)-在BSA、PBS_T中在室溫 保溫60分鐘。將該平板孔用PBS-T洗滌。棄去PBS-T并加入在PBS中的50%甘油。在顯 微鏡下用紫外光檢測(cè)熒光信號(hào)。未感染的MDCK細(xì)胞用作陰性對(duì)照。來(lái)自用失活的H5W病毒免疫接種的小鼠的血 清用作陽(yáng)性抗體對(duì)照。通過(guò)將與各個(gè)雜交瘤上清保溫的MDCK細(xì)胞與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，選擇 產(chǎn)生陽(yáng)性染色的雜交瘤上清，用于通過(guò)限制稀釋進(jìn)行克隆。通過(guò)這種方法獲得穩(wěn)定產(chǎn)生mAb 的雜交瘤。發(fā)現(xiàn)稱作mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、ICl、2F11和3B6的抗體結(jié)合來(lái)自印尼所有25個(gè) 分離株的H5m血凝素，以及結(jié)合H5m/PR8和H5N2。MAb 3H11結(jié)合來(lái)自幾乎所有25個(gè)印 尼分離株的血凝素，但是不結(jié)合H5m/PR8和H5N2。發(fā)現(xiàn)mAb 6C6、3D4和8H12結(jié)合來(lái)自所 有印尼H5m分離株的神經(jīng)氨酸酶，以及H5m/PR8和H7m。mAb 9C1已經(jīng)示出結(jié)合特異性 H5N1印尼株，因?yàn)檫@個(gè)抗體從特定毒株的逃逸突變株中產(chǎn)生，其特異性結(jié)合在H5的第205 位氨基酸是非賴氨酸的AIV毒株進(jìn)化枝1毒株。QClmAb的這個(gè)獨(dú)特性質(zhì)使得其可以與其它 205-賴氨酸特異性mAb組合用于治療而無(wú)需考慮病毒逃脫問(wèn)題(evasion)。與本發(fā)明的mAb反應(yīng)的AIV毒株在下文表1中列出。代表性IFA圖像在圖1中示出。表1 Target 靶注“+〃是指陽(yáng)性，“-〃是指陰性，“N.T.“是指未進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例3 :H5-和Nl-亞型mAb的鑒定mAb的同種型確定使用小鼠mAb同種型確定試劑盒(Amersham Bioscience,England)根據(jù)該試劑盒 中提供的方案進(jìn)行同種型確定(數(shù)據(jù)未示出)。確定mAb 5A5、6C6、2D9、4F8、1C1、3B6、3D4、 8H12、9C1 和 3H11 均是 IgGl。確定 mAb 5C5 是 IgG2a，確定 mAb 2F11 是 IgM。凝血抑制試驗(yàn)(HI)將常量凝血(HA)抗原加入微滴定平板(NUNC)的每個(gè)孔中。然后將檢測(cè)抗體置于 第一個(gè)孔中并連續(xù)稀釋。將該平板保溫1小時(shí)，然后向每個(gè)孔中加入雞紅細(xì)胞(RBC)。如果 測(cè)試血清中存在抗體，則RBC與HA抗原不凝集。HI陰性孔具有彌漫的凝集RBC片層覆蓋在孔的底部。HI陽(yáng)性孔具有非凝集的RBC的邊界清楚的花結(jié)(well-circumscribed button)。培養(yǎng)液中的mAb 5C5、2D9、2F11和4F8對(duì)所有印尼H5m分離株以及與H5m/PR8具 有16-64的HI活性。MAb 9C1和3H11對(duì)這些印尼H5W分離株的一些具有HI活性?；?mAb 3H11靶向的抗原表位，該抗體能特異性及靈敏性識(shí)別進(jìn)化枝2. 1.3中的H毒株。MAbs 5A5UC1和3B6無(wú)HI活性。病毒微量中和測(cè)定MDCK細(xì)胞用于確定50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。將兩倍連續(xù)稀釋的抗體加 入96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中。將稀釋的抗體與等體積的含有稀釋劑的IOOTCID5ci/孔流感病毒混 合。在37°C在5% CO2濕潤(rùn)環(huán)境中保溫2小時(shí)之后，在每個(gè)孔中加入1. 5X105/ml的100 μ 1 MDCK細(xì)胞。將該平板在37°C和5% CO2條件下保溫18小時(shí)。用PBS洗滌單層，并將其在 100%乙醇中固定10分鐘。使用抗流感病毒H5W的小鼠血清通過(guò)ELISA檢測(cè)病毒蛋白的 存在情況。在室溫進(jìn)行ELISA。將固定的平板用PBS-T (含有0. 05% Tween 20的PBS)洗滌 3次。將在含有牛血清白蛋白的PBS-T中1/500稀釋的小鼠血清抗體加入每個(gè)孔中，并 在室溫保溫1小時(shí)。將該平板在洗滌緩沖液中洗滌4次，并向每個(gè)孔中加入1/2000稀釋的 100 μ 1辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DakoCytomation，USA)。將該平板 在室溫保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌6次。將100 μ 1新鮮制備的底物(IOmg鄰苯二 胺二鹽酸鹽/20ml 0.05M磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液，pH 5. 0，含有0. 03%高硼酸鈉)加入每 個(gè)孔中，并將該平板在室溫保溫大約5分鐘。使用50 μ L 2Ν硫酸終止反應(yīng)。使用自動(dòng)平板 分光光度計(jì)(Mitenyi Biotec)在490nm(A49tl)測(cè)量吸光度。表 2 Virus 病毒；DMEM Medium =DMEM 培養(yǎng)基如表2所示，mAb 5C5中和感染的MDCK細(xì)胞上的H5W分離株。在存在單克隆抗 體的條件下，ELISA讀數(shù)結(jié)果降低至在不存在所述抗體的條件下得自所述細(xì)胞的數(shù)值的大 約一半，表明所述病毒顆粒被中和。由于ELISA讀數(shù)具有高背景，同時(shí)IFA是可見(jiàn)的，因此通過(guò)對(duì)于MDCK細(xì)胞的IFA 檢測(cè)方法進(jìn)行中和試驗(yàn)，以檢測(cè)單克隆抗體的中和活性。mAb5C5可以中和所有H5W分離株 的感染。這些結(jié)果與IFA檢測(cè)結(jié)果一致。圖2A和2B例證了對(duì)于AIV感染的MDCK細(xì)胞的mAb中和活性。圖2A和2B分別 示出在mAb中和病毒感染及不存在mAb中和作用的情況中FITC熒光染色的MDCK。對(duì)在MDCK細(xì)胞上和雞胚中的病毒中和的滴定MDCK細(xì)胞和10天齡的雞胚分別用于確定50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)和50% 雞胚感染劑量(EID50)。