專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分的免疫功能調(diào)節(jié)劑以 及含有這種調(diào)節(jié)劑的飲食品和飼料。
背景技術(shù)：
神經(jīng)節(jié)苷脂是包括唾液酸在內(nèi)的糖脂質(zhì)的總稱，已知在生物體 中，腦和紅血球中含有大量神經(jīng)節(jié)苷脂。而且，已知在各種食品中也 含有神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是牛奶中含有大量神經(jīng)節(jié)苷脂。此外，就神經(jīng) 節(jié)普脂而言，已經(jīng)報(bào)道了對(duì)各種病毒或毒性細(xì)菌的抑制活性，對(duì)由于 腦缺血或帕金森病導(dǎo)致的腦功能障礙的治療效果，單核細(xì)胞或巨噬細(xì) 胞系細(xì)胞的分化促進(jìn)作用，上皮生長(zhǎng)因子受體的功能調(diào)節(jié)作用等各種 生理作用。奶中主要含有GD3和GM3這兩種神經(jīng)節(jié)苷脂，在經(jīng)口給藥 這些奶來(lái)源的神經(jīng)節(jié)普脂時(shí)，也報(bào)道了其具有提高學(xué)習(xí)能力、改善口 腔內(nèi)細(xì)菌群作用、預(yù)防大腸桿菌感染的作用等(專利文獻(xiàn)1-3)。而且， 已經(jīng)公開(kāi)了神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是GM3，使嬰兒的腸間粘膜細(xì)胞成熟化 (專利文獻(xiàn)4)，公開(kāi)了由于成熟化，防止過(guò)敏原物質(zhì)通過(guò)粘膜上皮細(xì) 胞之間的間隙，通過(guò)在粘膜上與過(guò)敏原結(jié)合，可以使防止其侵入的IgA 的產(chǎn)生增加。已知細(xì)胞因子主要是免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)性質(zhì)因子，其 不僅對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞而且對(duì)很多細(xì)胞都有豐富多樣的生理作用。細(xì)胞 因子中，TNF-a是在生物體防御，炎癥反應(yīng)等中起主要作用的炎癥性 細(xì)胞因子的代表性細(xì)胞因子?？梢灶A(yù)期對(duì)于TNF-a的產(chǎn)生能力有影響 的因子具有生物防御能力和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。而且，已知干擾素 Y (IFN-Y)是控制細(xì)胞性免疫的代表性細(xì)胞因子，促進(jìn)ThO型的T細(xì) 胞向Thl型分化。此外，人們認(rèn)為IL-4是控制體液性免疫的代表性細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞的增殖。因此，通過(guò)分析免疫系統(tǒng)的組織中IFN-Y和IL-4產(chǎn)生能力的變化，可以推測(cè)存在的T細(xì)胞是處于Thl型顯性， 即細(xì)胞性免疫處于顯性的狀況？還是處于Th2型顯性，即體液型免疫 處于顯性的狀況？專利文獻(xiàn)1:特開(kāi)平11-246418號(hào)公才艮專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2005-320275號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2001-2704號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:特開(kāi)平8-109133號(hào)^^才艮發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題在于發(fā)現(xiàn)一種神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的與免疫功能相關(guān)的 新作用機(jī)理和利用這種機(jī)理的醫(yī)藥用途，提供作為各種免疫疾病的預(yù) 防劑有效的藥物以及含有這種藥物的飲食品和飼料。解決課題的方法本發(fā)明人為了解決上述課題，就神經(jīng)節(jié)苷脂GD3對(duì)細(xì)胞因子的功 能進(jìn)行各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3抑制TNF-a、 IFN-y的產(chǎn) 生，并促進(jìn)IL-4的產(chǎn)生，基于這種認(rèn)識(shí)完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明是以神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分的免疫功能調(diào)節(jié)劑。 本發(fā)明還是特征在于所述神經(jīng)節(jié)苷脂GD3來(lái)源于奶的前述免疫功能調(diào) 節(jié)劑。本發(fā)明還是含有前述免疫功能調(diào)節(jié)劑的飲食品和飼料。發(fā)明效果通過(guò)使用本發(fā)明的免疫功能調(diào)節(jié)劑，使用神經(jīng)節(jié)苷脂GD3抑制 TNF-a、 IFN-Y的產(chǎn)生，并且促進(jìn)IL-4的產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)免疫功能。 本發(fā)明的免疫功能調(diào)節(jié)劑可用于預(yù)防食品過(guò)敏反應(yīng)或特應(yīng)性皮炎等與 免疫功能相關(guān)的疾病。


