專利名稱：烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的 的用途，通過實(shí)驗(yàn)表明烏索酸可以改變肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的分裂周期，誘導(dǎo)肝 癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的凋亡。烏索酸可以制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
背景技術(shù)：
烏索酸(Ursolic acid， UA)，又名熊果酸、烏蘇酸，屬五環(huán)三萜類化合物，據(jù)不完全統(tǒng) 計(jì)，自然界已有34科108種植物中發(fā)現(xiàn)烏索酸，如玄參植物毛泡桐的葉，杜鵑花科植物熊果的 葉、果實(shí)等。烏索酸為脂溶性物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜發(fā)揮作用，并且具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)， 其突出作用為抗腫瘤，保肝護(hù)肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生蟲和促進(jìn)造血 系統(tǒng)功能恢復(fù)等藥理等作用。 抗肝損傷
在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，UA對(duì)CCU引起的大、小鼠急、慢性肝損傷具有明顯的保護(hù)和治療 作用。能使動(dòng)物血清SGPT1SB及肝甘油三酯顯著降低，血清甘油三酯、e-脂蛋白、a 1、 a2球 蛋白、肝糖原、及肝臟羥脯氨酸含量明顯增加，A/G比值倒置有改善作用，肝細(xì)胞變性、壞 死明顯減輕。證實(shí)UA對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有顯著的保護(hù)和治療作用。實(shí)驗(yàn)研究還表明UA有明顯 抗慢肝和抗纖維化等作用。說明UA可以使肝臟合成較多的載脂蛋白，使TG從肝臟運(yùn)輸入血， 從而減輕肝脂變。Liu報(bào)道UA可以降低由CCU(15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯 化鎘所至CF-1小鼠肝損傷的程度，使肝金屬硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分異構(gòu) 體OA在降低化學(xué)試劑誘發(fā)的小鼠肝損傷方面更具優(yōu)勢(shì)。SamSwatB， MiuraN等人的實(shí)驗(yàn)研 究均證實(shí)UA具有明顯抗肝損傷作用。
利膽退黃
實(shí)驗(yàn)研究表明UA能增加正常大鼠和膽汁瘀積性肝炎大鼠膽汁流量，使APIT模型動(dòng)物 的血清SB含量明顯降低，肝組織病理損傷顯著減輕，具有保肝、利膽、退黃的作用。 抗肝炎
臨床預(yù)試采用病例隨機(jī)分組，雙盲給藥，以齊墩果酸(OA)為對(duì)照的方法，用UA治療甲、 乙型急性病毒性肝炎102例，劑量為120mg/日，60mg/次，平均治療時(shí)間21天，治愈率89.3 % ， 優(yōu)于同期IOO例OA對(duì)照組的效果(68。/(0(尸〈O.OU 。臨床試驗(yàn)表明UA有顯著而迅速降低谷 丙轉(zhuǎn)氨酶，消退黃疸，增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用。服藥60天后，對(duì)21例HBeAg陽性患者 的轉(zhuǎn)陰率為61.4%，對(duì)21例HBsAg陽性患者的轉(zhuǎn)陰率為23.8% ，對(duì)乙肝病毒具有一定的治療作用。UA治療的102例患者，停藥l年后隨訪了卯例，結(jié)果89例肝功能復(fù)査正常，僅l例 谷丙轉(zhuǎn)氨酶反跳為110u ，后經(jīng)服用UA治療又恢復(fù)正常，表明UA療效穩(wěn)定。UA在制備治療 病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用，不論將UA單獨(dú)使用，還是與其它藥物配合使用，只要制備成藥品 或保健藥品均具有顯著治療病毒性肝炎的作用。 毒性實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，UA劑量下未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kgUA —次，觀察 72小時(shí)，未見動(dòng)物死亡或明顯毒副作用，體重、食欲、活動(dòng)均未受到影響。小鼠口服UA的 LD50為8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50為637mg/kg。家兔急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，以2.4g/ kg十二腸給藥，觀察24小時(shí)，對(duì)兔呼吸、血壓、心電圖無明顯影響；亞急性毒性實(shí)驗(yàn)表明 大鼠口服UA500mg/kg/日X30天，對(duì)大鼠的生長、血象、心電圖、肝腎功能都無明顯影響， 其心、肝、脾、肺、腎組織病檢也未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。該劑量是臨床成人每日用量(2.4mg/kg/ 日)的208倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者服用 UA未見明顯毒性反應(yīng)。用藥期間進(jìn)行心電圖、肝功能、血、尿常規(guī)檢査，未發(fā)現(xiàn)異常改變。 認(rèn)為目前口服劑量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。個(gè)別患者在服藥初期或空腹服用時(shí)上腹部稍 感不適，未經(jīng)處理而自行消失。