使MDCK細(xì)胞(2 XioVml)生長(zhǎng)至70% -90%鋪滿。使用從ICT1至10_8連續(xù)稀釋倍數(shù)的各個(gè)病毒感染雞胚，隨后檢測(cè)尿囊液的TCID5tl 和EID5tl。然后將所述病毒用于感染指數(shù)期的MDCK細(xì)胞(對(duì)于病毒感染靈敏性最高)和10天 齡的雞胚。未感染的MDCK細(xì)胞和尿囊液用作陰性對(duì)照。將該細(xì)胞在35°C保溫，觀測(cè)CPE。使用 Reed and Muench 數(shù)學(xué)技術(shù)(17)，感染性效價(jià)表示為 TCID5(1/100 μ 1 和 1000EID5(1/200 μ 1， 各個(gè)病毒均稀釋為在50 μ 1和100 μ 1分別具有IOOTCId50和500EID50。連續(xù)稀釋的mAb 5C5能中和感染的MDCK細(xì)胞和雞胚中終濃度為IOOTCID5q和 500EIDso的病毒(例如A/Indonesia/DCD669/H5Nl)。見(jiàn)表3所示。表3中的數(shù)字反映出 H5m病毒的最高稀釋比率，在此比率mAb仍能檢測(cè)和中和感染的MDCK細(xì)胞和雞胚中終濃度 為 IOOTCID50 和 500EID50 的病毒。表 3 MAb 2D9、3H11、9C1、2F11和4F8與mAb 5C5相似，識(shí)別H5的構(gòu)象表位且具有中和 MDCK細(xì)胞上病毒感染的能力。如上文針對(duì)mAb 5C5所述進(jìn)行病毒中和和50%組織培養(yǎng)感 染劑量(TCID5tl)確定。使MDCK細(xì)胞(2X104/ml)生長(zhǎng)至70%-90%鋪滿。然后使用病毒 A/Indonesia/⑶C669/H5m感染指數(shù)期MDCK細(xì)胞(對(duì)于病毒感染靈敏性最高)。未感染 的MDCK細(xì)胞用作細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)陰性對(duì)照，感染的細(xì)胞作為CPE陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞在 35°C保溫，每日檢查CPE情況。結(jié)果示于圖7A、7B和7C。在存在單克隆抗體的條件下，MDCK 細(xì)胞未示出CPE，因此表明所述mAb具有中和能力。MAb ICl和3B6也識(shí)別H5的構(gòu)象表位，通過(guò)相似分析示出其缺乏中和MDCK細(xì)胞上 的流感病毒感染的能力。1.表位特性和作圖la. mAb 5A5的線性表位作圖十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡用于鑒別和定位 單克隆抗體5A5的線性表位，如圖4A和4B所示。如Ausubel et al. (18)所述進(jìn)行SDS-PAGE 和蛋白印跡。表達(dá)來(lái)自H5m的GST-標(biāo)記的重組HAl并進(jìn)行10% SDS-PAGE。重組HAl為大 約32kD，表達(dá)的GST-標(biāo)記的HAl為大約57kD。通過(guò)將蛋白質(zhì)樣品與樣品緩沖液混合并在 100°C加熱5分鐘制備蛋白質(zhì)樣品。在簡(jiǎn)短旋轉(zhuǎn)之后，加樣全細(xì)胞裂解物。通過(guò)SDS-PAGE分 離的蛋白質(zhì)通過(guò)用考馬斯藍(lán)(0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-250，40%甲醇和10%冰醋酸)染色30 分鐘及隨后在脫色溶液(40%甲醇和10%冰醋酸)中脫色過(guò)夜進(jìn)行觀測(cè)。對(duì)于蛋白印跡， 使用Transblot Cell (Bio-Rad)將蛋白質(zhì)從凝膠中移至硝化纖維膜上。在電轉(zhuǎn)移之后，以 如上所述點(diǎn)印跡相同方式將膜用在PBS-T中的5%脫脂乳(Bio-Rad)封閉。將膜用在具有 0. 05% Tween-20 的 PBS(PBS-t)中的 5%脫脂乳(Bio-Rad,Canada)封閉 60 分鐘。在封閉 之后，將含有mAb的未稀釋的雜交瘤培養(yǎng)液與膜一起保溫60分鐘，用PBS-T洗滌，然后與山 羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗體(1 2000稀釋)(DakoCytomation) —起保溫60分。 洗滌該膜，然后用ECL蛋白印跡檢測(cè)試劑(Amersham Biosciences)生色，并曝光于KODAK Scientific 成像膠片(KODAK BioMAX MS, USA)。MAb 5A5與變性的重組HAl反應(yīng)，提示MAb 5A5的表位是線性的。MAb 5C5不能與變性的重組HAl反應(yīng)，表示這個(gè)mAb的表位是構(gòu)象表位。為了作圖mAb 5A5的線性表位，將H5亞型的HAl通過(guò)PCR切割成3個(gè)重疊片段，并 且表達(dá)為6-組氨酸-標(biāo)記融合蛋白。通過(guò)對(duì)mAb5A5進(jìn)行蛋白印跡，發(fā)現(xiàn)所述表位主要在片 段B和C的重疊區(qū)域(第201-271位氨基酸)中。設(shè)計(jì)5個(gè)截短的片段以通過(guò)蛋白印跡進(jìn) 一步作圖(圖4A)，所述表位縮小在第258至271位氨基酸之間。為了查明該線性表位的準(zhǔn) 確氨基酸序列，構(gòu)建具有各個(gè)氨基酸點(diǎn)突變的9個(gè)突變體。HAl上的第259-264和268-271 位氨基酸，除了第269位氨基酸之外，均通過(guò)某些引物單獨(dú)地被改變?yōu)楸彼?，?69位氨 基酸從丙氨酸被改變?yōu)楦彼?圖4B)。從圖4B所示蛋白印跡結(jié)果可以看出，mAb5A5靶向 的線性表位的序列是亞型5H的血凝素上第260-269位氨基酸，即AsnGlyAsnPhelleAlaPro GluTyrAla(NGNFIAPEYA)。lb.mAb 8H12線性表位的確定根據(jù)前文針對(duì)mAb 5A5在Ia章節(jié)所述方法，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡檢測(cè)mAb 8H12的線性表位。表達(dá)來(lái)自H5W的MBP-標(biāo)記的 重組NA1，并進(jìn)行10% SDS-PAGE。重組NAl為大約36kD，表達(dá)的MBP-標(biāo)記的NAl為大約 82kD。MAb 8H12與變性的NAl反應(yīng)，提示該抗體的表位是線性的。lc. 2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1 和 3H11 構(gòu)象表位的確定使用mAb 2D9、4F8、3B6、1C1、2F11、9C1和3H11中每一個(gè)抗體進(jìn)行上文Ia章節(jié)所 述方法。