專利名稱：：用于治療纖維化的ccr2拮抗劑的制作方法第l/39頁用于治療纖維化的CCR2拮抗劑
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用拮抗CCL2結(jié)合于CCR2的拮抗劑(例如抗-CCL2抗體)預(yù)防和控制肺纖維化尤其是尋常性間質(zhì)性肺炎的方法。相關(guān)技術(shù)描述尋常性間質(zhì)性肺炎(UIP)是一種以肺部蜂窩狀為特征并據(jù)此常規(guī)診斷的使人虛弱的慢性間質(zhì)性肺病。發(fā)生蜂窩狀的原因是膠原沉積增加，因此降低肺彈性并導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)的退縮和最終萎陷。肺內(nèi)蜂窩狀和纖維化程度非常不均勻，其中過量膠原密集區(qū)經(jīng)常與正常肺實(shí)質(zhì)或富含單核細(xì)胞浸潤的間質(zhì)性組織鄰接。大多數(shù)患者在診斷時患有中期至晚期的臨床疾病，即使治療也會惡化。cxc趨化因子家族是一種細(xì)胞因子的多效家族，其參與促進(jìn)多種白細(xì)胞運(yùn)輸、調(diào)節(jié)血管生成和血管重構(gòu)、促進(jìn)間質(zhì)祖細(xì)胞例如纖維細(xì)胞即肺纖維化中的循環(huán)間質(zhì)祖細(xì)胞(也稱為纖維細(xì)胞)的動員和運(yùn)輸。在正常肺中，大量固有成纖維細(xì)胞群持續(xù)產(chǎn)生并降解月交原，從而使肺在感染、炎癥或其它病理生理癥狀后以及損傷后重塑。成纖維細(xì)胞響應(yīng)多種生長因子例如TGFbl而產(chǎn)生膠原。而且，TGFbl誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞，其常見于UIP肺組織中。成肌纖維細(xì)胞是能產(chǎn)生膠原、具有a-平滑肌肌動蛋白并因此具有收縮性的分化細(xì)胞。因此成肌纖維細(xì)胞可能會促進(jìn)肺泡萎陷。在正常傷口愈合的過程中，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原和生長因子引導(dǎo)傷口閉合。一旦組織結(jié)構(gòu)復(fù)原，成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生減少并且細(xì)胞走向凋亡，從而預(yù)防過量瘢痕形成。在UIP患者的肺中存在顯著成纖維細(xì)胞增殖。因此UIP成纖維細(xì)胞存留在纖維化部位，持續(xù)增加異常的過量膠原沉積。UIP患者通常是普通肺移植的受體，在這些患者中移植物可能最終纖維化。先前研究已顯示分離自纖維化部位的成纖維細(xì)胞與分離自非-纖維化組織的成纖維細(xì)胞相比存在表型差異。舉例而言，分離自UIP患者肺的成纖維細(xì)胞中IL-13受體亞基表達(dá)增加。CCR2在肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)并且CCR2可在呼吸器官損傷后調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的募集和活化。通過受體敲除小鼠或配體中和抑制體內(nèi)CCR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減少多種動物纖維化模型中的膠原沉積。CCL2(CC-趨化因子配體2、單核細(xì)胞趨化蛋白1、MCP1)與CCR2結(jié)合。CCR2主要在單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)UIP患者中MCP1水平增加。小鼠CCR2受體的配體包括CCL2(又稱JE或單核細(xì)胞趨化蛋白[MCP]-1)、CCL7(MCP-3)和CCL12(MCP-5)，因此，基于小鼠模型數(shù)據(jù)的假設(shè)未必能就趨化因子和趨化因子受體分布而言準(zhǔn)確反映人的肺部環(huán)境。單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1、CCL2、CCR2配體、GenBankNP_002973)，含76個氨基酸殘基的8.6kDa的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞因子的趨化因子(3(或C-C)家族成員。MCP-1由多種細(xì)胞型表達(dá)包括單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及人肺2-型上皮樣細(xì)胞。據(jù)信，MCP-1通過促進(jìn)單核細(xì)胞流入和隨后在組織內(nèi)的激活在炎性疾病的起始和進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。MCP-1是單核細(xì)胞而不是中性粒細(xì)胞的趨化性劑。它能誘導(dǎo)名為CHAK(CC-趨化因子激活的殺傷細(xì)胞)的殺傷細(xì)胞(類似于IL-2激活的細(xì)胞)的增殖和激活。它可調(diào)節(jié)細(xì)胞表面抗原(CDllc、CDllb)的表達(dá)和細(xì)胞因子IL1和IL6的表達(dá)。MCP-1是人嗜堿粒細(xì)胞的有效活化劑，誘導(dǎo)脫顆粒和組胺釋放。因此，醫(yī)療領(lǐng)域需要檢測和控制表現(xiàn)出導(dǎo)致肺動脈瓣關(guān)閉不全(又稱UIP)病理生理學(xué)特征的患者，可以避免肺移植需求至少能提高同種異體移植物使用的安全性和存活率并能理解和治療其中MCP-1的病理學(xué)作用的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供預(yù)防、減緩或逆轉(zhuǎn)患者纖維化的方法，其包含接觸或給予包含有效量的下列物質(zhì)的組合物至少一種分離的CCR2拮抗劑，其可在顯示本文所定義受體的細(xì)胞中阻止與CCR2(其亞型或變異體包括CCR2A或CCR2B)相關(guān)的生物學(xué)功能或生物活性，或與MCP-1/CCL2或CCR2結(jié)合的拮抗劑或阻止CCR2與其同源配體結(jié)合的拮抗劑并藉此抑制CCR2在哺乳動物患者的細(xì)胞、組織、器官中的生物學(xué)功能。在本發(fā)明方法的一方面，受試者為具有與間質(zhì)性特發(fā)性肺炎相關(guān)的間質(zhì)性病理學(xué)和肺泡纖維化的患者，更具體地，患者被診斷為尋常性間質(zhì)性肺炎。本發(fā)明方法可與在顯示本文所定義的受體的細(xì)胞中阻止與CCR2活性的CCR2拮抗劑一起應(yīng)用。在本發(fā)明的一方面，CCR2拮抗劑包括能結(jié)合MCP-l/CCL-2或CCR2或者能阻止CCR2與其同源配體結(jié)合并藉此抑制CCR2生物學(xué)功能的抗體、合成或天然序列肽和小分子拮抗劑。本文也提供了在細(xì)胞、組織、器官或動物中診斷MCP-1相關(guān)間在一個實(shí)施方案中，抗體的配體結(jié)合部分包含SEQIDNO:27和28。在一方面，本發(fā)明提供至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含至少一種包含SEQIDNO:27或28的可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)IDNO:6、7和9的全部重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNO:13、14和16的全部輕鏈CDR氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供至少一種抗MCP-1抗體方法或組合物，如本領(lǐng)域所知和/或本文所述用于給予治療有效量以在細(xì)胞、組織、器官、動物或患者中和/或在相關(guān)病癥之前、之后或期間調(diào)節(jié)或治療至少一種MCP-1相關(guān)病癥。在另一方面，本發(fā)明提供至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)SEQIDNO:6、7和8或9的全部重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNO:13、14和15或16的全部輕鏈—CDR氨基酸序列。