專利名稱：：烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明公開了烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，即烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。無論將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他藥物配合使用，只要制備成抗腫瘤藥物均具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
背景技術(shù)：
：烏索酸(Ursolicacid，UA)，又名熊果酸、烏蘇酸，屬五環(huán)三萜類化合物，存在于多種植物中，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在自然界已有34科108種植物中分離得到烏索酸，如杜鵲花科植物熊果的葉、果實(shí)，玄參植物毛泡桐的葉等。烏索酸為脂溶性物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜發(fā)揮作用，并且具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其突出作用為抗腫瘤，保肝護(hù)肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生蟲和促進(jìn)造血系統(tǒng)功能恢復(fù)等藥理等作用?？垢窝着R床預(yù)試采用病例隨機(jī)分組，雙盲給藥，以齊墩果酸(OA)為對照的方法，用UA治療甲、乙型急性病毒性肝炎102例，劑量為120mg/日，60mg/次，平均治療時(shí)間21天，治愈率89.3%，優(yōu)于同期IOO例0八對照組的效果(68%)(尸<0.01>。臨床試驗(yàn)表明UA有顯著而迅速降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，消退黃疸，增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用。服藥60天后，對21例HBeAg陽性患者的轉(zhuǎn)陰率為61.4%，對21例HBsAg陽性患者的轉(zhuǎn)陰率為23.8%，對乙肝病毒具有一定的治療作用。UA治療的102例患者，停藥l年后隨訪了90例，結(jié)果89例肝功能復(fù)查正常，僅l例谷丙轉(zhuǎn)氨酶反跳為110u，后經(jīng)服用UA治療又恢復(fù)正常，表明UA療效穩(wěn)定。UA在制備治療病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用，不論將UA單獨(dú)使用，還是與其它藥物配合使用，只要制備成藥品或保健藥品均具有顯著治療病毒性肝炎的作用?？垢螕p傷在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，UA對CCU引起的大、小鼠急、慢性肝損傷具有明顯的保護(hù)和治療作用。能使動(dòng)物血清SGPT1SB及肝甘油三酯顯著降低，血清甘油三酯、e-脂蛋白、a1、a2球蛋白、肝糖原、及肝臟羥脯氨酸含量明顯增加，A/G比值倒置有改善作用，肝細(xì)胞變性、壞死明顯減輕。證實(shí)UA對實(shí)驗(yàn)性肝損傷有顯著的保護(hù)和治療作用。實(shí)驗(yàn)研究還表明UA有明顯抗慢肝和抗纖維化等作用。說明UA可以使肝臟合成較多的載脂蛋白，使TG從肝臟運(yùn)輸入血，從而減輕肝脂變。Liu報(bào)道UA可以降低由CCl4(15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯化鎘所至CF-1小鼠肝損傷的程度，使肝金屬硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分異構(gòu)體OA在降低化學(xué)試劑誘發(fā)的小鼠肝損傷方面更具優(yōu)勢。SaraSwatB，MiuraN等人的實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)UA具有明顯抗肝損傷作用。利膽退黃實(shí)驗(yàn)研究表明UA能增加正常大鼠和膽汁瘀積性肝炎大鼠膽汁流量，使APIT模型動(dòng)物的血清SB含量明顯降低，肝組織病理損傷顯著減輕，具有保肝、利膽、退黃的作用。毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，UA劑量下未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kgUA—次，觀察72小時(shí)，未見動(dòng)物死亡或明顯毒副作用，體重、食欲、活動(dòng)均未受到影響。小鼠口服UA的LD50為8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50為637mg/kg。家兔急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，以2.4g/kg十二腸給藥，觀察24小時(shí)，對兔呼吸、血壓、心電圖無明顯影響;亞急性毒性實(shí)驗(yàn)表明大鼠口服UA500mg/kg/日X30天，對大鼠的生長、血象、心電圖、肝腎功能都無明顯影響，其心、肝、脾、肺、腎組織病檢也未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。