這些抗體無(wú)一與變性的HAl反應(yīng)，表明這些mAb的表位是構(gòu)象表位。Id. mAb 6C6和3D4構(gòu)象表位的確定使用mAb 6C6和3D4進(jìn)行如上文Ib章節(jié)所述的方法。無(wú)一抗體與變性NAl反應(yīng)， 表明這兩個(gè)抗體的部位是構(gòu)象表位。2. H5亞型mAb的逃逸突變株的選擇及構(gòu)象/中和表位作圖將連續(xù)10倍稀釋的親代病毒A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)與等體積的mAb 混合。在室溫保溫1小時(shí)后，將該混合物接種于在DMEM培養(yǎng)基中的MDCK細(xì)胞單層上，所述 培養(yǎng)基含有200 μ g/ml TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma)和0. 001% DEAE-葡聚糖(Sigma)。 在35°C培養(yǎng)7天后，收集病毒上清并進(jìn)行進(jìn)一步選擇。使用另一種方法產(chǎn)生逃逸突變株，其 中將親代毒株與過(guò)量的mAb在室溫保溫至少0. 5小時(shí)。然后將此混合物接種于10天齡雞 胚中。在35°C培養(yǎng)2或3天后，收集病毒上清并進(jìn)行進(jìn)一步選擇。在每種方法之后，克隆所 述逃逸突變株并收集以提取RNA。造成mAb中和抗性的點(diǎn)突變通過(guò)于親代病毒進(jìn)行序列對(duì) 比確定。使得突變病毒逃逸mAb中和作用的這種突變的能力通過(guò)中和試驗(yàn)和血凝素抑制試 驗(yàn)檢測(cè)。使用中和的mAb 5C5選擇一些逃逸突變株?？寺∷鎏右萃蛔冎瓴⑹占蕴崛?RNA。根據(jù)序列對(duì)比，點(diǎn)突變分別發(fā)生在HA序列上第524/503和602位核苷酸(序列得自 GenBank, GenBank 登記號(hào) #CY014481 ；GenBankGISl 13497155)。第 524 位核苷酸 AC 改變?yōu)?AT，導(dǎo)致第175位氨基酸從蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷５?03位核苷酸A改變?yōu)門，導(dǎo)致低168 位氨基酸從賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷５?02位核苷酸C改變?yōu)锳，導(dǎo)致第201位氨基酸從 丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?。通過(guò)中和試驗(yàn)和血凝素抑制試驗(yàn)證實(shí)，這種突變使得突變病毒逃逸 mAb 5C5抗體中和作用。這個(gè)結(jié)果表明mAb 5C5靶向血凝素上含有第168/175和201位氨 基酸的表位。結(jié)果在表4中示出，圖中示出AIV(A/Indonesia/⑶C669/H5N1)的血凝素分子上mAb中和表位的位置。相似地確定針對(duì)其它mAb的點(diǎn)突變，如表4所示。表4
商指導(dǎo)，將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy克隆載體(Promega，WI, USA)中。對(duì)含有編碼神 經(jīng)氨酸酶的序列的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)與數(shù)據(jù)庫(kù)中參考序列一致。作為瞬時(shí)步驟將神 經(jīng)氨酸酶基因亞克隆進(jìn)載體pENTR/TEV/D-TOPO中，然后根據(jù)供應(yīng)商(Invitrogen，CA, USA) Gateway System指導(dǎo)插入桿狀病毒中。根據(jù)供應(yīng)商(Invitrogen)指導(dǎo)，將此具有神經(jīng)氨酸 酶基因的重組桿狀病毒用于轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞并表達(dá)。固定具有表達(dá)的神經(jīng)氨酸酶的Sf9 昆蟲細(xì)胞，并且使用mAb 6C6進(jìn)行IFA，與上文關(guān)于MDCK細(xì)胞進(jìn)行IFA程序相同。圖5A和5B示出mAb 6C6與表達(dá)的重組附之間的典型反應(yīng)。mAb 3D4與表達(dá)的重 組m之間的反應(yīng)相似。圖5A示出表達(dá)的重組m在Sf9細(xì)胞中檢測(cè)到。在圖5B中，紫外 光和正常光合并表示各個(gè)細(xì)胞。2. mAb 6C6和3D4的表位是構(gòu)象表位而不是線性表位用具有NA插入的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，在28°C保溫96小時(shí)。收集細(xì)胞， 與樣品緩沖液混合，并加樣于SDS-PAGE凝膠，分別用mAb6C6 (的抗_H5m小鼠血清)或者 mAb 3D4進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色以及蛋白印跡。蛋白印跡證實(shí)重組NA在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò) 蛋白印跡示出無(wú)mAb6C6或3D4信號(hào)條帶，表明mAb 6C6和3D4的表位是構(gòu)象表位。圖6A和6B示出SDS-PAGE和蛋白印跡，以證實(shí)表達(dá)的NA。圖6A示出在SDS-PAGE 凝膠上NA的分子量為大約49kDa。在圖6B中，蛋白印跡示出重組NA與作為抗體的抗H5W 小鼠血清反應(yīng)。預(yù)防和治療基于mAb 5C5中和MDCK細(xì)胞和雞胚上的H5m的能力及其IgG2a同種型，mAb 5C5 及包含該抗體可變區(qū)的重組抗體可用于預(yù)防和治療目的?；谠谛∈笾械难芯?19，20， 21)，通常認(rèn)為中和IgG抗體具有預(yù)防和治療能力。相似地，鑒于mAb 2D9、2F11、3H11、9C1和4F8中和MDCK細(xì)胞上H5m的能力及其 IgGl或IgM同種型，這些mAb及包含這些抗體的可變區(qū)的重組抗體可用于預(yù)防和治療目的。如下試驗(yàn)例證了 mAb 5C5的預(yù)防和治療特性。將一組6只雌性BALB/c小鼠(6_8周齡)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用作動(dòng)物模型，研究通過(guò)給 予mAb 5C5對(duì)免于病毒致命性攻擊的保護(hù)作用。在生物學(xué)研究安全室內(nèi)由穿戴動(dòng)力空氣凈 化呼吸器的技術(shù)人員進(jìn)行小鼠接種和血液收集。