本發(fā)明還提供給予治療或預(yù)防有效劑量的至少一種依據(jù)本發(fā)明的抗MCP-1抗體的至少一種組合物、裝置和/或方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供本文所述任何發(fā)明。附圖簡迷圖1所示柱形圖中各柱形代表與分離自非-纖維化肺組織的成纖維細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)化至數(shù)值1)相比，與UIP成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)的下列基因表達(dá)的倍數(shù)增加aSMA:PC0L1;PCOL3;CTGF;TGF(3-1;TGF(3R1;TGF卩R2;IL13Ral;IL13Ra2。圖2所示柱形圖顯示了TGF卩1、PDGF和CCL2對衍生自非纖維化和纖維化肺組織的成纖維細(xì)胞中aSMA表達(dá)的影響。圖3所示兩個柱形圖顯示了通過衍生自非-纖維化和纖維化肺組織的成纖維細(xì)胞TGF(31、PDGF和CCL2對溶膠原I(A)和溶膠原III(B)基因表達(dá)的影響。圖4所示柱形圖顯示了通過書于生自非-纖維化和纖維化肺組織的成纖維細(xì)胞TGF(31、PDGF和CCL2對TGFbl基因表達(dá)的影響。圖5所示柱形圖顯示了通過衍生自非-纖維化和纖維化肺組織成纖維細(xì)胞TGF(31、PDGF和CCL2對CTGF基因表達(dá)的影響。圖6所示兩個柱形圖顯示了通過衍生自非-纖維化和纖維化肺組織成纖維細(xì)胞TGFpi、PDGF和CCL2對TGFPRI(A)和TGF卩RII(B)基因表達(dá)的影響。圖7所示兩個柱形圖顯示了通過^f汙生自非-纖維化和纖維化肺組織成纖維細(xì)胞TGFbl、PDGF和CCL2對IL13Ral(A)和IL13Ra2(B)基因表達(dá)的影響。序列表簡述<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Abs抗體，多克隆或單克??；Ig免疫^^蛋白；Mab單克隆抗體；V抗體可變域；C抗體恒定域；H抗體重鏈；L抗體輕鏈；HRCT高分辨率計算機(jī)體層攝影術(shù)；PDGF-AB血小板衍生的生長因子a/卩；CTGF:結(jié)締組織生長因子；CXCCXC亞類的趨化因子；aSMAa平滑肌肌動蛋白；PC0L1溶膠原I;PCOL3:溶膠原III;TGF卩1轉(zhuǎn)化生長因子(31;TGF(3R11類TGF卩受體；TGF卩R2:II類TGF卩受體；IL13Ral:白介素13受體al亞基；IL13Ra2:白介素13受體a2亞基。定義本文術(shù)語"抗體"以其最廣泛意義使用。如本文所使用，"抗體"包括完全抗體和其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。因此，抗體包括任何包含一種分子的蛋白質(zhì)或肽，該分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于可合并入本發(fā)明抗體的至少一種重《連或輕4連互補(bǔ)決定區(qū)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架(FR)區(qū)或其任意部分，或至少一部分結(jié)合蛋白。術(shù)語"抗體"進(jìn)一步涵蓋抗體、消化片段、特定部分及其變異體，包括才莫擬抗體，或包含模擬抗體或其特定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能片段包括預(yù)選目標(biāo)的抗原結(jié)合片段。包含于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"的結(jié)合片段的實(shí)施例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546);以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分離的基因編碼，但是可使用重組方法通過可將它們制成單個蛋白質(zhì)鏈(其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱做單鏈Fv(scFv))的合成接頭將它們連接起來；參見，例如Bird等1988Science242:423-426,和Huston等1988Proc.Natl.AcadSci.USA85:5879-5883。這些單鏈抗體也涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分，，中。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)獲得抗體片段，以與完整抗體相同的方式篩選應(yīng)用的片段。"CCR2，，意指人CCR2A(MCP-1RA,NP—000638)和/或人CCR2B(MCP-1RB,NP—000639)和與天然或內(nèi)源性對應(yīng)的哺乳動物CCR2蛋白質(zhì)(例如，重組蛋白質(zhì))具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。CCR2A歸因于導(dǎo)致移碼的編碼區(qū)內(nèi)選擇性剪切和下游終止密碼子的使用(Charo，等1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(7):2752-2756)。如本文定義，CCR2包括成熟受體蛋白質(zhì)、多態(tài)或等位變異體、哺乳動物CCR2的亞型(例如，由選擇性剪接或其它細(xì)胞操作產(chǎn)生)和前者的修飾或未修飾形式(例如糖基化，去糖基化)。例如可從天然產(chǎn)生哺乳動物CCR2的來源中回收或分離該類蛋白。"CCR2拮抗劑"可在顯示如本文定義的CCR2A或CCR2B或其它亞型或變異體的細(xì)胞中阻止與CCR2A或CCR2B相關(guān)的生物學(xué)功能或生物活性。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的拮抗劑包括可結(jié)合MCP-1/CCL2功能的抗體、合成或天然序列多肽和小分子拮抗劑。因此，抑制劑指包括結(jié)合受體(例如抗體、天然配體突變體、小分子量有機(jī)分子、其它配體結(jié)合的竟?fàn)幮砸种苿?的拮抗劑的物質(zhì)和不與其(例如抗獨(dú)特型抗體)結(jié)合即可抑制受體功能的物質(zhì)。"尋常性間質(zhì)性肺炎"或"UIP"在臨床和組織學(xué)上又稱作"特發(fā)性肺纖維化"或"IPF，和"隱源性纖維化肺泡炎"。它是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIP)的六個組織學(xué)亞型中最常見的。其它IIP為非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)、閉塞性細(xì)支氣管炎伴機(jī)化性肺炎(BOOP)、呼吸性細(xì)支氣管炎伴間質(zhì)性肺病(ILD)、脫屑性間質(zhì)性肺炎、急性間質(zhì)性肺炎(AIP)。"MCP-1"指NCBI記錄登記號NP—002973中引用的76個氨基酸的序列，又稱為MCP(單核細(xì)胞趨化蛋白)、SMC-CF(平滑肌細(xì)胞趨化因子)、LDCF(淋巴細(xì)胞衍生趨化因子)、GDCF(神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生趨化因子)、TDCF(腫瘤衍生趨化因子)、HC11(人細(xì)胞因子11)、MCAF(單核細(xì)胞趨化活化因子)。基因符號為SCYA2，即位于人染色體17的JE基因，最新命名為CCL2(Zlotnik,Yoshie2000.Immunity12:121-127)。JE為人MCP-1/CCL2的小鼠同源物。MCP-1拮抗劑小分子指可抑制MCP-1活性并可用作潛在治療藥的任何適當(dāng)化合物。這些化合物為本領(lǐng)域熟知，例如可阻止CCL2結(jié)合于CCR2B和/或抑制CCR1或CCL2本身的吲咮衍生物、環(huán)胺衍生物、脲基衍生物、雜環(huán)化合物、?；桨芬约肮δ苄赃量?，如PCT公開說明書WO9905279(1999)、WO9916876(1999)、WO9912968、WO9934818、WO9909178、WO9907351、WO9907678、WO9940913、WO9940914、WO0046195、WO0046196、WO0046197、WO0046198、WO0046199、WO9925686、WO0069815、WO0069432、WO9932468、WO9806703、WO9904770、WO99045791所公開，各以其完整內(nèi)容并于本文作為參考。