抗腫瘤作用
近年發(fā)現(xiàn)UA具有明顯的抗腫瘤作用，其抗腫瘤譜廣，不僅對(duì)多種致癌、促癌物有抵抗作 用，而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)分化作用及抗血管形成作用。 對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒作用
UA能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。Lee等用UA進(jìn)行了多種細(xì)胞系的細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果表明UA對(duì) P-388和L1210白血病細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，ED50均小于4mg/L ;對(duì)KB 腫瘤細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、乳腺癌細(xì)胞MCF-7顯示邊緣細(xì)胞毒作用。Young等從枇杷 葉提取UA，腹腔注射能明顯延長荷S180小鼠生存期，當(dāng)UA的濃度為5、 10umol/L時(shí)，S180 細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明瘤重的減輕是由于UA對(duì)S180的細(xì)胞毒作用所致。Kim從白花蛇舌草中 提取UA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示UA對(duì)所測(cè)的腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。Simon、黃鏡等實(shí) 驗(yàn)證明:UA能抑制HL-60細(xì)胞增殖、生長及合成DNA,誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。Beek等實(shí)驗(yàn)表 明胞內(nèi)03++信號(hào)增強(qiáng)與HL-60細(xì)胞凋亡是密切相關(guān)的。Kim等深入研究UA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 凋亡的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UA能促進(jìn)人肝癌(HepG2)細(xì)胞凋亡，降低HepG2細(xì)胞活力，并 有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，30umol/L的UA能引起DNA的斷裂，產(chǎn)生亞二倍體細(xì)胞，增 加細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞色素C依賴的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的激活。細(xì) 胞周期分析結(jié)果顯示，細(xì)胞主要被阻滯在G0期和G1期，并伴S期細(xì)胞數(shù)的下降，而且UA增加了p21WAF!的表達(dá)，在體外試驗(yàn)中，UA顯著抑制SV40DNA復(fù)制的啟始，并大大減少拓?fù)洚?構(gòu)酶-l的DNA斷裂，顯著降低復(fù)制蛋白A的單鏈DNA的結(jié)合活性。這提示UA通過阻斷起始 階段復(fù)制叉的建立，從而抑制DNA的復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞周期終止。因此認(rèn)為，UA使p2lWA^ 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和caspase-3激活，抑制DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡 和細(xì)胞周期終止。
抗腫瘤血管形成作用
新生血管形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的至關(guān)重要的病理過程，而在腫瘤新生血管形成過程中， 血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的活化、增殖、遷移及小管形成是其關(guān)鍵步驟。事實(shí)證明，血管再生是 實(shí)體瘤的增長和轉(zhuǎn)移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以達(dá)到控制腫瘤生長和轉(zhuǎn) 移的目的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多血管再生抑制劑，如魚精蛋白、干擾素、血小板因子-4等。這類 抑制劑毒性很大，限制了其在臨床上的應(yīng)用。SohoKH等以雞胚胎絨毛試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縐A的 抗血管作用，結(jié)果表明UA是很強(qiáng)的血管生成抑制劑，有效濃度為4nmol/egg ， ID50為 10nmol/egg。該濃度下無細(xì)胞毒作用，UA抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ID50為5umo1/L。王杰 軍等用20。/。胎牛血清的培養(yǎng)液使VEC呈指數(shù)生長狀態(tài)。而增殖期VEC具有增殖、遷移及小 血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA對(duì)VEC增殖具有抑制作用，并有劑量依 賴性。
抑制腫瘤形成生長