將流感病毒感染的動(dòng)物圈養(yǎng)在3級(jí)生物學(xué) 研究安全水平(BSL3)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。為了評(píng)估單克隆抗體在動(dòng)物模型中作為預(yù)防劑的效力(即在病毒感染之前)，經(jīng) 腹膜內(nèi)(i. P.)給予小鼠10mg/kg純化的mAb 5C5。在i. p.之后24小時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行放血 以測(cè)量H5N1的HI效價(jià)，然后經(jīng)鼻內(nèi)(i. η.)給予20 μ 1的IOLD50的A/Indonesia/CDC669/ H5m。對(duì)照組(共6只小鼠)接受IgGl的mAb5C4，其是針對(duì)細(xì)菌C. jejuni制成的內(nèi)部 (in-house)小鼠單克隆抗體。對(duì)于生存分析，每天觀測(cè)小鼠共14天。在對(duì)照組中，6只小 鼠在感染后10天內(nèi)全部死亡。相反，mAb 5C5-處理的小鼠顯然得到保護(hù)，該組中所有6 只小鼠在觀測(cè)的14天期間結(jié)束后均仍存活。給予mAb 5C5的小鼠血清具有高于64的A/ Indonesia/⑶C669/H5m的HI效價(jià)。這些數(shù)據(jù)表明給予的IgG2amAb 5C5可以滲入小鼠血 液中，并且最終促進(jìn)小鼠體內(nèi)病毒清除。為了評(píng)估m(xù)Ab 5C5的治療效力，在病毒感染之后給予所述抗體。在給予6只小鼠的 每一只小鼠20 μ 1的IOLD5tl致死劑量A/Indonesia/CDC669/H5m之后第一天(24小時(shí))，通過(guò)腹膜內(nèi)注射給予10mg/kg的mAb 5C5。對(duì)照組(6只小鼠)接受IgGlmAb 5C4，其是針對(duì) C. jejuni.制成的內(nèi)部抗體。在對(duì)照組中，6只小鼠在感染后10天內(nèi)全部死亡。在mAb5C5 組中，6只小鼠中有5只小鼠在病毒攻擊后14天仍存活。這些數(shù)據(jù)表明mAb 5C5即使在病毒感染后給予仍是有效的，表明所述抗體可用于 預(yù)防和治療目的。實(shí)施例4 組合使用針對(duì)m亞型的mAb6C6及針對(duì)H5亞型的mAb5C5進(jìn)行抗原捕 獲 ELISA (AC-ELISA)以鑒別 H5m 亞型 AIV如上所述，含有H5W病毒的樣品通過(guò)使用mAb 5C5或者mAb 5A5可以將其鑒別為 H5亞型，使用mAb 6C6可以將其單獨(dú)鑒別為m亞型。通過(guò)組合使用前者抗體之一與后者抗 體也可以將樣品鑒別為H5m。設(shè)計(jì)AC-ELISA以檢測(cè)H5W病毒。在100 μ 1 PBS中將mAb 5C5 以 0. 5 μ g/ 孔及 100 μ 1/ 孔的量在 96 孔平板(U96MaxiSorp NUNC-immuno plate)中在 4°C保溫過(guò)夜。在用PBS-T漂洗該平板之后，將包被的平板用牛血清白蛋白(BSA)在室 溫封閉1小時(shí)。然后棄去封閉溶液，將在PBS中的20HA單位100 μ 1稀釋的失活的H5W分 離株加入每個(gè)孔中，保溫2小時(shí)。用洗滌緩沖液PBS-T洗滌該平板4次，向每個(gè)孔中加入1/500稀釋的100 μ 1辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的mAb 6C6。將該平板在室溫進(jìn)一步保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌6 次。將100 μ 1新鮮制備的底物(IOmg鄰苯二胺二鹽酸鹽AOml 0. 05Μ磷酸鹽檸檬酸鹽緩 沖液，PH 5.0，含有0.03%高硼酸鈉)加入每個(gè)孔中，將平板在室溫保溫大約5分鐘。加入 50 μ 1 2Ν硫酸終止反應(yīng)。使用自動(dòng)平板分光光度計(jì)(Mitenyi Biotec)在490nm(A490)測(cè) 量吸光度。H5N1病毒產(chǎn)生顯著的A490讀數(shù)，而作為陰性對(duì)照的H7W病毒產(chǎn)生較低的讀數(shù)。 示于表5中的結(jié)果表明組合mAb 5C5與mAb 6C6可用于鑒別H5mAIV。含有H5mAIV的樣 品可以通過(guò)單獨(dú)使用mAb 5C5和mAb 6C6鑒別，但是使用所述組合抗體可以減少需要的樣 品量。相似地，組合mAb 5A5與mAb 6C6或者本發(fā)明mAb的其它合適組合也可以用于鑒 別 H5N1AIV。表5 組合使用mAb 5C5和mAb 6C6鑒別H5N1的AC-ELISA結(jié)果 Blank:空白實(shí)施例5 :mAb 2F1U9C1 和 3H11 的活性在使用H5m-AIV_感染的MDCK細(xì)胞的間接免疫熒光測(cè)定(IFA)、蛋白印跡(WB)、 凝血抑制試驗(yàn)(HI)和病毒中和試驗(yàn)(VN)中評(píng)估m(xù)Ab 2F11、9C1和3H11的結(jié)合活性。試驗(yàn)結(jié)果在下表6-8中示出。表6 與 H5N IAIV (A/Vietnam/1203/2004/H5Nl)逃逸突變株 K205M 的結(jié)合活性 表7 與 H5N1AIV(A/Indonesia/CDC669/2206/H5m)的逃逸突變株 K205M 的結(jié)合
活性 逃逸突變株K205M 從 H5N IAIV (A/Vietnam/1203/2004/H5m)中通過(guò) mAb 6B8 篩 選產(chǎn)生，mAb 6B8是于2007年3月20日以保藏號(hào)ATCC CRLPTA-8246保藏在美國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心的單克隆抗體。mAb 9C1和2F11與這些K205突變株的特異性相互作用提示這 兩個(gè)mAb與mAb 6B8 一起在抑制逃逸突變株產(chǎn)生中的潛在應(yīng)用。實(shí)施例6 :mAb 2F11和9C1的治療應(yīng)用2F11 和 9C1 均從 H5 毒株 A/Vietnam/1203/2004/H5Nl 的 K205M 逃逸突變株中產(chǎn) 生，因此可以與靶向相同突變株的另一種單克隆抗體組合，但是不能結(jié)合或者以較低活性 結(jié)合野生型毒株，如mAb 6B8(由雜交瘤6B8產(chǎn)生，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2007年3月20日 保藏在ATCC，保藏號(hào)為CRLPTA-8246)，這是作為治療劑靶向VN1203毒株中野生型205K毒