該劑量是臨床成人每日用量(2.4mg/kg/日)的208倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者服用UA未見明顯毒性反應(yīng)。用藥期間進(jìn)行心電圖、肝功能、血、尿常規(guī)檢查，未發(fā)現(xiàn)異常改變。認(rèn)為目前口服劑量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。個(gè)別患者在服藥初期或空腹服用時(shí)上腹部稍感不適，未經(jīng)處理而自行消失?？鼓[瘤作用近年發(fā)現(xiàn)UA具有明顯的抗腫瘤作用，其抗腫瘤譜廣，不僅對多種致癌、促癌物有抵抗作用，而且對多種腫瘤細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)分化作用及抗血管形成作用。抑制腫瘤形成生長UA對腫瘤形成生長各階段具有預(yù)防和抑制作用。UA能抗DNA突變、抑制癌變的啟動(dòng)。Ames試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)UA能對抗致癌物如苯并芘[B(a)P],黃曲霉毒素B1誘發(fā)基因突變。UA還具有抗誘變和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞EpsteinBar病毒早期抗體(EBV-EA)活化試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠砗Y選皮膚癌促癌物的抑制劑，發(fā)現(xiàn)UA對TPA誘導(dǎo)Raj湖胞EBV-EA活化具有幾乎同維甲酸相同的抑制作用，并使Raji細(xì)胞的存活率更高;利用同位素標(biāo)記的佛酯化合物SH-PDB2證明UA不影響TPA與受體的結(jié)合，即UA不是通過競爭TPA位點(diǎn)，而是有效地阻斷促癌物與受體結(jié)合后的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在二階段致癌實(shí)驗(yàn)中，Huang等發(fā)現(xiàn)UA明顯抑制TPA對二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌的促癌作用。實(shí)驗(yàn)證明UA對TPA誘導(dǎo)的表皮ODC活性增強(qiáng)有抑制作用。這些作用可能是由于UA阻斷ODC，引起多胺枯竭，導(dǎo)致生長抑制，使細(xì)胞積累在G1期并出現(xiàn)分化。實(shí)驗(yàn)表明，UA可能通過抗氧化作用起到抗始發(fā)突變與抗促癌作用?；钚匝踝杂苫c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Balanehru和Nagarajan研究表明UA有較強(qiáng)的抗氧化作用和捕獲02-自由基的能力，在肝微粒體和P450單胺氧化酶系中對脂質(zhì)過氧化均有較強(qiáng)的抑制作用。另有實(shí)驗(yàn)表明UA能抑制花生四烯酸代謝過程中5-脂氧合酶、環(huán)氧合酶活性，阻止前列腺素與白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明烏索酸能抑制人乳腺上皮細(xì)胞中的環(huán)氧合酶2的轉(zhuǎn)錄，也由此抑制前列腺素2生成。誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用癌是一類生長失控，分化差或未分化的疾病。治療癌的新途徑是誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化為良性或正常細(xì)胞。Lee等報(bào)道7.5umol/L的UA可以誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞成為內(nèi)胚層細(xì)胞，并且引起與其分化有關(guān)的IV型膠原及維甲酸受體表達(dá)增加，且能導(dǎo)致M1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。UA誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化成正常細(xì)胞可能因UA結(jié)構(gòu)上類似于糖皮質(zhì)激素通過與GS-R受體或類似的核受體結(jié)合發(fā)揮作用有關(guān)。Cha等對侵襲性最強(qiáng)的人HT1080纖維瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)表明UA能降低基質(zhì)金屬酶9(MMP-9)基因的表達(dá)從而對抗人HT1080纖維瘤細(xì)胞的侵襲性。抗腫瘤血管形成作用新生血管形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的至關(guān)重要的病理過程，而在腫瘤新生血管形成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的活化、增殖、遷移及小管形成是其關(guān)鍵步驟。事實(shí)證明，血管再生是實(shí)體瘤的增長和轉(zhuǎn)移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以達(dá)到控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多血管再生抑制劑，如魚精蛋白、干擾素、血小板因子-4等。