UA對(duì)腫瘤形成生長各階段具有預(yù)防和抑制作用。UA能抗DNA突變、抑制癌變的啟動(dòng)。 Ames試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)UA能對(duì)抗致癌物如苯并芘[B(a)P]，黃曲霉毒素B1誘發(fā)基因突變。UA還 具有抗誘變和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞Epstein Bar病毒早期抗體 (EBV-EA)活化試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠砗Y選皮膚癌促癌物的抑制劑，發(fā)現(xiàn)UA對(duì)TPA誘導(dǎo)Raji細(xì)胞EBV-EA 活化具有幾乎同維甲酸相同的抑制作用，并使Raji細(xì)胞的存活率更高;利用同位素標(biāo)記的佛酯 化合物SH-PDB2證明UA不影響TPA與受體的結(jié)合，即UA不是通過競(jìng)爭(zhēng)TPA位點(diǎn)，而是有效 地阻斷促癌物與受體結(jié)合后的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在二階段致癌實(shí)驗(yàn)中，Huang等發(fā)現(xiàn)UA明顯抑 制TPA對(duì)二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌的促癌作用。實(shí)驗(yàn)證明UA對(duì)TPA誘導(dǎo)的表 皮ODC活性增強(qiáng)有抑制作用。這些作用可能是由于UA阻斷ODC，引起多胺枯竭，導(dǎo)致生長 抑制，使細(xì)胞積累在G1期并出現(xiàn)分化。實(shí)驗(yàn)表明，UA可能通過抗氧化作用起到抗始發(fā)突變 與抗促癌作用?；钚匝踝杂苫c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Balanehru和Nagarajan研究表明UA 有較強(qiáng)的抗氧化作用和捕獲O2-自由基的能力，在肝微粒體和P450單胺氧化酶系中對(duì)脂質(zhì)過氧 化均有較強(qiáng)的抑制作用。另有實(shí)驗(yàn)表明UA能抑制花生四烯酸代謝過程中5-脂氧合酶、環(huán)氧合 酶活性，阻止前列腺素與白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明烏索酸能抑制人乳腺上皮細(xì)胞中的環(huán)氧合酶2的轉(zhuǎn)錄，也由此抑制前列腺素2生成。 誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用
癌是一類生長失控，分化差或未分化的疾病。治療癌的新途徑是誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化為良性 或正常細(xì)胞。Lee等報(bào)道7.5umol/L的UA可以誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞成為內(nèi)胚層細(xì)胞，并且引起與 其分化有關(guān)的IV型膠原及維甲酸受體表達(dá)增加，且能導(dǎo)致M1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。UA誘導(dǎo) 癌細(xì)胞分化成正常細(xì)胞可能因UA結(jié)構(gòu)上類似于糖皮質(zhì)激素通過與GS-R受體或類似的核受體 結(jié)合發(fā)揮作用有關(guān)。Cha等對(duì)侵襲性最強(qiáng)的人HT1080纖維瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)表明UA能降 低基質(zhì)金屬酶9 (MMP- 9)基因的表達(dá)從而對(duì)抗人HT1080纖維瘤細(xì)胞的侵襲性。
抗艾滋病病毒作用
實(shí)驗(yàn)研究表明，從桑毛路邊青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV 蛋白酶的作用。
增強(qiáng)免疫功能作用
UA能使小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著提高，體內(nèi)試驗(yàn)表明可明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。 You等研究發(fā)現(xiàn)UA能誘導(dǎo)小鼠休止巨噬細(xì)胞釋放NO、 TNF-a增多，并呈劑量依賴性，這 是通過核因子-KB(NF-KB)復(fù)合物介導(dǎo)，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF- a的 mRNA水平提高，從而上調(diào)iNOS和TNF-a的表達(dá)，增加NO、 TNF-a的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤 活性。Hsu等試驗(yàn)先給小鼠腹腔內(nèi)注射UA， 30分鐘后再以亞致死量全身照射4Gy,結(jié)果顯示 UA能通過植物血凝素的介導(dǎo)，加強(qiáng)照射后脾母細(xì)胞化的反應(yīng)，使效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)B淋 巴細(xì)胞大量增多，加強(qiáng)外周血細(xì)胞的作用，從而減輕放射后造血組織的損傷。
抗炎抑菌作用