27株的mAb。MAb 9C1識(shí)別K205M突變株，但是不能結(jié)合野生型毒株VN1203，這表明該mAb靶 向毒株VN1203中第205位甲硫氨酸表位。包含mAb 9C1和6B8的單克隆抗體混合物可以 有效地抑制H5W感染，且防止逃逸突變株在體外和體內(nèi)產(chǎn)生。表9 :mAb 6B8與9C1的HI活性對(duì)比 為了例證6B8和9ClmAb的活性，將16HA單位AIV與下表所示mAb —起在室溫保 溫至少1.5小時(shí)。將該混合物接種于10天齡雞胚內(nèi)。每日評(píng)估HA效價(jià)和雞胚的存活率。 結(jié)果示于表10。表 10 〃-〃表示HA試驗(yàn)陰性或者雞胚死亡，“ +〃表示HA試驗(yàn)陽(yáng)性或者雞胚存活，p. i.表示感染后。參考文獻(xiàn)1. Jeffery K. Taubenberger, Ann H. Reidl, Raina Μ. Lourensl, Ruixue Wang, GuozhongJin and Thomas G.Fanningl. 2006. Molecular virology :ffas the 1918 pandemic caused by abird flu ？ Was the 1918 flu avian in origin ？ Nature. 440 E9-E10.2. Ann H. Reid, Jeffery K. Taubenberger & Thomas G. Fanning. 2004. Evidenceof anabsence :the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus. Nature ReviewsMicrobiology 2 :909-914.3.Patrick J Gavin,Richard B Thomson,Jr. 2003. Review of Rapid Diagnostic Tests forlnfluenza. Clinical and Applied Immunology Reviews 4:151—172.4. Gregory A. Storch, MD. 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權(quán)利要求
特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素包膜糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白，其基本上具有單克隆抗體5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫學(xué)結(jié)合特性。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體或者人源 化抗體。
3.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體。
4.由雜交瘤5C5產(chǎn)生的單克隆抗體5C5，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為PTA-8529。
5.由雜交瘤2D9產(chǎn)生的單克隆抗體2D9，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為PTA-9396。
6.由雜交瘤4F8產(chǎn)生的單克隆抗體4F8，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為PTA-9397。
7.由雜交瘤ICl產(chǎn)生的單克隆抗體1C1，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為PTA-9398。
8.由雜交瘤3B6產(chǎn)生的單克隆抗體3B6，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為PTA-9399。
9.由雜交瘤2F11產(chǎn)生的單克隆抗體2F11，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏號(hào)為PTA-9373。
10.由雜交瘤9C1產(chǎn)生的單克隆抗體9C1，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏號(hào)為PTA-9372。
11.由雜交瘤3H11產(chǎn)生的單克隆抗體3H11，所述雜交瘤保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏號(hào)為PTA-9374。
12.特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的血凝素包膜糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白，其基 本上具有單克隆抗體5A5的免疫學(xué)結(jié)合特性。
13.權(quán)利要求12的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體或者人 源化抗體。
14.權(quán)利要求12的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體。
15.由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏號(hào)PTA-8528保藏的雜交瘤5A5產(chǎn)生的單克隆 抗體5A5。
16.特異性結(jié)合m亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白，其基 本上具有單克隆抗體6C6或者3D4的免疫學(xué)結(jié)合特性。
17.權(quán)利要求16的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體或者人 源化抗體。
18.權(quán)利要求16的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體。
19.由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏號(hào)PTA-8526保藏的雜交瘤6C6產(chǎn)生的單克隆 抗體6C6。
20.由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏號(hào)PTA-9395保藏的雜交瘤3D4產(chǎn)生的單克隆 抗體3D4。
21.特異性結(jié)合m亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白，其基 本上具有單克隆抗體8H12的免疫學(xué)結(jié)合特性。
