專利名稱：烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)劑的新應(yīng)用，即烏 索酸在制備免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品中的應(yīng)用。無(wú)論將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他藥物配 合使用，只要制備成藥品或保健品均具有免疫調(diào)節(jié)作用。
背景技術(shù)：
烏索酸(Ursolicacid， UA)，又名熊果酸、烏蘇酸，屬五環(huán)三萜類化合物，分子式為U H4803，分子量為456.68，熔點(diǎn)為285-29rc，可溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮，略溶于丙酮， 微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚。烏索酸存在于多種植物中，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在 自然界已有34科108種植物中分離得到烏索酸，如杜鵑花科植物熊果的葉、果實(shí)，玄參植物毛 泡桐的葉等。烏索酸為脂溶性物質(zhì)，可以透過(guò)細(xì)胞膜發(fā)揮作用，并且具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)， 其突出作用為抗腫瘤，保肝護(hù)肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生蟲(chóng)和促進(jìn)造血 系統(tǒng)功能恢復(fù)等藥理等作用。 抗肝損傷
在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，UA對(duì)CCL4引起的大、小鼠急、慢性肝損傷具有明顯的保護(hù)和治療 作用。能使動(dòng)物血清SGPT1SB及肝甘油三酯顯著降低，血清甘油三酯、e-脂蛋白、al、 a2球 蛋白、肝糖原、及肝臟羥脯氨酸含量明顯增加，A/G比值倒置有改善作用，肝細(xì)胞變性、壞 死明顯減輕。證實(shí)UA對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有顯著的保護(hù)和治療作用。實(shí)驗(yàn)研究還表明UA有明顯 抗慢肝和抗纖維化等作用。這與馬學(xué)惠等報(bào)道的烏索酸(UA)可使由CCl4引起的急性肝損傷 動(dòng)物的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量下降，經(jīng)烏索酸治療的動(dòng)物肝糖原蓄積增加，脂庫(kù)動(dòng)員減少，同 時(shí)肝甘油三酯(TG)含量下降，血清TG及e-脂蛋白含量升高的結(jié)果一致。說(shuō)明UA可以使肝臟 合成較多的載脂蛋白，使TG從肝臟運(yùn)輸入血，從而減輕肝脂變。Liu報(bào)道UA可以降低由CCl4 (15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯化鎘所至CF-1小鼠肝損傷的程度，使肝金屬 硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分異構(gòu)體OA在降低化學(xué)試劑誘發(fā)的小鼠肝損傷方 面更具優(yōu)勢(shì)。SaraSwatB， MiuraN等人的實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)UA具有明顯抗肝損傷作用。
利膽退黃
實(shí)驗(yàn)研究表明UA能增加正常大鼠和膽汁瘀積性肝炎大鼠膽汁流量，使APIT模型動(dòng)物 的血清SB含量明顯降低，肝組織病理?yè)p傷顯著減輕，具有保肝、利膽、退黃的作用。 抗肝炎臨床預(yù)試采用病例隨機(jī)分組，雙盲給藥，以齊墩果酸(OA)為對(duì)照的方法，用UA治療甲、 乙型急性病毒性肝炎102例，劑量為120mg/日，60mg/次，平均治療時(shí)間21天，治愈率89.3 % ，優(yōu)于同期IOO例OA對(duì)照組的效果(68。/o)(P〈0.01j 。臨床試驗(yàn)表明UA有顯著而迅速降 低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，消退黃疸，增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用。服藥60天后，對(duì)21例HBeAg 陽(yáng)性患者的轉(zhuǎn)陰率為61.4% ，對(duì)21例HBsAg陽(yáng)性患者的轉(zhuǎn)陰率為23.8。/。，對(duì)乙肝病毒具 有一定的治療作用。UA治療的102例患者，停藥l年后隨訪了90例，結(jié)果89例肝功能復(fù)查 正常，僅l例谷丙轉(zhuǎn)氨酶反跳為110u ，后經(jīng)服用UA治療又恢復(fù)正常，表明UA療效穩(wěn)定。 UA在制備治療病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用，不論將UA單獨(dú)使用，還是與其它藥物配合使用， 只要制備成藥品或保健藥品均具有顯著治療病毒性肝炎的作用。
毒性實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，UA劑量下未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kgUA —次，觀察 72小時(shí)，未見(jiàn)動(dòng)物死亡或明顯毒副作用，體重、食欲、活動(dòng)均未受到影響。小鼠口服UA的 LD50為8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50為637mg/kg。家兔急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，以2.4g/ kg十二腸給藥，觀察24小時(shí)，對(duì)兔呼吸、血壓、心電圖無(wú)明顯影響;亞急性毒性實(shí)驗(yàn)表明 大鼠口服UA500mg/kg/日X30天，對(duì)大鼠的生長(zhǎng)、血象、心電圖、肝腎功能都無(wú)明顯影響， 其心、肝、脾、肺、腎組織病檢也未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。該劑量是臨床成人每日用量(2.4mg/ kg/日)的208倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者 服用UA未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。用藥期間進(jìn)行心電圖、肝功能、血、尿常規(guī)檢査，未發(fā)現(xiàn)異常 改變。認(rèn)為目前口服劑量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。個(gè)別患者在服藥初期或空腹服用時(shí) 上腹部稍感不適，未經(jīng)處理而自行消失。