圖1是表示試驗(yàn)例1的結(jié)果的圖。表示試驗(yàn)例2的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施方式
以下就本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明中作為有效成分使用的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3以任意方法獲得 都可以。即，可以使用通過(guò)現(xiàn)有方法從牲畜的腦等中分離純化的神經(jīng) 節(jié)苷脂GD3，而且也可以使用利用從牛奶中有效回收的方法(特開(kāi)昭 63-269992號(hào)公報(bào))獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3。根據(jù)同篇公報(bào)中記載的方 法還可以以工業(yè)規(guī)模大量生產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3。而且，同篇公報(bào)中記 載的從奶中分離提取神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的方法作為參考，其內(nèi)容如下。 即，通過(guò)使鹽酸或乳酸等酸或者胰蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶 作用于牛奶、酪乳、乳清、脫脂奶等奶原料，分解蛋白質(zhì)，通過(guò)超濾 法、凝膠滲透法或透析法處理獲得的蛋白質(zhì)分解溶液，濃縮神經(jīng)節(jié)苷 脂進(jìn)行制備。這樣制備的神經(jīng)節(jié)苷脂由GM3和GD3構(gòu)成，本發(fā)明中以 神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分。本發(fā)明的免疫功能調(diào)節(jié)劑含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分，可 以作為具有各種劑型的制劑來(lái)使用，劑型沒(méi)有特別限定。因此有效成 分神經(jīng)節(jié)苷脂GD3可以與各種賦形劑或載體等一起使用，可以配合在 片劑、膠嚢劑、粉劑、液體制劑等各種劑型的制劑中。此外，本發(fā)明 的免疫功能調(diào)節(jié)劑也可以包括具有調(diào)節(jié)免疫功能作用的其它藥物。而 且，本發(fā)明的飲食品的種類也沒(méi)有特別限定，可以混合在牛奶，加工 奶，奶飲料，酸奶，清涼飲料水，咖啡飲料，果汁，果凍，威華餅干， 餅干，面包，面條，香腸等飲食品或營(yíng)養(yǎng)食品，以及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充用組合 物。此外，本發(fā)明的飼料種類沒(méi)有特別限定。予以說(shuō)明，本發(fā)明的免 疫功能調(diào)節(jié)劑，飲食品和飼料除了含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3之外，可以按 常規(guī)方法制備。本發(fā)明中，為了使之發(fā)揮免疫功能調(diào)節(jié)效果，可以將神經(jīng)節(jié)苷脂 GD3在藥物、飲食品或飼料中的混合量等調(diào)整成可以按平均每天一般攝取0. 1-5mg左右。而且，在以神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分時(shí)，給 藥對(duì)象沒(méi)有限定，當(dāng)用于消化道足夠成熟的人時(shí)效果更好。 實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例和試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。在實(shí)施 例和試驗(yàn)例中，"％"只要沒(méi)有特別說(shuō)明，就意味著"重量％"。 (實(shí)施例1)(神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的制備)向1.5kL在制造奶酪時(shí)排出的乳清中添加1%蛋白分解酶，在 pH8. 0、 55。C下進(jìn)行2小時(shí)的酶反應(yīng)，由此水解乳清中的蛋白質(zhì)。將該 反應(yīng)液通過(guò)超濾膜(Cefilt 10kDaNG: :7 夕社制)處理除去蛋 白質(zhì)水解物和乳糖，用蒸發(fā)器濃縮到30%濃度后，冷凍干燥，獲得了 1.5kg含神經(jīng)節(jié)苷脂的粉末。予以說(shuō)明，該含神經(jīng)節(jié)苷脂粉末中的神 經(jīng)節(jié)苷脂量為約1%。然后，將陰離子交換樹(shù)脂Dowex-l(醋酸型Dow Chemical公司制)填充到柱(直徑10cmx高100cm)中，用由氯仿甲 醇水(60: 30: 8)構(gòu)成的溶液平衡后，讓通過(guò)上述含神經(jīng)節(jié)苷脂粉末混 懸于30L由氯仿甲醇水(60: 30: 8)構(gòu)成的溶液制成的混懸液通過(guò)， 使神經(jīng)節(jié)苷脂等酸性物質(zhì)吸附于柱上后，用20L由氯仿甲醇水 (60: 30: 8)構(gòu)成的溶液洗滌柱，用20L含2M醋酸鈉的由氯仿甲醇 水(60: 30: 8)構(gòu)成的溶液洗脫，回收含神經(jīng)節(jié)苷脂的洗脫液。通過(guò)減壓 干燥這種含神經(jīng)節(jié)苷脂的洗脫液除去溶劑后，加入1N氬氧化鈉溶液， 通過(guò)于4(TC進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)分解磷脂。