22.權(quán)利要求21的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體或者人 源化抗體。
23.權(quán)利要求16的結(jié)合蛋白，其是單克隆抗體。
24.由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏號(hào)PTA-9394保藏的雜交瘤8H12產(chǎn)生的單克 隆抗體8H12。
25.檢測(cè)生物學(xué)樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合H5亞 型禽流感病毒的包膜糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白接觸，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆 抗體5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫學(xué)結(jié)合特性。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合 抗體或者人源化抗體。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-8529保藏的雜交瘤5C5產(chǎn)生的抗體5C5。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9396保藏的雜交瘤2D9產(chǎn)生的抗體2D9。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9397保藏的雜交瘤4F8產(chǎn)生的抗體4F8。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9398保藏的雜交瘤ICl產(chǎn)生的抗體ICl。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9399保藏的雜交瘤3B6產(chǎn)生的抗體3B6。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9373保藏的雜交瘤2F11產(chǎn)生的抗體2F11。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9372保藏的雜交瘤9C1產(chǎn)生的抗體9C1。
35.權(quán)利要求27的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9374保藏的雜交瘤3H11產(chǎn)生的抗體3H11。
36.檢測(cè)生物學(xué)樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合H5亞 型禽流感病毒的包膜糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白接觸，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆 抗體5A5的免疫學(xué)結(jié)合特性。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合 抗體或者人源化抗體。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-8528保藏的雜交瘤5A5產(chǎn)生的抗體5A5。
40.權(quán)利要求27的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋 白的第二種結(jié)合蛋白接觸，其中所述第一種結(jié)合蛋白是捕獲結(jié)合蛋白，第二種結(jié)合蛋白是 含有可檢測(cè)元件或者與可檢測(cè)元件綴合的檢測(cè)結(jié)合蛋白。
41.權(quán)利要求40的方法，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白中的至少一種是單克隆抗體。
42.權(quán)利要求40的方法，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
43.權(quán)利要求40的方法，其中第一種結(jié)合蛋白固定化于固體表面上。
44.權(quán)利要求40的方法，其中第二種結(jié)合蛋白含有放射性原子，與熒光分子綴合，或者 與酶綴合。
45.檢測(cè)生物學(xué)樣品中m亞型禽流感病毒的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合m亞 型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白接觸，所述結(jié)合蛋白基本上具有 單克隆抗體6C6或者3D4的免疫學(xué)結(jié)合特性。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合 抗體或者人源化抗體。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-8526保藏的雜交瘤6C6產(chǎn)生的抗體6C6。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述單克隆抗體是由在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏 號(hào)PTA-9395保藏的雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體3D4。
50.檢測(cè)生物學(xué)樣品中m亞型禽流感病毒的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合m亞 型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白接觸，所述結(jié)合蛋白基本上具有 單克隆抗體8H12的免疫學(xué)結(jié)合特性。
51.權(quán)利要求45的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋 白的第二種結(jié)合蛋白接觸，其中所述第一種結(jié)合蛋白是捕獲結(jié)合蛋白，第二種結(jié)合蛋白是 含有可檢測(cè)元件或者與可檢測(cè)元件綴合的檢測(cè)結(jié)合蛋白。
52.權(quán)利要求51的方法，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白中的至少一種是單克隆抗體。
53.權(quán)利要求51的方法，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