如本文所使用，本發(fā)明所用"治療"指包含"控制，，和"逆轉(zhuǎn)，，慢性排斥反應(yīng)的功能或組織學(xué)征兆的治療。本發(fā)明可治療的哺乳動物包括家畜類哺乳動物例如牛、馬等，家養(yǎng)動物例如狗、貓、鼠等以及人，優(yōu)選人。引用本文引用的所有出版物或?qū)＠w并入本文作為參考，因為它們展現(xiàn)出本發(fā)明所在時期本領(lǐng)域的狀態(tài)和/或提供本發(fā)明描述和可實(shí)施性。出版物涉及任何科學(xué)或?qū)＠霭嫖?，或以任^可4某介形式可獲得的任和其它信息，包括所有記錄的、電子的或印刷形式。以下參考文獻(xiàn)整體合并入本文作為參考Ausubd等編輯，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY，NY(1987-2006;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,NY(1989);HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等編輯，CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.，NY(1994-2006;Colligan等，CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY，(1997-2006。本發(fā)明的尋常性間質(zhì)性肺炎(UIP)和特發(fā)性肺纖維化化合物已知MCP-l結(jié)合趨化因子受體CCR2并經(jīng)其進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CCR2是在多種細(xì)胞包括單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和嗜;成粒細(xì)胞上表達(dá)的7跨膜-跨越G蛋白偶聯(lián)受體。現(xiàn)已克隆出兩種MCP-l特異性受體，CCR2A和CCR2B，其響應(yīng)納摩爾UM)濃度的MCP-l進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CCR2A(CC-CKR2A)和CCR2B(CC-CKR2A)表示編碼兩個具有選擇性剪接羧基尾部的MCP-l特異性受體的兩個cDNA。MCP-l以高親和力與兩個亞型結(jié)合。MCP-l誘導(dǎo)表達(dá)CCR2B的細(xì)胞而不是表達(dá)CCR2A的細(xì)胞鈣流出。與表達(dá)CCR2A的細(xì)胞相比小于5倍的MCP-1誘導(dǎo)表達(dá)CCR2B的細(xì)胞中的趨化性。已知其它與人MCP-1序列具有某些功能和序列同源性的蛋白質(zhì)。與MCP-l(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(GenBankP—51671);MCP-2與MCP-1有百分之61.8的序列一致性，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1與MCP-1的序列一致性為百分之63.2。對這些蛋白在人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制和病理學(xué)中的活性范圍和參與廣度的了解還比不上對MCP-1同源物的了解。例如，MCP-2(又名CCL8)與MCP-1和MCP-3(又名CCL7，GenbankNP—006264)緊密相關(guān)并以CCR1和CCR2B二者作為其功能受體。MCP-3與命名為D6的受體結(jié)合。MCP-3也與CCR10和CCR1結(jié)合。MCP-3蛋白質(zhì)(97個氨基酸)序列顯示出與MCP-1百分之74的一致性，與MCP-2百分之58的同源性。分泌型MCP-3與MCP-1的差異在于它是N-糖基化的。MCP-4(又名CCL13,GenbankNP—005399)與三種已知的單核細(xì)胞趨化蛋白有百分之56-61的序列一致性，與嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1有百分之60的一致性。MCP-4的功能看來與MCP-3和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的功能高度相似。與MCP-3—樣，MCP-4是單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)效化學(xué)趨化劑。它對中性粒細(xì)胞無效。在單核細(xì)胞上，MCP-4與識別MCP-1、MCP-3、RANTES(CCL5)和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的受體、CCR1和CCR3受體結(jié)合，并顯示出與嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1的完全交叉脫敏。MCP-5為鼠CC-趨化因子并與人MCP-1最緊密相關(guān)(66%氨基酸一致性)。MCP-5的基因符號為SCYA12(又名CCL12)。用趨化因子受體CCR2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示可響應(yīng)MCP-5。細(xì)胞因子和趨化因子的一般信息可自萬維網(wǎng)獲得，當(dāng)前分類系統(tǒng)參見ZlotnikA.,Yoshie0.2000.趨化因子一種新的分類系統(tǒng)及其在免疫中的作用(Chemokines:anewclassificationsystemandtheirroleinimmunity.)Immunity12:121-127。前述討論用于強(qiáng)調(diào)拮抗劑可通過直接作用于CCR2或其配體CCL2、CCL7、CCL8之一阻止CCR2結(jié)合的生物學(xué)功能。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，拮抗劑結(jié)合MCP-1/CCL2并中和其結(jié)合CCR2的能力。US6084075、US6458353和US6696550中公開了抗-CCR2抗體。在本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，抑制含哺乳動物CCR2的細(xì)胞與趨或其功能片段接觸，該抗體或功能片段結(jié)合CCR2或部分所述受體。在一個實(shí)施方案中，該抗體為單克隆抗體(mAb)LS132.1D9(1D9)或可與1D9竟?fàn)幣c人CCR2或部分人CCR2結(jié)合的抗體。也可設(shè)計前述抗體的功能片段。已報導(dǎo)了可結(jié)合MCP-1的抗體JP9067399公開從分離血細(xì)胞中獲得的抗體，JP05276986公開分泌IgM抗-人MCP-l的雜交瘤。最近，公開了可結(jié)合多種(3趨化因子包括MCP-1的抗體(WO03048083)和也可結(jié)合嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的MCP-1結(jié)合抗體(US20040047860)。選擇性結(jié)合并中和人MCP-1/CCL2的鼠同源物或人MCP-1/CCL2的抗體公開于共同未決專利申請美國序列號11/170,453和60/682,654，其內(nèi)容和教導(dǎo)并入本文作為參考。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，CCR2拮抗劑為命名為C775的抗-人MCP-1/CCL2抗體，其可如共同未決專利申請美國序列號11/170,453所公開通過命名為C1142的細(xì)胞系生產(chǎn)，其變體例如人源化或重構(gòu)形式、截短形式或其結(jié)合片段，如本文所定義。在另一個實(shí)施方案中，CCR2拮抗劑為命名為CNT0888的抗-人MCP-1/CCL2抗體的變體、截短形式或其結(jié)合片段，如本文所定義和如共同未決專利申請WO2006125202所公開，其內(nèi)容和教導(dǎo)合并入本文作為參考。在一個實(shí)施方案中，MCP-1抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)二者，其包含SEQIDNO:27和28?？