然后將該反應(yīng)液用超濾膜 (Cefilt 10kDaNG: 7 4 A，少夕社制)處理進(jìn)4亍脫鹽濃縮，冷凍干燥后， 用200mL由氯仿甲醇(85: 15)構(gòu)成的溶液溶解，再通過(guò)硅膠柱(直徑 5cmx高40cm)，使神經(jīng)節(jié)苷脂吸附于硅膠上。然后，用氯仿甲醇溶 液梯度洗脫神經(jīng)節(jié)苷脂，濃縮及冷凍干燥，獲得了 15.2g神經(jīng)節(jié)苷脂 GD3粉末。予以說(shuō)明，該神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的純度通過(guò)高效液相色譜進(jìn) 行分析，其結(jié)果是97%以上。以下示出試驗(yàn)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。在試驗(yàn)例中全部 使用Balb/C雄性小鼠。而且，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3使用按10|ag/ml的濃度將實(shí)施例1獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3粉末溶解于添加了 10%胎牛血清 的RPMI1640培養(yǎng)基中，通過(guò)30分鐘超聲波處理而形成的膠粒。 [試驗(yàn)例1](神經(jīng)節(jié)苷脂GD3對(duì)脾臟巨噬細(xì)胞的TNF-a產(chǎn)生能力的影響)處死10周齡大的Balb/C雄性小鼠，收集脾臟。在培養(yǎng)皿中將脾 臟切細(xì)，用注射筒細(xì)細(xì)擠壓，通過(guò)過(guò)篩，分離脾細(xì)胞。在RPMI1640 培養(yǎng)基中按終濃度10%添加了胎牛血清而得到的培養(yǎng)基(10 % FCS/RPMI1640)中把分離的脾細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，用相同培養(yǎng)基洗滌2 次，分離粘著的巨噬細(xì)胞。向分離的脾臟巨噬細(xì)胞加入添加了終濃度 為10jjg/ffll的實(shí)施例1的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的10。/。FCS/RPMI1640培養(yǎng)基 或什么都沒(méi)有添加的RPMI1640培養(yǎng)基(對(duì)照)，培養(yǎng)2小時(shí)。然后按終 濃度1 P g/ml添加LPS,再培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)終止后，收集培養(yǎng)基， 同時(shí)用0. 1%SDS溶液將細(xì)胞溶液化。通過(guò)釆用L929小鼠成纖維細(xì)胞的 生物測(cè)試法測(cè)定所收集的培養(yǎng)基中的TNF-oc濃度。用通過(guò)DAPI的熒 光分光光度法測(cè)定可溶性的細(xì)胞內(nèi)的DNA量，求出每單位DNA量的 TNF-oc分泌量。結(jié)果示于圖1。其結(jié)果是，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3添加組中，與對(duì)照(無(wú)添加)組相比， TNF-oc產(chǎn)生能力顯著下降。通過(guò)在培養(yǎng)基中直接添加神經(jīng)節(jié)苷脂GD3, 使TNF-a產(chǎn)生能力受到抑制，這啟示神經(jīng)節(jié)苷脂GD3具有抗炎作用。[試驗(yàn)例2](神經(jīng)節(jié)苷脂GD3對(duì)取決于脾細(xì)胞的IL-4和IFN-Y產(chǎn)生能力的影響)與試驗(yàn)例1同樣地進(jìn)行細(xì)胞的分離。即，收集的脾臟與試驗(yàn)例1 一樣切細(xì)后，用力擠壓使之弄碎后，通過(guò)過(guò)篩分離細(xì)胞。將細(xì)胞接種 在10。/。FCS/RPMI1640培養(yǎng)基或按終濃度10n g/ml添加了實(shí)施例1的神 經(jīng)節(jié)苷脂GD3的1(T/。FCS/RPMI16^培養(yǎng)基中。培養(yǎng)開(kāi)始第2天時(shí)按終 濃度5Mg/ml添加作為促細(xì)胞分裂劑的伴刀豆球蛋白A，再培養(yǎng)3天。 培養(yǎng)結(jié)束后，在回收培養(yǎng)基的同時(shí)溶解細(xì)胞。培養(yǎng)基中的IL-4，IFN-y 濃度分別用三明治 ELISA 法測(cè)定。 測(cè)定細(xì)胞中的DNA濃度，求出每單位DNA量的細(xì)胞因子分泌量。結(jié)果示于圖2， 3。如圖2， 3所示，脾細(xì)胞中，出現(xiàn)IL-4產(chǎn)生能力增加的傾向，IFN-Y產(chǎn)生能力顯著降低。這些結(jié)果啟示通過(guò)添加神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，誘發(fā) 了脾臟內(nèi)的Thl抑制。若觀察到體內(nèi)的Thl/Th2平衡，則可以說(shuō)在食 品過(guò)敏反應(yīng)或特應(yīng)性皮膚炎等過(guò)敏性疾病的初期階段達(dá)到了 Thl顯性 的狀態(tài)。因此可以認(rèn)為通過(guò)抑制Thl可以抑制過(guò)敏性疾病的進(jìn)行，即 對(duì)預(yù)防過(guò)敏性疾病有效。