這類抑制劑毒性很大，限制了其在臨床上的應(yīng)用。SohoKH等以雞胚胎絨毛試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縐A的抗血管作用，結(jié)果表明UA是很強(qiáng)的血管生成抑制劑，有效濃度為4nmol/egg，ID50為10nmol/egg。該濃度下無細(xì)胞毒作用，UA抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ID50為5umo1/L。王杰軍等用20。/。胎牛血清的培養(yǎng)液使VEC呈指數(shù)生長狀態(tài)。而增殖期VEC具有增殖、遷移及小血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA對VEC增殖具有抑制作用，并有劑量依賴性。對腫瘤的細(xì)胞毒作用UA能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。Lee等用UA進(jìn)行了多種細(xì)胞系的細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果表明UA對P-388和L1210白血病細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，ED50均小于4mg/L;對KB腫瘤細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、乳腺癌細(xì)胞MCF-7顯示邊緣細(xì)胞毒作用。Young等從枇杷葉提取UA，腹腔注射能明顯延長荷S180小鼠生存期，當(dāng)UA的濃度為5、10umol/L時(shí)，S180細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明瘤重的減輕是由于UA對S180的細(xì)胞毒作用所致。Kim從白花蛇舌草中提取UA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示UA對所測的腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。Simon、黃鏡等實(shí)驗(yàn)證明:UA能抑制HL-60細(xì)胞增殖、生長及合成DNA，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。Beek等實(shí)驗(yàn)表明胞內(nèi)Ca+十信號(hào)增強(qiáng)與HL-60細(xì)胞凋亡是密切相關(guān)的。Kim等深入研究UA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UA能促進(jìn)人肝癌(HepG2)細(xì)胞凋亡，降低HepG2細(xì)胞活力，并有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，30umol/L的UA能引起DNA的斷裂，產(chǎn)生亞二倍體細(xì)胞，增加細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞色素C依賴的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的激活。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，細(xì)胞主要被阻滯在G0期和G1期，并伴S期細(xì)胞數(shù)的下降，而且UA增加了p21WAF!的表達(dá)，在體外試驗(yàn)中，UA顯著抑制SV40DNA復(fù)制的啟始，并大大減少拓?fù)洚悩?gòu)酶-l的DNA斷裂，顯著降低復(fù)制蛋白A的單鏈DNA的結(jié)合活性。這提示UA通過阻斷起始階段復(fù)制叉的建立，從而抑制DNA的復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞周期終止。因此認(rèn)為，UA使p2lWA"表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和caspase-3激活，抑制DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期終止。增強(qiáng)免疫功能作用UA能使小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著提高，體內(nèi)試驗(yàn)表明可明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。You等研究發(fā)現(xiàn)UA能誘導(dǎo)小鼠休止巨噬細(xì)胞釋放NO、TNF-ci增多，并呈劑量依賴性，這是通過核因子-KB(NF-KB)復(fù)合物介導(dǎo)，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF-a的mRNA水平提高，從而上調(diào)iNOS和TNF-a的表達(dá)，增加NO、TNF-a的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤活性。