Maria等實(shí)驗(yàn)結(jié)果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酯(EPP)誘發(fā)的耳水腫，劑量為015mg/ 耳，抑制率分別為73.4%、 30.3%;抑制角叉菜膠誘發(fā)的水腫，口服劑量為100mg/kg，抑制率 為35.5 %;抑制由血清素誘發(fā)的水腫，劑量為50mg/kg,抑制率為48.6 %;抑制由放射菌素0和 放射菌素酮誘發(fā)的鼠爪水腫，劑量為50mg/kg，抑制率分別為47.5%、 47.4%。另有報(bào)道大鼠 每天腹腔注射12.5mg/kgX7d ，有延緩植入羊毛球的發(fā)熱過程，增加肝糖原，降低心、橫紋 肌及肌糖原，有糖皮質(zhì)激素樣作用，臨床用作膠原抑制劑。
UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生長，其最低抑菌濃度為300ug/ml 、 50 - 400ug/ml、 200 - 800ug/ ml、 100 - 700ug/ ml ;能抑制羊毛小孢子菌的生長;降低暴露在H印es 單病毒中的Verd細(xì)胞的細(xì)胞病變程度。
降血脂抗動(dòng)脈粥樣硬化作用
蘇聯(lián)學(xué)者Parfentena等發(fā)現(xiàn)UA可以降低家兔和大鼠血膽固醇(44%)和e-脂蛋白水平(50%)，具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種烏索酸在制備烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的新用 途，即烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。無論將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他 藥物配合使用，只要制備成藥品或保健品均具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
本發(fā)明所述的烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的用途，其特征在于所述的烏索酸 可以改變肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病細(xì)胞的分裂周期，顯著抑制肺癌、胃癌、肝癌、 乳腺癌、白血病細(xì)胞的細(xì)胞分裂。
本發(fā)明用MTT法證明烏索酸明顯抑制肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖。MTT法 是現(xiàn)代檢測(cè)細(xì)胞存活率最經(jīng)典的基本方法。該法利用活細(xì)胞具酶活性而死細(xì)胞無酶活性的原 理設(shè)計(jì)。因?yàn)辄S色的四氮唑[MTT]能接受脫氫酶給予的氫原子而轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色的甲次；活細(xì) 胞因具脫氫酶，故能被染成藍(lán)紫色。死細(xì)胞無活性脫氫酶，故不呈藍(lán)紫色，培養(yǎng)液中活細(xì)胞 越多，藍(lán)紫色越深。
進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入二甲基亞砜(DMSO)，可使藍(lán)紫色的藍(lán)次溶出。培養(yǎng)液中活 細(xì)胞越多，藍(lán)紫色越深，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的吸光值(測(cè)定波長490nm)可測(cè)得其光密度值 (A值)，根據(jù)其與對(duì)照組A值相比，可定量折算相對(duì)抑瘤率
相對(duì)抑瘤率=(處理孔的光密度值/空白對(duì)照孔的光密度值)X100%
結(jié)果發(fā)現(xiàn)烏索酸即使在微量濃度下(5--6(Hig/ml)，對(duì)人肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌細(xì) 胞都有顯著的增殖抑制作用。且抑制強(qiáng)度與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。即烏索酸濃度越 高，作用時(shí)間越長，抑制率越高。烏索酸在3(Htg/ml的濃度下，作用1天，它對(duì)人乳腺癌細(xì) 胞(MCF-7)的抑制率為21.3%;作用2天，它對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的抑制率為41.2%; 作用3天，它對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的抑制率為76.8%。
結(jié)果還發(fā)現(xiàn)烏索酸抑制腫瘤細(xì)胞增殖是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。通過流式 細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，烏索酸作用于人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)后，出現(xiàn)能明顯的凋亡峰，能誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞的凋亡。
在臨床使用中，可以將本發(fā)明烏索酸制成片劑、固體分散體、滴丸、納米粒等口服 制劑，建議臨床成人每日用量(24mg/kg'd)，每日分3次服用，30天一個(gè)療程。
本發(fā)明將通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
烏索酸的提取分離 材料與方法
材料枇杷葉藥渣為水煎法生產(chǎn)枇杷糖漿的廢棄物，外觀小條形，色黑,由江西海爾思藥 業(yè)公司提供。
試劑食用級(jí)95%乙醇(廣西糖廠生產(chǎn))；"YCXY21號(hào)"除雜劑(自制)，活性炭，分析 純(上海豪申化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；烏索酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供)。