本試驗(yàn)例中，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3顯示出Thl型 抑制作用，這啟示通過(guò)日常攝取神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，生物體的免疫系統(tǒng) 中的Thl型即細(xì)胞性免疫被誘發(fā)向抑制方向，這表明由于神經(jīng)節(jié)苷脂 GD3抑制過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病的初期階段，因此可用作具有預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的 作用的食材。(實(shí)施例2)(含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的粉末的制備)向?qū)?0kg酪乳粉溶解于180L水制成的溶液中加入0. 5kg枯草 桿菌蛋白酶，于pH7.6、溫度40。C反應(yīng)15小時(shí)，分解蛋白質(zhì)后，于 9(TC加熱殺菌IO分鐘，使酶失活。然后，用配備有膜面積為0.36平 方米的濾膜的超濾膜裝置(LAB-20型Module: DDS公司制)，以溫度40 。C、流量15L/分、平方壓力0. 6MPa過(guò)濾上述溶液，濃縮神經(jīng)節(jié)苷脂。 將該溶液進(jìn)行冷凍千燥，獲得含有約7. 5g神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的含神經(jīng)節(jié) 苷脂GD3的粉末lkg。這樣獲得的含神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的粉末可以直接 作為本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑使用。(實(shí)施例3)(使用神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的奶粉的制備)將實(shí)施例2中制備的含神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的粉末200g與6. 8kg酪 蛋白、70. Okg乳清粉、lkg的維生素和礦物質(zhì)成分一起溶解于700kg 水中。再混合23. Okg植物油脂，均質(zhì)化后，經(jīng)過(guò)殺菌、濃縮和干燥工 序，獲得了 100kg含有本發(fā)明免疫功能調(diào)節(jié)劑的奶粉。獲得的100g 奶粉中的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的含量為約1. Omg。(實(shí)施例4)(含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的健康飲料的制備)使用實(shí)施例2中制備的含神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的粉末，按照表1的配 比制備本發(fā)明免疫功能調(diào)節(jié)劑的健康飲料。將表l的成分溶解于水中 制成5L。以壓力160kg/ci^將該溶液均質(zhì)化后，用板式殺菌機(jī)于120 。C保持3秒進(jìn)行殺菌，然后冷卻到5'C。將獲得的健康飲料填充到容 量200ffll的紙容器中。該健康飲料每100ml約含有2. 4mg的GD3。表1含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的組合物20g檸檬酸鈉2. 8g蔑糖360g全奶粉40g脫脂奶粉50g焙煎咖啡粉末130g食鹽2g小蘇打2.5g糖酯2. 5g香料6g(實(shí)施例5)(使用含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的粉末的片劑的制備) 按照常規(guī)方法將實(shí)施例1中制備的神經(jīng)節(jié)苷脂粉末按每片100mg 填充到由明膠構(gòu)成的軟膠嚢中，獲得本發(fā)明的免疫功能調(diào)節(jié)劑(片劑)。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的以神經(jīng)節(jié)苷脂GD3為有效成分的免疫功能調(diào)節(jié)劑或配合 這種調(diào)節(jié)劑的飲食品或飼料對(duì)與免疫功能相關(guān)的各種疾病的預(yù)防有 用。
權(quán)利要求
1、免疫功能調(diào)節(jié)劑，含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分。
2、 權(quán)利要求1所述的免疫功能調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述神經(jīng) 節(jié)苷脂GD3來(lái)源于奶。
3、 飲食品，含有權(quán)利要求1或2所述的免疫功能調(diào)節(jié)劑。
4、 飼料，含有權(quán)利要求1或2所述的免疫功能調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的與免疫功能相關(guān)的新的作用機(jī)理以及利用這種機(jī)理的醫(yī)藥用途，提供作為各種免疫疾病的預(yù)防劑或治療劑有效的藥物以及含有這種藥物的飲食品和飼料。以神經(jīng)節(jié)苷脂GD3作為有效成分的免疫功能調(diào)節(jié)劑。神經(jīng)節(jié)苷脂GD3優(yōu)選來(lái)源于奶。前述免疫功能調(diào)節(jié)劑混合在飲食品或飼料中。
文檔編號(hào)C07H15/10GK101622267SQ20088000691
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日
發(fā)明者三浦豐, 芹澤篤, 酒井史彥 申請(qǐng)人:雪印乳業(yè)株式會(huì)社