54.權(quán)利要求51的方法，其中第一種結(jié)合蛋白固定化于固體表面上。
55.權(quán)利要求51的方法，其中第二種結(jié)合蛋白含有放射性原子，與熒光分子綴合，或者 與酶綴合。
56.檢測(cè)生物學(xué)樣品中H5W亞型禽流感病毒的方法，包括將所述樣品與特異性結(jié)合H5 亞型禽流感病毒的包膜糖蛋白的線性或構(gòu)象表位的第一種結(jié)合蛋白接觸，所述第一種結(jié)合 蛋白分別基本上具有單克隆抗體5A5或者單克隆抗體505、209、4 8、1(1、386、2 11、9(1或 者3H11的免疫學(xué)結(jié)合特性，以及與特異性結(jié)合m亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的 第二種結(jié)合蛋白接觸，所述第二種結(jié)合蛋白基本上具有單克隆抗體6C6或3D4或者單克隆 抗體8H12的免疫學(xué)結(jié)合特性。
57.檢測(cè)生物學(xué)樣品中H5亞型禽流感病毒的試劑盒，其包含特異性結(jié)合H5亞型禽流 感病毒包膜糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆抗體5C5、2D9、 4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫學(xué)結(jié)合特性，所述試劑盒還具有檢測(cè)所述結(jié)合蛋 白與所述包膜糖蛋白結(jié)合的至少一種試劑。
58.檢測(cè)生物學(xué)樣品中H5亞型禽流感病毒的試劑盒，其包含特異性結(jié)合H5亞型禽流感 病毒包膜糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆抗體5A5的免疫 學(xué)結(jié)合特性，所述試劑盒還具有檢測(cè)所述結(jié)合蛋白與所述包膜糖蛋白結(jié)合的試劑。
59.權(quán)利要求57或58的試劑盒，其包含特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋白的第二種結(jié)合蛋白，其中所述第一種結(jié)合蛋白是捕獲結(jié)合蛋白，第二種結(jié)合蛋白是含有可 檢測(cè)元件或者與可檢測(cè)元件綴合的檢測(cè)結(jié)合蛋白。
60.權(quán)利要求59的試劑盒，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白中的至少一種是單克隆抗體。
61.權(quán)利要求59的試劑盒，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
62.權(quán)利要求59的試劑盒，其中第一種結(jié)合蛋白固定化于固體表面上。
63.權(quán)利要求59的試劑盒，其中第二種結(jié)合蛋白含有放射性原子，與熒光分子綴合，或 者與酶綴合。
64.檢測(cè)生物學(xué)樣品中m亞型禽流感病毒的試劑盒，其包含特異性結(jié)合m亞型禽流 感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆抗體 6C6或者3D4的免疫學(xué)結(jié)合特性，所述試劑盒還具有檢測(cè)所述結(jié)合蛋白與所述神經(jīng)氨酸酶 糖蛋白結(jié)合的試劑。
65.檢測(cè)生物學(xué)樣品中m亞型禽流感病毒的試劑盒，其包含特異性結(jié)合m亞型禽流 感病毒的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的線性表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白基本上具有單克隆抗體 8H12的免疫學(xué)結(jié)合特性，所述試劑盒還具有檢測(cè)所述結(jié)合蛋白與所述神經(jīng)氨酸酶糖蛋白結(jié) 合的試劑。
66.權(quán)利要求64或65的試劑盒，其包含特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶 糖蛋白的第二種結(jié)合蛋白，其中所述第一種結(jié)合蛋白是捕獲結(jié)合蛋白，第二種結(jié)合蛋白是 含有可檢測(cè)元件或者與可檢測(cè)元件綴合的檢測(cè)結(jié)合蛋白。
67.權(quán)利要求66的試劑盒，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白中的至少一種是單克隆抗體。
68.權(quán)利要求66的試劑盒，其中第一種和第二種結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
69.權(quán)利要求66的試劑盒，其中第一種結(jié)合蛋白固定化于固體表面上。
70.權(quán)利要求66的試劑盒，其中第二種結(jié)合蛋白含有放射性原子，與熒光分子綴合，或 者與酶綴合。
71.治療感染H5亞型禽流感病毒的患者的方法，包括給予所述患者有效量的特異性結(jié) 合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋白的構(gòu)象表位的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白基本上具有單 克隆抗體5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫學(xué)結(jié)合特性。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合 抗體或者人源化抗體。
73.權(quán)利要求71的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
74.用有效量的結(jié)合蛋白處理感染H5亞型禽流感病毒的固定組織樣品的方法，所述結(jié) 合蛋白特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋白的線性表位，其基本上具有單克隆抗 體5A5的免疫學(xué)結(jié)合特性。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合 抗體或者人源化抗體。
76.權(quán)利要求74的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體。
77.權(quán)利要求74的方法，其中所述結(jié)合蛋白是單克隆抗體5A5。
78.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于由單克隆抗體5C5識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的突變，由此所述突變病毒不能被所述 抗體中和。