Hsu等試驗(yàn)先給小鼠腹腔內(nèi)注射UA，30分鐘后再以亞致死量全身照射4Gy，結(jié)果顯示UA能通過植物血凝素的介導(dǎo)，加強(qiáng)照射后脾母細(xì)胞化的反應(yīng)，使效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)B淋巴細(xì)胞大量增多，加強(qiáng)外周血細(xì)胞的作用，從而減輕放射后造血組織的損傷?？拱滩〔《咀饔脤?shí)驗(yàn)研究表明，從桑毛路邊青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV蛋白酶的作用?？寡滓志饔肕aria等實(shí)驗(yàn)結(jié)果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酯(EPP)誘發(fā)的耳水腫，劑量為015mg/耳，抑制率分別為73.4%、30.3%;抑制角叉菜膠誘發(fā)的水腫，口服劑量為100mg/kg，抑制率為35.5%;抑制由血清素誘發(fā)的水腫，劑量為50mg/kg，抑制率為48.6。/。;抑制由放射菌素D和放射菌素酮誘發(fā)的鼠爪水腫，劑量為50mg/kg，抑制率分別為47.5%、47.4%。另有報(bào)道大鼠每天腹腔注射12.5mg/kgX7d，有延緩植入羊毛球的發(fā)熱過程，增加肝糖原，降低心、橫紋肌及肌糖原，有糖皮質(zhì)激素樣作用，臨床用作膠原抑制劑。UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生長，其最低抑菌濃度為300ug/ml、50-400ug/ml、200-800ug/ml、100-700ug/ml;能抑制羊毛小孢子菌的生長;降低暴露在Hepes單病毒中的Verd細(xì)胞的細(xì)胞病變程度。降血脂抗動(dòng)脈粥樣硬化作用蘇聯(lián)學(xué)者Parfentena等發(fā)現(xiàn)UA可以降低家兔和大鼠血膽固醇(44%)和P-脂蛋白水平(50%),具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的新用途，即烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。無論將烏索酸單獨(dú)使用，還是與其他藥物配合使用，只要制備成藥品或保健品均具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。本發(fā)明烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，其特征在于通過用MTT法實(shí)驗(yàn)表明烏索酸可以改變?nèi)橄侔⑽赴?、肝癌?xì)胞對IV型膠原蛋白的黏附力，烏索酸能改變?nèi)橄侔?、胃癌、肝癌?xì)胞的黏附力。她謹(jǐn)她W=l-A廣威:A一x!00%本發(fā)明烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，其特征在于通過用劃痕損傷模型實(shí)驗(yàn)表明烏索酸可以抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞在二維水平的遷移能力。utimezero"timepointMigrationrate(%)=^timezero本發(fā)明烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，其特征在于通過用侵襲小室模型實(shí)驗(yàn)表明烏索酸可以抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞在三維水平的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表明烏索酸可以改變?nèi)橄侔?、胃癌、肝癌?xì)胞的黏附力，烏索酸能改變?nèi)橄侔⑽赴?、肝癌?xì)胞的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞的遷移能力。在臨床使用中，可以將本發(fā)明烏索酸制成片劑、固體分散體、滴丸、納米粒等口服制劑，建議臨床成人每日用量(24mg/kg'd)，每日分3次服用，30天一個(gè)療程。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1枇杷葉藥渣中烏索酸的提取分離材料與方法材料枇杷葉藥渣為水煎法生產(chǎn)枇杷糖漿的廢棄物，外觀小條形，色黑,由江西海爾思藥業(yè)公司提供。試劑食用級(jí)95%乙醇(廣西糖廠生產(chǎn))；"YCXY21號(hào)"除雜劑(自制)，活性炭，分析純(上海豪申化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；烏索酸對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)。儀器FC2204分析天平(上海天平分析儀器廠)；PerkinElmer傅立葉變換紅外光譜儀(美國)。方法工藝流程。采用"醇提凝析法"新工藝提取分離。枇杷葉藥渣一加乙醇回流提取一回收乙醇一用除雜劑除雜一活性炭脫色一凝析分離一純化精制一烘干一烏索酸。具體操作。取干燥的枇杷葉藥渣lkg，共3份，分別用7倍量卯％乙醇分2次于80。C回流提取各lh，合并提取液，回收乙醇后，用"YCXY21號(hào)"除雜劑除雜，再用活性炭脫色，經(jīng)凝析分離、純化精制即得。結(jié)果與分析烏索酸的產(chǎn)率將所得產(chǎn)品于105t:烘干24h，稱重。