儀器FC2204分析天平(上海天平分析儀器廠)；Perkin Elmer傅立葉變換紅外光譜儀(美國)。
方法
工藝流程。采用"醇提凝析法"新工藝提取分離。
枇杷葉藥渣一加乙醇回流提取一回收乙醇一用除雜劑除雜一活性炭脫色一凝析分離一純 化精制一烘干一烏索酸。
具體操作。取干燥的枇杷葉藥渣l kg，共3份，分別用7倍量90%乙醇分2次于80 。C回 流提取各lh，合并提取液，回收乙醇后，用"YCXY21號(hào)"除雜劑除雜，再用活性炭脫色， 經(jīng)凝析分離、純化精制即得。
結(jié)果與分析
烏索酸的產(chǎn)率將所得產(chǎn)品于105 'C烘干24h，稱重。
性狀鑒別產(chǎn)品為無色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不溶于石 油醚和水。 定性鑒別
L2B反應(yīng)。取樣品少許，以95%乙醇溶解，吸取乙醇溶液l滴，置試管中，力niml醋酐 試劑，搖勻，力nlml濃硫酸試劑，在醋酐與濃硫酸界面上呈紫紅色圓環(huán)。
薄層鑒定。取活化后的硅膠G硬板，將樣品的乙醇溶液點(diǎn)樣，同時(shí)用烏索酸對(duì)照品作對(duì) 照，以環(huán)己烷丙酮(3:1)為展開劑，展距10cm，取出晾干，噴霧10%硫酸乙醇溶液，于 105 'C加熱5 10min，結(jié)果在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)，在365 nm紫 外光下顯相同顏色的金黃色熒光斑點(diǎn)。
紅外光譜鑒定。產(chǎn)品IRKBrmaxu/cm:3 434(-OH)、 2 968、 2 927、 2 871(C-H)、 1 694(C =0)、 1 456、 1 384(CH3)、 1031 (C-O)。其特征吸收與烏索酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜完全一致。上 述分析結(jié)果證明，所得產(chǎn)品為烏索酸。實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)材料(以下細(xì)胞株均購自美國ATCC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫)
品系名稱
相關(guān)描述
Bel-7402 MGC803 A549 MCF-7
人肝癌細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株
GIBCO公司
GIBCO公司/杭州四季青公司
Fluka公司
Sigma公司
宜春學(xué)院天然藥物研究江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇森豪藥業(yè)股份有限公司
主要試劑
RPMI1640培養(yǎng)基干粉 小牛血清
Trypsin、畫SO、 MTT 青霉素、鏈霉素 Ursolic acid標(biāo)準(zhǔn)品 Cisplatin
培養(yǎng)基及常用溶液
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)基加入10%的小牛血清。含2g/L NaHC03，青霉素 100U/ml和鏈霉素100U/ml，過濾除菌，4。C保存。
PBS: 800ml水中溶解0.2gKCl， 0.44gNa2HPO^Q 0.24g KH2P04， HCl調(diào)節(jié)pH為7.4， 加水定容至1L，高壓滅菌。
消化液EDTA/PBS(無Ca"Mg")/胰蛋白酶緩沖液
主要儀器
C02培養(yǎng)箱
酶標(biāo)儀
熒光倒置相差顯微鏡
高速冷凍離心機(jī)
超低溫冰箱
微量高速離心機(jī)TGF-16G 恒溫水浴鍋 隔水式培養(yǎng)箱 高壓滅菌鍋
美國Thermo Forma公司
Bio Rad公司
德國Leica公司
日本HITACHI公司
日本SANYO公司
南京大學(xué)儀器廠 常州國華電器有限公司
上海?，敼?br> 上海三申醫(yī)療器械有限公司
9超凈工作臺(tái) 電子天平
6孔、24孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
蘇州凈化設(shè)備廠 上海民橋儀器有限公司 Corning Costar公司
實(shí)驗(yàn)方法
MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用
將細(xì)胞(活細(xì)胞率^95%)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔含3-5xl(^個(gè)細(xì)胞，空白孔不接種細(xì)胞， 置于37'C， 5%<:02飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)24hr貼壁后去掉培養(yǎng)基，加 入不同濃度的受試藥物，陰性孔和空白孔均加入無血清培養(yǎng)基作為對(duì)照，每孔200nl，細(xì)胞培 養(yǎng)44hr后吸去培養(yǎng)基，每孔加入5mg/ml MTT 20M1,溫育4hr。棄上清，每孔加入DMSO 150^1， 酶標(biāo)儀測(cè)定490nm值，按下式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率并作圖計(jì)算IC50。每個(gè)劑量濃度設(shè)3個(gè)平 行孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。
Inhibition Ratio(%)=(陰性孔OD值-試驗(yàn)孔OD值)/(陰性孔OD值-空白孔OD值)><100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果_