抗腫瘤作用
近年發(fā)現(xiàn)UA具有明顯的抗腫瘤作用，其抗腫瘤譜廣，不僅對(duì)多種致癌、促癌物有抵抗作 用，而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)分化作用及抗血管形成作用。 抑制腫瘤形成生長(zhǎng)
UA對(duì)腫瘤形成生長(zhǎng)各階段具有預(yù)防和抑制作用。UA能抗DNA突變、抑制癌變的啟動(dòng)。 Ames試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)UA能對(duì)抗致癌物如苯并芘[B (a) P]，黃曲霉毒素B1誘發(fā)基因突變。UA 還具有抗誘變和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞EpsteinBar病毒早期抗 體(EBV-EA)活化試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)篩選皮膚癌促癌物的抑制劑，發(fā)現(xiàn)UA對(duì)TPA誘導(dǎo)Raji細(xì)胞 EBV-EA活化具有幾乎同維甲酸相同的抑制作用，并使Raji細(xì)胞的存活率更高;利用同位素標(biāo) 記的佛酯化合物"H-PDB2證明UA不影響TPA與受體的結(jié)合，即UA不是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)TPA位點(diǎn)， 而是有效地阻斷促癌物與受體結(jié)合后的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在二階段致癌實(shí)驗(yàn)中，Huang等發(fā)現(xiàn)UA明顯抑制TPA對(duì)二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌的促癌作用。實(shí)驗(yàn)證明UA對(duì) TPA誘導(dǎo)的表皮ODC活性增強(qiáng)有抑制作用。這些作用可能是由于UA阻斷ODC，引起多胺枯竭， 導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制，使細(xì)胞積累在G1期并出現(xiàn)分化。實(shí)驗(yàn)表明，UA可能通過(guò)抗氧化作用起到抗 始發(fā)突變與抗促癌作用?；钚匝踝杂苫c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Balanehru和Nagarajan研 究表明UA有較強(qiáng)的抗氧化作用和捕獲02-自由基的能力，在肝微粒體和P450單胺氧化酶系中 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化均有較強(qiáng)的抑制作用。另有實(shí)驗(yàn)表明UA能抑制花生四烯酸代謝過(guò)程中5-脂氧合 酶、環(huán)氧合酶活性，阻止前列腺素與白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明烏索酸能抑制人 乳腺上皮細(xì)胞中的環(huán)氧合酶2的轉(zhuǎn)錄，也由此抑制前列腺素2生成[12]。 對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒作用
UA能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。Lee等用UA進(jìn)行了多種細(xì)胞系的細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果表明UA對(duì) P-388和L1210白血病細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，ED50均小于4mg/L ;對(duì)KB 腫瘤細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT - 8、乳腺癌細(xì)胞MCF - 7顯示邊緣細(xì)胞毒作用。Young等從 枇杷葉提取UA，腹腔注射能明顯延長(zhǎng)荷S180小鼠生存期，當(dāng)UA的濃度為5、 10umol/L時(shí)， S180細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明瘤重的減輕是由于UA對(duì)S180的細(xì)胞毒作用所致。Kim從白花蛇 舌草中提取UA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示UA對(duì)所測(cè)的腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。Simon，黃 鏡等實(shí)驗(yàn)證明:UA能抑制HL-60細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及合成DNA ，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。Beek等 實(shí)驗(yàn)表明胞內(nèi)(^++信號(hào)增強(qiáng)與HL-60細(xì)胞凋亡是密切相關(guān)的。Kim等深入研究UA誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UA能促進(jìn)人肝癌(H印G2)細(xì)胞凋亡，降低HepG2細(xì)胞活 力，并有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，30umol/L的UA能引起DNA的斷裂，產(chǎn)生亞二倍體細(xì) 胞，增加細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞色素C依賴的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的 激活。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，細(xì)胞主要被阻滯在G0期和G1期，并伴S期細(xì)胞數(shù)的下降，而 且UA增加了p21WAF!的表達(dá)，在體外試驗(yàn)中，UA顯著抑制SV40DNA復(fù)制的啟始，并大大減 少拓?fù)洚悩?gòu)酶-l的DNA斷裂，顯著降低復(fù)制蛋白A的單鏈DNA的結(jié)合活性。這提示UA通過(guò) 阻斷起始階段復(fù)制叉的建立，從而抑制DNA的復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞周期終止。因此認(rèn)為，UA使 p2iw^'表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和caspase-3激活，抑制DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期終止。
誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用
癌是一類生長(zhǎng)失控，分化差或未分化的疾病。治療癌的新途徑是誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化為良性 或正常細(xì)胞。Lee等報(bào)道7.5umol/L的UA可以誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞成為內(nèi)胚層細(xì)胞，并且引起 與其分化有關(guān)的IV型膠原及維甲酸受體表達(dá)增加，且能導(dǎo)致M1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。UA誘 導(dǎo)癌細(xì)胞分化成正常細(xì)胞可能因UA結(jié)構(gòu)上類似于糖皮質(zhì)激素通過(guò)與GS-R受體或類似的核受體結(jié)合發(fā)揮作用有關(guān)。Cha等對(duì)侵襲性最強(qiáng)的人HT1080纖維瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)表明 UA能降低基質(zhì)金屬酶9(MMP-9)基因的表達(dá)從而對(duì)抗人HT1080纖維瘤細(xì)胞的侵襲性。 抗腫瘤血管形成作用
新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的至關(guān)重要的病理過(guò)程，而在腫瘤新生血管形成過(guò)程中， 血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的活化、增殖、遷移及小管形成是其關(guān)鍵步驟。事實(shí)證明，血管再生 是實(shí)體瘤的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以達(dá)到控制腫瘤生長(zhǎng)和 轉(zhuǎn)移的目的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多血管再生抑制劑，如魚精蛋白、干擾素、血小板因子-4等。 這類抑制劑毒性很大，限制了其在臨床上的應(yīng)用。SohoKH等以雞胚胎絨毛試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縐A 的抗血管作用，結(jié)果表明UA是很強(qiáng)的血管生成抑制劑，有效濃度為4nmol/egg ， ID50為 10nmol/egg。該濃度下無(wú)細(xì)胞毒作用，UA抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ID50為5umo1/L。王杰 軍等用20M胎牛血清的培養(yǎng)液使VEC呈指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。而增殖期VEC具有增殖、遷移及小 血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA對(duì)VEC增殖具有抑制作用，并有劑量依 賴性。
增強(qiáng)免疫功能作用
UA能使小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著提高，體內(nèi)試驗(yàn)表明可明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。 You等研究發(fā)現(xiàn)UA能誘導(dǎo)小鼠休止巨噬細(xì)胞釋放NO、 TNF-ci增多，并呈劑量依賴性，這 是通過(guò)核因子-KB(NF-KB)復(fù)合物介導(dǎo)，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF - a的 mRNA水平提高，從而上調(diào)iNOS和TNF-a的表達(dá)，增加NO、 TNF-a的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤 活性。Hsu等試驗(yàn)先給小鼠腹腔內(nèi)注射UA， 30分鐘后再以亞致死量全身照射4Gy，結(jié)果顯示 UA能通過(guò)植物血凝素的介導(dǎo)，加強(qiáng)照射后脾母細(xì)胞化的反應(yīng)，使效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)B淋 巴細(xì)胞大量增多，加強(qiáng)外周血細(xì)胞的作用，從而減輕放射后造血組織的損傷。
抗艾滋病病毒作用
實(shí)驗(yàn)研究表明，從桑毛路邊青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV 蛋白酶的作用。 抗炎抑菌作用
Maria等實(shí)驗(yàn)結(jié)果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酯(EPP)誘發(fā)的耳水腫，劑量為015mg/ 耳，抑制率分別為73.4%、 30.3%;抑制角叉菜膠誘發(fā)的水腫，口服劑量為100mg/kg，抑制率 為35.5 %;抑制由血清素誘發(fā)的水腫，劑量為50mg/kg，抑制率為48.6 。/。;抑制由放射菌素D和 放射菌素酮誘發(fā)的鼠爪水腫，劑量為50mg/kg，抑制率分別為47.5%、 47.4%。另有報(bào)道大鼠 每天腹腔注射12.5mg/kgX7d ，有延緩植入羊毛球的發(fā)熱過(guò)程，增加肝糖原，降低心、橫紋 肌及肌糖原，有糖皮質(zhì)激素樣作用，臨床用作膠原抑制劑。UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生長(zhǎng)，其最低抑菌濃度為300ug/ml 、 50 - 400ug/ml、 200 - 800ug/ ml、 100 - 700ug/ ml ;能抑制羊毛小孢子菌的生長(zhǎng);降低暴露在Hepes 單病毒中的Verd細(xì)胞的細(xì)胞病變程度。