贵w可包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)，所述抗體包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列?？贵w包含至少一個包含至少一個重^T連和至少一個輕^1的可變區(qū)，所述MCP-1抗體包含含有SEQIDNO:27和28的重鏈和輕鏈可變區(qū)?？贵w可包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)，所述抗體包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。抗體可包含至少一個具有至少SEQIDNO:6、7、9、13、14和16之一的氨基酸序列的重鏈或輕鏈CDR?？贵w可任選包含至少SEQIDNO:2-5之一的重鏈或輕鏈可變區(qū)，其進(jìn)一步包含選自SEQIDNO:6-26的重鏈或輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分；任選與框架區(qū)功能性相關(guān)，進(jìn)一步任選包含至少人免疫球蛋白的CH1、鉸鏈、CH2或CH3。也可使用可結(jié)合CCR2并具有拮抗活性的MCP-1/CCL2截短形式、變異體、突變蛋白質(zhì)或"突變體"實(shí)施本發(fā)明方法。同型二聚體形成趨化因子的變異體，例如CCL2，其在二聚體形成界面具有改變氫鍵類型的單個氨基酸替換，從而得到與受體結(jié)合并具有體外拮抗活性的專性單體(obligatemonomer),但如WO05037305A1所教導(dǎo)可拮抗天然趨化因子并具有體內(nèi)抗炎活性，均為可用于實(shí)施本發(fā)明的變異體。MCP-1的肽拮抗劑為截短MCP-1(9-76)，其顯示可在關(guān)節(jié)炎小鼠模型中預(yù)防發(fā)病并減輕疾病癥狀(Jiang-HongGong等，J.Exp.Med.1997，186:131)。CCR2/CCL2表達(dá)的調(diào)節(jié)拮抗CCR2和其配體相互作用的可選方法為使用例如RNA沉默方法敲減CCR2或其配體尤其是MCP-1/CCL2的表達(dá)。這樣，在另一個實(shí)施方案中，可用于實(shí)施本發(fā)明方法的化合物為靶向MCP-1序列并千擾MCP-1基因表達(dá)的核酸或靶向CCR2并干擾CCR2基因表達(dá)的核酸，包括正義或反義方向的寡核苷酸和多聚核苷酸，單鏈或雙鏈核酸分子(例如siRNA)?？梢远喾N不同途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括使用siRNA、shRNA、反義分子和DNA酶。siRNA和shRNA均通過RNAi途徑起作用，并已成功用于抑制基因表達(dá)。RNAi首先在蠕蟲中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ire和Mdlo(Fire等，1998.Nature391:806)首次報道植物中dsRNA相關(guān)基因沉默現(xiàn)象并被認(rèn)為是植物細(xì)胞抵抗RNA病毒的途徑。在這一途徑中，切酶(DICER)樣酶將長鏈dsRNA病毒產(chǎn)物加工成21-25bp的小片段，然后展開雙鏈分子并導(dǎo)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。在哺乳動物細(xì)胞中已鑒別出相似的途徑，其顯著的差異為dsRNA分子的長度必須小于30bp以避免所謂干擾應(yīng)答的誘導(dǎo)，其非基因特異并可導(dǎo)致細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成完全停止?？稍O(shè)計合成siRNA以特異靶向一個基因并且可輕松在體外或體內(nèi)將它們傳遞至細(xì)胞。shRNA為siRNA分子的DNA等同物，具有能合并入細(xì)胞基因組然后在每次有絲分裂周期復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)。DNA酶也用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。DNA酶為可剪切單鏈RNA的催化性DNA分子。它們對目標(biāo)RNA序列具有高度選纟奪性，這樣可通過靶向信使RNA用于下調(diào)特異基因。RNA干擾是指短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程(Zamore等，2000,Cell,101,25-33;Fire等，1998，Nature,391，806;Hamilton等，1999,Science,286,950-951;Lin等，1999，Nature,402,128-129;Sharp，1999,Genes&Dev.,13:139-141;及Strauss,1999，Science,286,886)。細(xì)胞中存在的dsRNA通過尚未完全鑒定的機(jī)制觸發(fā)RNAi應(yīng)答。這一機(jī)制似乎不同于其它涉及雙鏈RNA特異性核糖核酸酶的已知機(jī)制，例如由蛋白激酶PKR的dsRNA-介導(dǎo)活化引起的千擾應(yīng)答和引起核糖核酸酶！^對111^八非特異性剪切的2，，5'-寡腺苷酸合成酶(參見，例如，美國專利號6107094;5898031;Clemens等，1997,J.Interferon&CytokineRes.,17,503-524;Adah等，2001，Curr,Med.Chem.，8,1189)。細(xì)胞中存在的長鏈dsRNA可激發(fā)被稱為切酶的核糖核酸酶III酶的活性(Bass,2000，Cell,101,235;Zamore等，2000,Cdl，101,25-33;Hammond等，2000,Nature,404,293)。切酶參與了將dsRNA加工成18被稱做短鏈干擾RNA(siRNA)的dsRNA短鏈片段(Zamore等，2000，Cell,101，25-33;Bass，2000,Cell,101,235;Berstein等，2001,Nature,409，363)。衍生自切酶活性的短鏈干擾RNA通常長約21至約23個核苷酸并包括約19個堿基對雙鏈體(Zamore等，2000，Cell,101,25-33;Elbashir等，2001，GenesDev,15,188)。切酶也參與了從涉及轉(zhuǎn)錄控制的保守結(jié)構(gòu)的前體RNA切除21-、22-核苷酸小時序RNA(stRNA)(Hutvagner等，2001，Science,293,834)。RNAi應(yīng)答的另一特征為核酸內(nèi)切酶復(fù)合物(通常稱做RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC))，其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA剪切。目標(biāo)RNA的剪切發(fā)生在與siRNA雙鏈體反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域的中部(Elbashir等，2001,GenesDev.,15，188)。siRNA為包括目標(biāo)序列及其互補(bǔ)序列的雙鏈RNA。RNA的3，末端加入兩個尿嗜咬核苷殘基(Elbashir等2001Nature411:494-498)。目前RNA干擾(RNAi)常規(guī)用于哺乳動物細(xì)胞以研究減少特定基因表達(dá)的功能性結(jié)果。通過轉(zhuǎn)染與所關(guān)注基因互補(bǔ)的小型干擾RNA(siRNA)誘導(dǎo)RNAi，該小型干擾RNA包括長約2lnt并在3，有2nt突出端的雙鏈RNA分子(Elbashir等2001上文)或可形成發(fā)卡的45-50聚體(shRNA)分子(Paddison，PJ,等，2002.Genes&Development16:948-958)。當(dāng)轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞后，siRNA表達(dá)質(zhì)粒顯示可降低外源性和內(nèi)源性基因產(chǎn)物水平。盡管與化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄siRNA相比它們的制備更費(fèi)力，但是當(dāng)與選擇性標(biāo)記共表達(dá)時siRNA載體可提供目標(biāo)基因表達(dá)的長期降低(Brummelkamp，TR,等，2002.Science296:550-553)。