cell/drug/density 5ng/ml 10pg/ml 20ng/ml 40^g/ml IC50
Bel-7402/UA(o/o) MGC-803/UA(o/o) A549/UA(0/o) MCF-7/UA(%)
2.6±3.9 28.3±4.4 67.4*±2.6 80.1*±1.7 18.2fig/ml
7.9±2.3 14.9±3.8 37.7*±2.6 58.0*±4.9 31.2(Lig/ml
18.5±2.8 36.5±4.4 66.9±3.9 75.9±1.0 5.9pg/ml
5.4±4.8 6.7±1.2 41.9**±1.1 93.1**±3.0 19.1pg/ml
n=6，mean±SD,重復(fù)3次，*為P<0.05 (有顯著差異);**為P<0.01 (有極顯著差異) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏索酸能明顯抑制肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖<
實(shí)施例3
UA對(duì)腫瘤細(xì)胞分裂周期的調(diào)控 實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例2 主要試劑
碘化丙啶
轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM 2000 Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 RnaseA
RPMI1640培養(yǎng)基干粉
胰蛋白酶
Sigma公司 Invitrogen
Beckman Coulter公司
上海生工生物工程技術(shù)有限公司 Gibco公司 Amersco公司MTT Sigma公司
主要儀器
FACSCalibur流式細(xì)胞儀 Becton Dickinson公司
熒光倒置顯微鏡 Leica公司 主要溶液
PBST緩沖液 PBS緩沖液中加入0.1% Tween-20
其它同實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞的培養(yǎng)
腫瘤細(xì)胞在含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37°C， 5% (302的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 MTT檢測(cè)法
將4-5 X103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板的每孔，每孔180 yL，每組平行8孔，并設(shè)立空白， 陰性藥對(duì)照，陽性藥。44h后，棄上清，每孔加20 nL新配制的5g/LMTT，孵育4h，棄上 清，加150 uLDMSO溶解，混勻后用Bio-Rad型號(hào)的酶標(biāo)儀490nm波長測(cè)定。
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
用藥后48h ，細(xì)胞胰蛋白酶消化30s，收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，加入lmL乙醇固定過夜， 去乙醇，PBS洗兩遍，加入100uL濃度為10ug/mL的PI，混勻后室溫避光孵育30 min， 在反應(yīng)管中加400 y L PBS，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濃度為10昭/ml烏索酸作用48小時(shí)后，肝癌Bel-7402、胃癌MGC-803、 肺癌A549和乳腺癌細(xì)胞MCF-7均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡的特征細(xì)胞體積變小、形態(tài)不規(guī)則、 細(xì)胞皺縮、核固縮、貼壁差等特點(diǎn)。10pg/ml烏索酸作用48小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)烏 索酸作用后，肝癌Bel-7402、胃癌MGC-803、肺癌A549和乳腺癌細(xì)胞MCF-7均出現(xiàn)明顯的 凋亡峰。
權(quán)利要求
1、烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的用途。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的用途，其特征在于所述的 烏索酸可以誘導(dǎo)肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的凋亡，顯著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳 腺癌細(xì)胞增殖。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或要求2所述的特征在于烏索酸可以制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了烏索酸在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的用途，通過實(shí)驗(yàn)表明烏索酸可以誘導(dǎo)肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌細(xì)胞凋亡，顯著抑制肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。烏索酸可以制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/56GK101444515SQ20081013660
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者陸云華 申請(qǐng)人:宜春學(xué)院