降血脂抗動(dòng)脈粥樣硬化作用
蘇聯(lián)學(xué)者Parfentena等發(fā)現(xiàn)UA可以降低家兔和大鼠血膽固醇(44 %)和e-脂蛋白水平 (50%)，具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)劑的新用途即烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)的 藥物、保健品中的應(yīng)用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明烏索酸對(duì)小鼠脾細(xì)胞具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。無(wú)論 將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他藥物配合使用，只要制備成藥品或保健品均具有免疫調(diào)節(jié)作 用。
本發(fā)明用MTT法證明烏索酸對(duì)小鼠脾細(xì)胞具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。MTT法是現(xiàn)代檢 測(cè)細(xì)胞存活率最經(jīng)典的基本方法。該法利用活細(xì)胞具酶活性而死細(xì)胞無(wú)酶活性的原理設(shè)計(jì)。 因?yàn)辄S色的四氮唑[MTT]能接受脫氫酶給予的氫原子而轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色的甲次；活細(xì)胞因具脫 氫酶，故能被染成藍(lán)紫色。死細(xì)胞無(wú)活性脫氫酶，故不呈藍(lán)紫色，培養(yǎng)液中活細(xì)胞越多，藍(lán) 紫色越深。
進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入每孔加入酸化的20%的SDS溶液120 U L裂解細(xì)胞過(guò)夜，，可 使藍(lán)紫色的藍(lán)次溶出。在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的吸光值(測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm)可 測(cè)得其光密度值(A值)，根據(jù)其與對(duì)照組A值相比，可定量折算相對(duì)增殖率
—樣品孔的吸光值 _陰性對(duì)照孔的吸光值
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏索酸即使在微量濃度下(5-40pg/ml)，對(duì)大鼠、小鼠的脾細(xì)胞、T、 B淋巴 細(xì)胞都有顯著的促進(jìn)增殖的作用。
在臨床使用中，可以將本發(fā)明烏索酸制成片劑、固體分散體、滴丸、納米粒等口服制劑， 建議臨床成人每日用量(24mg/kg'd)，每日分3次服用，30天一個(gè)療程。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
枇杷葉藥渣中烏索酸的提取分離材料與方法
材料枇杷葉藥渣為水煎法生產(chǎn)枇杷糖漿的廢棄物，外觀小條形，色黑,由江西海爾思藥 業(yè)公司提供。
試劑食用級(jí)95%乙醇(廣西糖廠生產(chǎn))；"YCXY21號(hào)"除雜劑(自制)，活性炭，分析 純(上海豪申化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；烏索酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。
儀器FC2204分析天平(上海天平分析儀器廠)；Perkin Elmer傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó))。
方法
工藝流程。采用"醇提凝析法"新工藝提取分離。
枇杷葉藥渣一加乙醇回流提取一回收乙醇一用除雜劑除雜一活性炭脫色一凝析分離一純 化精制一烘干一烏索酸。
具體操作。取干燥的枇杷葉藥渣l kg，共3份，分別用7倍量90%乙醇分2次于80 'C回 流提取各lh，合并提取液，回收乙醇后，用"YCXY21號(hào)"除雜劑除雜，再用活性炭脫色， 經(jīng)凝析分離、純化精制即得。
結(jié)果與分析
烏索酸的產(chǎn)率將所得產(chǎn)品于105 'C烘干24h，稱重。
性狀鑒別產(chǎn)品為無(wú)色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不溶于石 油醚和水。 定性鑒別
L2B反應(yīng)。取樣品少許,以95%乙醇溶解，吸取乙醇溶液l滴，置試管中，力卩l(xiāng)ml醋酐 試劑，搖勻，加lml濃硫酸試劑，在醋酐與濃硫酸界面上呈紫紅色圓環(huán)。
薄層鑒定。取活化后的硅膠G硬板，將樣品的乙醇溶液點(diǎn)樣，同時(shí)用烏索酸對(duì)照品作對(duì) 照，以環(huán)己烷丙酮(3:1)為展開(kāi)劑，展距10cm，取出晾干，噴霧10%硫酸乙醇溶液，于 105 r加熱5 10min，結(jié)果在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)，在365 nm紫 外光下顯相同顏色的金黃色熒光斑點(diǎn)。
紅外光譜鑒定。產(chǎn)品IRKBrmax Wcm:3 434(-OH)、 2 968、 2 927、 2 871(C-H)、 1 694(C =0)、 1 456、 1 384(CH3)、 1031 (C-O)。其特征吸收與烏索酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜完全一致。上 述分析結(jié)果證明，所得產(chǎn)品為烏索酸。
實(shí)施例2
UA對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的直接影響 藥品本實(shí)驗(yàn)制備(方法同前) 南京康海藥業(yè)有限公司
Sigma公司 Sigma公司 Gibco公司
杭州四季青生物工程材料有限公司 中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
烏索酸UA(純度98%) 香菇多糖 試劑
噻唑藍(lán)(MTT) 刀豆蛋白A (ConA) RPMI-1640培養(yǎng)基 新生小牛血清 動(dòng)物與細(xì)胞株 清潔級(jí)ICR小鼠 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包完成，以P<0.05 表示差異顯著；P<0.01表示差異極其顯著。