非蛋白質(zhì)、非寡核苷酸拮抗劑小分子藥物和擬肽也可為CCR2拮抗劑。例如，WO04069809、WO04069810、WO05118574、WO06015986教導(dǎo)巰基咪唑作為CCR2受體拮抗劑。可使用如本文所述的方法篩選選擇其它顯示出所需生物學(xué)特性的小分子，這些小分子會具有預(yù)防慢性排斥反應(yīng)和延長移植物存活的性質(zhì)。抗體制備方法可任選通過各種技術(shù)包括KohlerandMilstein(1975)Nature256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)(雜交瘤方法)生產(chǎn)本發(fā)明CCR2拮抗劑抗體。在一種雜交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃游锢鐐}鼠或獼猴以誘導(dǎo)生產(chǎn)或可以生產(chǎn)與用于免疫的蛋白特異結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可體外免疫淋巴細(xì)胞。接著使用合適的融合劑例如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤纟田月包(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103頁(AcademicPress,1986))。也可如本文所述和/或如本領(lǐng)域已知任選通過免疫可生產(chǎn)人類抗體所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類等)生成CCR2拮抗劑抗體。生產(chǎn)例如人抗-MCP-l抗體的細(xì)胞可分離自該類動物并4吏用適當(dāng)?shù)姆椒ɡ绫疚乃苑椒ㄊ蛊溆郎?yīng)用在它們的種系構(gòu)型中攜帶人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠可提供針對多種靶標(biāo)包括正常人類免疫系統(tǒng)可耐受的人自身抗原的高親和力全長人單克隆抗體的分離(Lonberg,N.等，US5569825、US6300129和1994，Nature368:856-9;Green,L.等，1994,NatureGenet.7:13-21;Green,L.&Jakobovits,1998，Exp.Med.188:483-95;Lonberg，NandHuszar，D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93;Kucheriapati,等，US6713610;Bruggemann,M.等，1991，Eur.J.Immunol.21:1323-1326;Fishwild，D.等，1996,Nat.Biotechnol.14:845-851;Mendez，M.等，1997,Nat.Genet.15:146-156;Green,L.,1999,J.Immunol.Methods231:11-23;Yang,X.等，1999,CancerRes.59:236-1243;Briiggemann，M.andTaussig,MJ"Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458,1997;Tomizuka等，WO0204347S)?？蓴嗔鸦騽h除該類小鼠中的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座以去除動物生產(chǎn)由內(nèi)源基因編碼的抗體的能力。此外，一些公司Y列:i口Abgenix，Inc.(Freemont,Calif.)andMedarex(SanJose，Calif.)可使用上文所述技術(shù)提供針對所篩選抗原的人類抗體?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募夹g(shù)例如重組蛋白生產(chǎn)進(jìn)行免疫原性抗原的制備和單克隆抗體的生產(chǎn)?？梢约兓鞍谆虬ㄍ暾?xì)胞或細(xì)胞或組織提取物的蛋白混合物形式給予動物免疫原性抗體，或者可在動物體內(nèi)從編碼所述抗原或其部分的核酸從頭形成該抗原?？扇芜x加入佐劑例如完全弗氏佐劑與抗原一起免疫?？稍诿庖叻桨高^程中通過眼眶取血獲得的血漿樣品監(jiān)控免疫應(yīng)答?？赏ㄟ^ELISA(如下文所述)篩選血漿，具有足夠滴度的抗-MCP-l免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可在處死和去除脾臟前3天用抗原靜脈內(nèi)強(qiáng)化免疫。預(yù)計各抗原需要進(jìn)行2-3次融合。各抗原將免疫若干小鼠。為了生成可產(chǎn)生單克隆CCR2拮抗劑抗體的雜交瘤，可從經(jīng)免疫小鼠分離脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞并與適當(dāng)?shù)挠郎?xì)胞系融合，例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。篩選所得雜交瘤用于生產(chǎn)抗原特異性抗體。不能生產(chǎn)免疫球蛋白鏈的適當(dāng)永生細(xì)胞系選自融合配偶體，例如雜交瘤細(xì)胞系，例如但是不限于Sp2/0和衍生細(xì)胞系，NS1和衍生物，尤其是NSO工程化NSO系例如GS-NSO、AE-l、L.5、P3X63Ag8.653、U937、MLA144、ACTIV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL陽60、MLA144、NAMAIWA、NEUR02A、CHO、PerC.6、YB2/0等，或異源骨髓瘤，其融合產(chǎn)物或從其衍生的任何細(xì)胞或融合細(xì)胞，或任何本領(lǐng)域已知的適當(dāng)細(xì)胞系(Birch等，1994.Biologies22:127-133)?？墒褂眠x擇性培養(yǎng)條件或其他適當(dāng)?shù)囊阎椒ǚ蛛x融合細(xì)胞(雜交瘤)或重組細(xì)胞并通過限度稀釋或細(xì)胞分選或其他已知的方法克隆?？赏ㄟ^適當(dāng)?shù)臏y定法(例如，ELISA)檢測可生產(chǎn)具有預(yù)期特異性的抗體的細(xì)胞并篩選用于梯:作?？墒褂闷渌m當(dāng)?shù)纳苫蚍蛛x具有必需特異性的抗體的方法，包括但不限于從肽或蛋白質(zhì)文庫中篩選重組抗體的方法(例如但不限于噬菌體、核糖體、寡聚核苷酸、RNA或cDNA等展示文庫；例如，可自CambridgeantibodyTechnologies,Cambridgeshire,UK;21MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE;Biovation,Aberdeen,Scotland,UK;Biolnvent,Lund,Sweden;DyaxCorp.,Enzon,Affymax/Biosite;Xoma,Berkeley,CA;Ixsys獲得。參見，例如EP368684,PCT/GB91/01134;PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240;PCT/GB92/00883;PCT/GB93/00605;US08/350260(5/12/94);PCT/GB94/01422;PCT/GB9衡662;PCT/GB97/01835;(CAT/MRC);WO90/14443;WO90/14424;WO90/14430;PCT/US94/1234;W092/18619;WO96/07754;(Scripps);EP614989(MorphoSys);WO95/16027(Biolnvent);WO88/06630;WO90/3809(Dyax);US4704692(Enzon);PCT/US91/02989(Affymax);WO89/06283;EP371998;EP550400;(Xoma);EP229046;PCT/US91/07149(Ixsys);或如本領(lǐng)域已知和/或如本文所述可生產(chǎn)人類抗體所有組成成分的隨才幾生成的肽或蛋白-US5723323、5763192、5814476、5817483、5824514、5976862、WO86/05803、EP590689(Ixsys,現(xiàn)為AppliedMolecularEvolution(AME)，其完整內(nèi)容均以參考形式并于本文)。