性狀鑒別產(chǎn)品為無色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不溶于石油醚和水。定性鑒別L2B反應(yīng)。取樣品少許,以95%乙醇溶解，吸取乙醇溶液l滴，置試管中，力Blml醋酐試劑，搖勻，力Blml濃硫酸試劑，在醋酐與濃硫酸界面上呈紫紅色圓環(huán)。薄層鑒定。取活化后的硅膠G硬板，將樣品的乙醇溶液點(diǎn)樣，同時(shí)用烏索酸對照品作對照，以環(huán)己垸丙酮(3:1)為展開劑，展距10cm，取出晾干，噴霧10%硫酸乙醇溶液，于105。C加熱510min，結(jié)果在與對照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)，在365nm紫外光下顯相同顏色的金黃色熒光斑點(diǎn)。紅外光譜鑒定。產(chǎn)品IRKBrmaxu/cm:3434(-OH)、2968、2927、2871(CH)、1694(C=0)、1456、1384(CH3)、1031(C-O)。其特征吸收與烏索酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜完全一致。上述分析結(jié)果證明，所得產(chǎn)品為烏索酸。實(shí)施例2UA改變腫瘤細(xì)胞與IV型膠原蛋白間黏附能力實(shí)驗(yàn)材料人胃癌細(xì)胞MGC-803人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435人肝癌細(xì)胞株Bd-740224孔培養(yǎng)板Thincert侵襲小室(孔徑8nm)中國藥科大學(xué)腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)室中國藥科大學(xué)腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)室中國藥科大學(xué)新藥篩選中心Corning公司Greiner公司主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基干粉胰蛋白酶MTT主要儀器水平電泳槽恒溫振蕩器熒光倒置顯微鏡Gibco公司Amcrsco公司Sigma公司南京大學(xué)儀器廠上海智誠分析儀器制造公司Leica公司實(shí)驗(yàn)方法腫瘤細(xì)胞與IV型膠原蛋白間黏附能力的檢測參照Herren等的方法，采用MTT法測定癌細(xì)胞與IV型膠原蛋白間的黏附能力。具體操作如下IV型膠原蛋白包被96孔培養(yǎng)板將IV型膠原蛋白儲(chǔ)液用PBS稀釋成0.1mg/mL，按50pL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中，4'C過夜后再于37'C下孵育2h，然后吸去上情。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1.5X104個(gè)/孔接種到已包被IV型膠原蛋白的96孔培養(yǎng)板中；于37°C，5。/。CO2條件下培養(yǎng)0.5h后，將細(xì)胞分為兩組(1)黏附細(xì)胞組，用PBS小心洗滌2~3遍除去未黏附的細(xì)胞，然后采用MTT法測定黏附細(xì)胞的吸光度值；(2)總細(xì)胞組，不用PBS洗滌，直接采用MTT法測定吸光度值(A)。每組設(shè)6個(gè)平行孔。同時(shí)，測定IV型膠原蛋白包被但未接種細(xì)胞的孔作為空白對照(control)。按照如下公式計(jì)算黏附率(Adhesionrate):在&Adhesionra始=1--j-^-X1。。o凡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表l烏索酸改變腫瘤細(xì)胞對iv型膠原蛋白間黏附能力Cell/UA0ng/ml3.75ng/ml7.5ng/ml15ng/ml30ng/ml.60|ig/mlMDA-MB-435100%77.04*±0.8%61.41**±1.7%43.4**±2.5%22.56**±3.4%0.61**±4.1%MGC-8031000/。91.35±1.90/。84.09*±2.3%69.65**±4.70/058.67**±3.1%1.51**±2.2%Bel-74021000/o98.29±1.1%95.3±3.0%88.88*±2.9%71.99*±3.3%30,11**±3.1%注n=8，mean±SD,重復(fù)3次，*為？<0.05(有顯著差異)；"為P〈0.01(有極顯著差異)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏索酸能明顯改變?nèi)橄侔┘?xì)胞MDA-MB-435、胃癌細(xì)胞MGC-803和肝癌細(xì)胞Bel-7402對IV型膠原蛋白間黏附能力。實(shí)施例3UA抑制腫瘤細(xì)胞二維水平細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑實(shí)施例2二維水平細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)參照Nakayama等的方法，采用劃痕損傷模型分析烏索酸在二維水平上對腫瘤細(xì)胞的遷移能力的影響，操作步驟如下(1)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按6X104個(gè)/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)；(2)次日，待細(xì)胞長成均勻單層后，用無菌的1000pL移液器吸頭延孔的中軸線輕輕劃過。