79.權(quán)利要求78的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?75位氨基酸。
80.權(quán)利要求78的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?68位氨基酸。
81.權(quán)利要求78的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?01位氨基酸。
82.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于 由單克隆抗體3H11識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的突變，由此所述突變病毒不能被所 述抗體中和。
83.權(quán)利要求82的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?55位氨基酸。
84.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于 由單克隆抗體2F11識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的突變，由此所述突變病毒不能被所 述抗體中和。
85.權(quán)利要求84的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?58位氨基酸。
86.權(quán)利要求84的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?10位氨基酸。
87.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于 由單克隆抗體9C1識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的突變，由此所述突變病毒不能被所述 抗體中和。
88.權(quán)利要求87的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?00位氨基酸。
89.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于 由單克隆抗體2D9識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不 能被所述抗體中和。
90.權(quán)利要求89的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?39位氨基酸。
91.權(quán)利要求89的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?05和239位氨基酸。
92.權(quán)利要求89的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?57和239位氨基酸。
93.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5m)的中和逃逸突變株，其包含位于 由單克隆抗體4F8識(shí)別的所述毒株HA序列的表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不 能被所述抗體中和。
94.權(quán)利要求93的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?71和239位氨基酸。
95.權(quán)利要求93的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?71位氨基酸。
96.禽流感病毒株A/Vietnam/1203/2004/H5m的中和逃逸突變株，其包含位于由單克 隆抗體2F11識(shí)別的所述毒株HA序列表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不能被所 述抗體中和。
97.權(quán)利要求96的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?10位氨基酸。
98.權(quán)利要求96的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?58位氨基酸。
99.禽流感病毒株A/Vietnam/1203/2004/H5m的中和逃逸突變株，其包含位于由單克 隆抗體2D9識(shí)別的所述毒株HA序列表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不能被所述 抗體中和。
100.權(quán)利要求99的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?34位氨基酸。
101.禽流感病毒株A/Vietnam/1203/2004/H5m的中和逃逸突變株，其包含位于由單克隆抗體4F8識(shí)別的所述毒株HA序列表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不能被所 述抗體中和。
102.權(quán)利要求101的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?05位氨基酸。
103.禽流感病毒株A/Vietnam/1203/2004/H5m的中和逃逸突變株，其包含位于由單 克隆抗體9C1識(shí)別的所述毒株HA序列表位內(nèi)的至少一個(gè)突變，由此所述突變病毒不能被所 述抗體中和。
104.權(quán)利要求103的中和逃逸突變株，其中所述突變?cè)诘?05位氨基酸。
105.包含單克隆抗體6B8和單克隆抗體9C1的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合禽流感病毒(AIV)H5亞型的包膜糖蛋白或者N1亞型的神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的單克隆抗體及相關(guān)的結(jié)合蛋白。所述單克隆抗體及相關(guān)的結(jié)合蛋白可用于檢測(cè)AIV的H5和N1亞型，包括H5N1亞型，本發(fā)明提供了危險(xiǎn)病毒感染的診斷、監(jiān)視和治療方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101883789SQ200880115546
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月13日
發(fā)明者F·和, H-S·康, 錢紅亮 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司