該類技術(shù)包括但不限于核糖體展示(Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94:4937-4942(May1997);Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135(Nov.1998));單細(xì)胞抗體生產(chǎn)技術(shù)(例如，篩選'淋巴細(xì)胞抗體法("SLAM")(美國專利號5627052，Wen等，J.Immunol.17:887-892(1987);Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848(1996));凝膠點(diǎn)滴法和流式細(xì)胞計量法(Powell等，Biotechnol.8:333-337(1990);單細(xì)胞系統(tǒng)，Cambridge,MA;Gray等，J.Imm.Meth.182:155-163(1995);Kenny等，Bio/Technol.13:787-790(1995));B-細(xì)胞篩選(Steenbakkers等，Molec.Biol.R印orts19:125-134(1994);Jonak等，ProgressBiotech,第5巻，InVitroImmunizationinHybridomaTechnology,Borrebaeck,編輯，ElsevierSciencePublishersB.V"Amsterdam,Netherlands(1988))?？墒褂秒恼故疚膸旆奖愕刈龅胶Y選可特異結(jié)合至相似蛋白或片段的抗體。這一方法涉及篩選大量的肽得到具有期望功能或結(jié)構(gòu)的單個成員。使用肽展示文庫的抗體篩選為本領(lǐng)域已知。所展示的肽序列長度可為3-5000或更多個氨基酸，通常為5-100個氨基酸，經(jīng)常約8-25個氨基酸。肽展示文庫、載體和篩選試劑盒可自例如Invitrogen(Carlsbad,CA)和CambridgeantibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)這樣的公司獲得。參見，例如，美國專利號4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456,轉(zhuǎn)讓給Enzon;5223409、5403484、5571698、5837500，轉(zhuǎn)讓給Dyax、5427908、5580717，轉(zhuǎn)讓給Affymax;5885793、轉(zhuǎn)讓給CambridgeantibodyTechnologies;5750373,轉(zhuǎn)讓給Genentech;5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417，轉(zhuǎn)讓給Xoma,CoUigan,上文；Ausube,上文;或Sambrook,上文,各上述專利和出版物的完整內(nèi)容以參考形式并于本文。抗體片段抗體片段可衍生自蛋白質(zhì)水解消化完整抗體(參見，例如，Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);以及Brennan等，Science,229:81(1985》。但是現(xiàn)在可直接通過重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)這些片段。F(ab')2、Fab、Fv和ScFv抗體片段均可表達(dá)于并分泌自哺乳動物宿主細(xì)胞或大腸桿菌，因此易于生產(chǎn)大量的這些片段?？贵w片段可分離自上文討論的抗體噬菌體文庫?；蛘撸蓮拇竽c桿菌中直接回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。在其他實(shí)施方案中，所述抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利號5571894和美國專利號5587458。Fv和sFv具有完整結(jié)合位點(diǎn)，即VH和VL結(jié)構(gòu)域，其缺乏恒定區(qū)。通?？寺H和VL結(jié)構(gòu)域并再工程化(re-engineered)^吏其位于單個多肽中間并由柔性接頭連接，該接頭足夠長使得單個多肽中的兩個結(jié)構(gòu)域可相互作用。或者，可構(gòu)建融合蛋白以得到在sFv的氨基端或羧基端與效應(yīng)蛋白的融合。參見AntibodyEngineering,1995.ed.Borrebaeck。鑒定拮抗劑的方法可使用如下文示例的適當(dāng)體外測定法和體內(nèi);f莫型鑒定CCR2生物活性拮抗劑?？墒褂媒Y(jié)合抑制測定法鑒定與CCR2結(jié)合并抑制另一種化合物例如配體(例如，MCP-1、MCP-2、MCP-3和/或MCP-4)與CCR2或功能變異體結(jié)合的抗體或其片段。舉例而言，可進(jìn)行結(jié)合測定，其中檢測到或測量到與不存在抗體下配體的結(jié)合相比CCR2配體結(jié)合降低(存在抗體)?？蓪蛛x的和/或重組哺乳動物CCR2或其功能變異體的組合物與配體和抗體同時接觸，或以任一順序先后接觸。抗體存在下配體結(jié)合程度的降低指示抗體的結(jié)合抑制。例如，配體的結(jié)合可減少或消除。在一個實(shí)施方案中監(jiān)測了抗體或其片段對配體(例如趨化因子如MCP-1/CCL2)與哺乳動物CCR2或其變異體的結(jié)合的直接抑制。舉例而言，可監(jiān)測抗體抑制^I-標(biāo)記MCP-1、^I-標(biāo)記MCP-2、1251-標(biāo)記MCP-3或1251-標(biāo)記MCP-4與哺乳動物CCR2結(jié)合的能力?？墒褂冒珻CR2或其功能變異體的適當(dāng)細(xì)胞例如分離的血細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、PBMC)或天然表達(dá)CCR2的適當(dāng)細(xì)胞系或包含編碼哺乳動物CCR2的核酸的細(xì)胞系或所述細(xì)胞的膜部分進(jìn)行該測定。鑒定結(jié)合CCR2的抗體存在的其他方法是可用的，例如其它適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合測定法，或可監(jiān)測受體結(jié)合觸發(fā)事件包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和/或細(xì)胞應(yīng)答(例如白細(xì)胞運(yùn)輸)刺激的方法。應(yīng)理解的是可在結(jié)合抑制測定法中評價本發(fā)明抗體的抑制作用。也可在該方法中評價用于受體結(jié)合的抗體之間的竟?fàn)??？蛇M(jìn)一步評價以這種方式鑒定的抗體，以確定在結(jié)合之后它們是否抑制CCR2的其它功能和/或以評價他們的治療用途。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法24配體或促進(jìn)劑例如激動劑與CCR2的結(jié)合可引起經(jīng)這一G-蛋白-偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，G蛋白和其他胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性被激發(fā)?？墒褂萌魏芜m當(dāng)方法監(jiān)測一種化合物(例如抗體或其片段)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的誘導(dǎo)。這一測定法可用于鑒定CCR2的抗體激動劑?？墒褂脺y定法中的配體或促進(jìn)劑測定抗體或其功能性片段或其他候選CCR2激動劑化合物的抑制活性并評價該抗體對配體或促進(jìn)劑誘導(dǎo)的活性的抑制能力?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知方法或其他適當(dāng)方法(參見，例如，Neote,K.等，Cell，72:415-4251993);VanRiper等，J.Exp.Med.,177:851-856(1993);Dahinden,C.A.