取6 8周齡ICR小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為6~8X 106/mL。于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 U L細(xì)胞 懸液，再加100yL培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、10ug/mL ConA (陽(yáng)性對(duì)照)及含有不同濃度的樣 品溶液，置5。/。C02， 37。C培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，于每孔加入5mg/mL的MTT 20 y L，培 養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入酸化的20。/。的SDS溶液120ixL裂解細(xì)胞過(guò)夜，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的吸 光值(測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm)。
表一 UA對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的直接影響(；土s， n=8)
組劑量Og/mL)波長(zhǎng)A540
Control-0.214±0.005UA0.451 ±0.008**
100.516 ±0.007"
200.542±0.008**
400.581 士0.008**
*P<0.05為顯著差異；**P<0.01為極顯著差異.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，烏索酸UA可顯著地刺激并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，且其作用的 強(qiáng)弱隨UA濃度的變化而變化不明顯。在5iig/mL~4(^g/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的提高， 刺激作用變化不明顯，表明UA的對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性在低濃度下明顯，但隨著劑量的增 大變化不明顯。實(shí)施例3
UA對(duì)T、 B淋巴細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)藥品、材料同實(shí)施例2
取脾細(xì)胞及T、 B細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5~6X 106/mL。于96孔培養(yǎng)板中，每孔加 入100uL細(xì)胞懸液，再加100uL培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、10yg/mLConA及l(fā)Oyg/mLLPS (陽(yáng) 性對(duì)照)及含有不同濃度的樣品溶液，置5%0)2， 37'C培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，于每孔加 入5mg/mL的MTT20y L，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入酸化的20%的SDS溶液120 u L裂解細(xì)胞 過(guò)夜，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的吸光值(測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm)，計(jì)算增殖指數(shù)SI:
樣品孔的吸光值 _陰性對(duì)照孔的吸光值
脾淋巴細(xì)胞經(jīng)尼龍毛柱分離后可獲得一定純度的T、 B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 6X 106/mL，利用MTT法測(cè)定不同濃度的UA對(duì)T、 B淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖5.4?？?以看出，不同濃度的UA對(duì)小鼠脾臟的T、 B淋巴細(xì)胞具有顯著的刺激增列的作用，且均呈 現(xiàn)一定劑量依賴性。
表二UA對(duì)小鼠T、 B淋巴細(xì)胞增殖的影響(S±s， n=8)
組劑量Og/mL)波長(zhǎng)A540
Control-0.372 土 0.007
UA0.628 ±0.006**
100.785 ±0.007**
200.851 ±0.008**
400.962 ±0.008**
*P<0.05為顯著差異；**P<0.01為極顯著差異
權(quán)利要求
1、烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)藥品中的應(yīng)用。
2、 烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)藥品、保健品中的應(yīng)用。所述材料含量有20至100%的烏索酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或要求2所述的用途，可顯著促進(jìn)脾細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖 的作用。
4、 如權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)要求的用途，其中是藥物、食品或食品添加劑。
5、 烏索酸或其衍生物在制備用于制備免疫調(diào)節(jié)劑在藥物、食品或食品添加劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)劑的新應(yīng)用，即烏索酸在制備免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品中的應(yīng)用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明烏索酸對(duì)小鼠脾細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)增殖的作用。無(wú)論將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他藥物配合使用，只要制備成藥品或保健品均具有免疫調(diào)節(jié)作用。
文檔編號(hào)A61K31/56GK101444518SQ200810136610
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者陸云華 申請(qǐng)人:宜春學(xué)院