用37'C預(yù)熱的PBS輕輕洗滌23遍除去漂起的細(xì)胞殘骸后，加入37'C預(yù)熱的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)0.5lh后(待細(xì)胞恢復(fù))，以這一時(shí)間作為零時(shí)間點(diǎn)，分別在O、12、24h時(shí)通過倒置顯微鏡下(50X)觀察細(xì)胞遷移情況并利用目鏡刻度尺測量劃痕寬度(S)，每孔測量5處(即兩端、中點(diǎn)、左l/4處和右l/4處)求平均值，直至細(xì)胞完全匯合。每組細(xì)胞均設(shè)三個(gè)平行孔。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞遷移率(Migrationrate):S一Sutimezero"timepo(nlMigrationrate(%)=-^-X100%Otimezero<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏索酸能明顯改變?nèi)橄侔┘?xì)胞MDA-MB-435、胃癌細(xì)胞MGC-803和肝癌細(xì)胞Bel-7402二維水平細(xì)胞遷移能力。實(shí)施例4UA抑制腫瘤細(xì)胞三維水平細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑實(shí)施例2采用侵襲小室模型分析烏索酸在三維水平上對腫瘤細(xì)胞的遷移能力的影響，具體操作如下(1)將細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，用0.25%胰蛋白酶消化、無血清RPMI-1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2.5X105個(gè)/mL;(2)向24孔培養(yǎng)板中加入600含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后將Thincert侵襲小室浸入，再向小室中加入200pL無血清單細(xì)胞懸液(即5.0X10"個(gè)細(xì)胞)；(3)37°C，5%C02培養(yǎng)20h后，取出Thincert小室，用棉簽小心將膜上表面的細(xì)胞擦拭去除；(4)用手術(shù)刀片小心沿小室邊緣將膜切下，把膜下表面向上放在一個(gè)潔凈的24孔培養(yǎng)板的孔中；'(5)將膜用甲醇冰醋酸(3:1)固定10min，然后用10%姬姆薩染液染色15~30min;將膜用蒸餾水漂洗干凈后在倒置顯微鏡下(200X)隨機(jī)選取6個(gè)視野(上、下、左、右各一，中央兩個(gè))計(jì)數(shù)細(xì)胞(呈紫紅色)。表lUA抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞三維水平細(xì)胞遷移能力乳腺癌MDA-MB-435胃癌細(xì)胞MGC-803肝癌細(xì)胞Bel-7402負(fù)對照UA15pg/ml負(fù)對照UA15ug/ml負(fù)對照UA15ug/mlmean134.8378.99201.00166.00104.0096.40SD34.078.1915.557.9913.935.07實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏索酸能明顯改變?nèi)橄侔┘?xì)胞MDA-MB-435、胃癌細(xì)胞MGC-803和肝癌細(xì)胞Bel-7402三維水平細(xì)胞遷移能力。權(quán)利要求1、烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，其特征在于所述的烏索酸可以改變?nèi)橄侔?、胃癌、肝癌?xì)胞的黏附力，顯著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞的遷移能力。3、根據(jù)權(quán)利要求1或要求2所述的特征在于烏索酸可以改變?nèi)橄侔⑽赴?、肝癌?xì)胞對IV型膠原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞二維、三維水平上的遷移能力。4、如權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)要求的用途，其特征在于可以制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。全文摘要本發(fā)明屬于藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明公開了烏索酸在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途，通過實(shí)驗(yàn)表明烏索酸能改變?nèi)橄侔?、胃癌、肝癌?xì)胞的黏附力，顯著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞的遷移能力。文檔編號(hào)A61K31/56GK101444517SQ20081013660公開日2009年6月3日申請日期2008年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日發(fā)明者陸云華申請人:宜春學(xué)院