等,J.Exp.Med"179:751-756(1994))測定G蛋白活性，例如水解GTP形成GDP或之后由受體結(jié)合觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件例如誘導(dǎo)胞內(nèi)(細(xì)胞質(zhì)的)游離鈣離子[Ca2+]I濃度的快速和瞬間升高。例如，使用雜交G蛋白偶聯(lián)受體的Sledziewski等的功能測定法可用于檢測配體或促進(jìn)劑結(jié)合受體并激活G蛋白的能力(Sledziewski等，美國專利號5284746,其教導(dǎo)以參考形式并于本文)?？稍诖u價抗體或其片段存在下進(jìn)行該類測定，使用已知方法和抑制能力。趨化性和細(xì)胞激發(fā)測定法趨化性測定法也可用于評價抗體或其功能片段作為CCR2拮抗劑的能力。在這一方面，抗體或其功能片段或其他候選CCR2拮抗劑化合物阻斷配體與哺乳動物CCR2或其功能變異體結(jié)合并抑制趨化性(與配體結(jié)合至受體相關(guān)的函數(shù))的抑制活性是可用的。這些測定法基于由化合物誘導(dǎo)的體內(nèi)或體外細(xì)胞功能性遷移，在這種情況下或CCL2或另一可活化CCR2的配體。例如在使用96孔趨化性測定板性。例如，Springer等(Springer等，WO94/20142，1994年9月15日出版，其教導(dǎo)以參考形式并于本文；也可參見Berman等，Immunol.Invest.17:625-677(1988))描述了體外跨內(nèi)皮趨化性測定法的使用。也描述跨越內(nèi)皮組織至膠原的遷移(Kavanaugh等，J.Immunol.,146:4149-4156(1991))。例如，小鼠Ll-2前-B細(xì)胞或其他具有趨化性的適當(dāng)宿主細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子可用于趨化性測定法中。通常，趨化性測定法監(jiān)測適當(dāng)細(xì)胞(例如白細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞))定向運(yùn)動或遷移入或通過障礙(例如內(nèi)皮、濾器)，朝向水平提高的化合物方向，從障礙的第一表面至相對的第二表面。膜或濾器提供方便的障礙，這樣可監(jiān)測適當(dāng)細(xì)胞定向運(yùn)動或遷移入或通過障礙，朝向水平提高的化合物方向，從障礙的第一表面至相對的第二表面。在一些測定法中，用適當(dāng)物質(zhì)涂潰膜以輔助粘附，例如ICAM-1、纖維結(jié)合素或膠原。該類測定法提供白細(xì)胞"歸巢"的體外近似值。例如，可在適當(dāng)容器(包含工具)中檢測或測量細(xì)胞遷移的抑制，從第一室遷移入或通過微孔膜進(jìn)入包含待測抗體的第二室，由膜將其與第一室分開。篩選具有用于監(jiān)測響應(yīng)化合物的特異遷移的適當(dāng)孔徑的膜，包括例如纖維素、聚碳酸酯。例如，可使用約3-8微米的孔徑，優(yōu)選約5-8微米。濾器上的孔徑可一致或在適當(dāng)?shù)目讖椒秶鷥?nèi)。為了評價遷移和遷移抑制，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，顯微鏡檢查法)測定遷移入濾器內(nèi)的距離，穿過濾器仍然粘附在濾器的第二表面的細(xì)胞數(shù)量和/或聚積在第二室中的細(xì)胞數(shù)量。在一個實(shí)施方案中，用可檢測標(biāo)記物(例如，放射性同位素、熒光標(biāo)記、抗原或表位標(biāo)記)標(biāo)記細(xì)胞，可4吏用適當(dāng)?shù)姆椒?例如，通過^r測》文射性、熒光、免疫測定法)通過測定粘附至膜和/或存在于第二室的標(biāo)記的存在在存在和不存在抗體或片段的情況下評價遷移。可相對于適當(dāng)?shù)膶φ?例如，與不存在抗體下測定的遷移對比，與第二化合物(即標(biāo)準(zhǔn))誘導(dǎo)的遷移程度相比、與抗體誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移相比)測定由抗體激動劑誘導(dǎo)的遷移程度。在一個實(shí)施方案中，尤其對于T細(xì)胞、單核細(xì)胞或表達(dá)哺乳動物CCR2的細(xì)胞而言可監(jiān)測跨內(nèi)皮遷移。在這一實(shí)施方案中，評價透過內(nèi)皮細(xì)胞層的跨越遷移。為制備細(xì)胞層，可在微孔濾器或膜上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，任選涂漬例如膠原、纖維結(jié)合素或其他胞外基質(zhì)蛋白的物質(zhì)以輔助內(nèi)皮細(xì)胞的附著。優(yōu)選地，培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞直至形成匯合單層。許多哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞可用于單層形成，包括例如靜脈、動脈或微血管內(nèi)皮，例如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(CloneticsCorp,SanDiego,Calif.)。為了評價響應(yīng)具體哺乳動物受體的趨化性優(yōu)選相同哺乳動物的內(nèi)皮細(xì)胞；然而也可使用來自異源哺乳動物種或?qū)俚募?xì)胞。一般而言，通過4企測細(xì)胞進(jìn)入或通過膜或濾器向化合物水平增加的方向的定向遷移進(jìn)行檢測，其從濾器的第一表面朝向相對的濾器第二表面，其中該濾器在第一表面包含內(nèi)皮細(xì)胞層。定向遷移從第一表面附近的區(qū)域發(fā)生，進(jìn)入膜內(nèi)或通過膜，朝向置于濾器相反面的化合物。存在于第二表面附近區(qū)域的化合物的濃度大于第一表面附近區(qū)域的濃度。在一個用于檢測抗體抑制劑的實(shí)施方案中，可將包含可遷移并表達(dá)哺乳動物CCR2受體的細(xì)胞的組合物置于第一室。將包含可誘導(dǎo)第一室細(xì)胞(具有化學(xué)趨化功能)趨化性的一個或多個配體或促進(jìn)劑的組合物置于第二室中。優(yōu)選在將細(xì)胞置于第一室前不久或與這些細(xì)胞同時，將包含待檢測抗體的組合物優(yōu)選置于第一室。可結(jié)合受體并通過配體或促進(jìn)劑抑制該測定法中表達(dá)哺乳動物CCR2的細(xì)胞的趨化性誘導(dǎo)的抗體或其功能片段為受體功能的抑制劑(例如，刺激作用的抑制劑)。在抗體或片段存在下由配體或促進(jìn)劑誘導(dǎo)的遷移程度的降低可指示抑制活性?？蛇M(jìn)行單獨(dú)的結(jié)合試驗(見上文)測定抑制是否由抗體與受體的結(jié)合引起或通過不同的機(jī)制發(fā)生。監(jiān)控響應(yīng)在組織中注射化合物(例如趨化因子或抗體)的組織的白細(xì)胞浸潤的體內(nèi)測定法為體內(nèi)歸巢模型并測定細(xì)胞通過遷移響應(yīng)配體或促進(jìn)劑的能力以及向炎癥部位的趨化性并評價抗體或其片段阻斷該遷移的能力。除所描述方法之外，可通過監(jiān)測由活性受體誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答使用其它配體和哺乳動物CCR2功能抑制劑的鑒定上述可用于測定本發(fā)明抗體和片段的結(jié)合和功能的測定法可適用于鑒定與哺乳動物CCR2或其功能變異體結(jié)合的其它配體和其他物質(zhì)，以及哺乳動物CCR2功能的抑制劑和/或促進(jìn)劑。例如，可通過與所述抗體或其部分的竟?fàn)帨y定法鑒定與本發(fā)明抗體或其功能部分具有相同或相似結(jié)合特異性的物質(zhì)。因此，本發(fā)明也涵蓋鑒定受體的配體或與哺乳動物CCR2蛋白結(jié)合的其他物質(zhì)以及受體功能的抑制劑(例如拮抗劑)或促進(jìn)劑(例如激動劑)的方法。在一個實(shí)施方案中，將具有哺乳動物CCR2蛋白或其功能變異體(例如，白細(xì)胞、細(xì)胞系或經(jīng)設(shè)計表達(dá)由引入所述細(xì)胞中的核酸編碼的哺乳動物CCR2蛋白或其功能變異體的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞)的細(xì)胞用于鑒定和評價與受體結(jié)合的配體或其他物質(zhì)(包括受體功能的抑制劑或促進(jìn)劑)的效能的測定法中。該類細(xì)胞也可用于評價已表達(dá)受體蛋白或多肽的功能。根據(jù)本發(fā)明，可在適當(dāng)?shù)臏y定法中鑒定配體和與受體結(jié)合的其他物質(zhì)、受體功能的抑制劑和促進(jìn)劑，并進(jìn)一步評價其療效。受體功能抑制劑可用于抑制(誘導(dǎo)或阻止)受體活性，配體和/或促進(jìn)劑可用于誘導(dǎo)(觸發(fā)或增強(qiáng))所指示的正常受體功能。因此，本發(fā)明提供、;厶療移植物排斥的方法，其包含給予個體(例如，哺乳動物)受體功能抑制劑。包含CCR2拮抗劑的藥用組合物本發(fā)明包括制備用于調(diào)節(jié)CCR2轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和活性的藥用組合物的方法。該類方法包括將藥學(xué)可接受的載體與可調(diào)節(jié)CCR2表達(dá)和活性的物質(zhì)一起配制。該類組合物可進(jìn)一步包括附加活性物質(zhì)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括通過將藥學(xué)可接受載體與可調(diào)節(jié)CCR2表達(dá)和活性的物質(zhì)以及一種或多種附加活性化合物配制在一起制備藥用組合物的方法。藥學(xué)可接受載體、輔料或穩(wěn)定劑在所應(yīng)用的劑量和濃度下對與其接觸的細(xì)胞或哺乳動物是無毒的。通常生理學(xué)可接受載體為含水pH緩沖溶液。生理學(xué)可接受載體的實(shí)例包括緩沖劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA;糖醇例如甘露醇或山梨醇；成鹽平衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如WEEN、聚乙二醇(PEG)、PLURONICS⑧和透明質(zhì)酸(HA)。可設(shè)計制劑以優(yōu)化CCR2拮抗劑的穩(wěn)定性或允許將活性成分緩釋或延釋至血液。各類型CCR2拮抗劑的適當(dāng)制劑和給藥途徑可參見例如"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy",A.Gennaro編輯，第20版，Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2000。為了使制劑可用于體內(nèi)給藥，它們必須是無菌的。可通過在低壓凍千和復(fù)溶解之前或之后經(jīng)無菌濾膜過濾使制劑無菌。本文的治療組合物一般置于具有無菌進(jìn)入孔的容器中，例如靜脈內(nèi)注射液袋或具有可被皮下注射針刺透的塞子的管形瓶?？捎帽绢I(lǐng)域已知的醫(yī)療器械給予治療組合物。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法用于治療受試者中纖維化，包括器官特異纖維化或系統(tǒng)纖維化。器官特異纖維化至少與肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化、眼纖維化、骨髓纖維化或其他纖維化之一相關(guān)。肺纖維化至少與特發(fā)性肺纖維化、藥物誘導(dǎo)肺纖維化、哮喘、肉狀瘤病或慢性阻塞性肺病之一相關(guān)。肝纖維化可至少與肝硬化、血吸蟲病或膽管炎之一相關(guān)。肝硬化可選自酒精性肝硬化、丙型肝炎后肝硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化。膽管炎為硬化性膽管炎。腎纖維化可至少與糖尿病腎病或狼裔腎小球硬化癥之一相關(guān)。心臟纖維化可至少與一種類型的心肌梗塞相關(guān)。血管纖維化可至少與血管成形術(shù)后動脈狹窄或動脈粥樣硬化之一相關(guān)。皮膚硬化可至少與燒瘢痕、肥厚性瘢痕、瘢痕瘤或腎源性纖維性皮膚病之一相關(guān)。眼纖維化可至少與眶后纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后或增殖性玻璃體^L網(wǎng)膜病之一相關(guān)。骨髓纖維化可至少與特發(fā)性骨髓纖維化或藥物誘導(dǎo)骨髓纖維化之一相關(guān)。其它纖維化可選自帕榮雷氏病(Peyronie，sdisease)、掌腱膜攣縮癥(contracture)或皮肌炎。系統(tǒng)纖維化可選自系統(tǒng)硬化和移植物4元宿主病。患者評價間質(zhì)性肺病(ILD)涵蓋多種纖維變性病癥，其由于相似的臨床、放射學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)表現(xiàn)而歸為一類。彌漫性實(shí)質(zhì)性肺疾病這一更準(zhǔn)確的術(shù)語誤導(dǎo)性更小，因為絕大多數(shù)這些病癥影響末端細(xì)支氣管、間質(zhì)和肺泡。雖然IPF被稱作一種"肺炎"，但是炎癥的作用似乎相對較小。環(huán)境的、遺傳的或其他未知因素被認(rèn)為最初誘發(fā)了肺泡上皮細(xì)胞損傷，但是自身延續(xù)以及異位間質(zhì)成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增殖被認(rèn)為與臨床疾病的發(fā)展有關(guān)。關(guān)鍵的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)為具有成纖維細(xì)胞增殖位點(diǎn)(成纖維細(xì)胞集落)和密集瘢痕化的胸膜下纖維化，與正常肺組織區(qū)域交替(不均一性)。分散間質(zhì)炎癥與淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和組織細(xì)胞浸潤一起發(fā)生。外周肺泡的嚢性擴(kuò)張(蜂窩樣)存在于所有患者中并且f遺著疾病力口重而土曾力口。參見MerckManualofDiagnosisandTherapy(第18版)，Section:PulmonaryDisorders,Subject:InterstitialLungDiseases,Topic:IdiopathicInterstitialPneumonias.2006。彌漫性肺病例如慢性阻塞性肺病和肺動脈高血壓排除于ILD分類。嚴(yán)重ILD患者遭受長期呼吸困難并最終死于呼吸衰竭。間質(zhì)性肺病包括導(dǎo)致許多患者呼吸功能不全和死亡的不同種類的病癥。肺移植是可選候選中一個治療選^奪。一般人群中ILD的準(zhǔn)確發(fā)病率和患病率仍然未知。人們認(rèn)為ILD要比之前所沖艮道(每100000人5例)的更加流行。BernalilloCounty,NewMexico的人群研究報導(dǎo)男性中每100000人80.9例和婦女中每100000人67.2例的發(fā)病率。特發(fā)性肺纖維化(IPF)是最常見的ILD形式，占這一研究中全部案例的約45%。可引起呼吸衰竭的其他彌漫性肺病包括肉狀瘤病、淋巴管肌瘤病、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥或嗜酸細(xì)胞性肉芽肺、脫屑性間質(zhì)肺炎(DIP)、非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)以及與結(jié)締組織疾病相關(guān)的肺纖維化?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在疾病的癥狀表現(xiàn)之前、同時或之后進(jìn)行間質(zhì)性特發(fā)性肺纖維化患者(UIP/IPF或NSIP患者)對抗-CCR2療法需要的評價。通常診斷肺病的方法包括嚴(yán)重度，例如機(jī)械通氣的需要；癥狀，例如咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱、咯血；發(fā)病類型，漸進(jìn)、急性或亞急性；隱晦疾病，免疫缺陷、膠原血管病、血管炎；環(huán)境暴露，石棉、鳥抗原、毒性煙霧；用藥史，皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥劑、抗生素；實(shí)驗室異常，貧血、血清嗜酸細(xì)胞計數(shù)升高、抗中性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體，抗曲霉血清沉淀素、類風(fēng)濕因子；放射照相檢查結(jié)果，正常、彌散或局部陰影，結(jié)節(jié)性或斑塊實(shí)質(zhì)變化，間隙性(airspace)或間質(zhì)性，上或下葉突出；放射照相術(shù)(HRCT)可發(fā)現(xiàn)的胸膜滲漏，磨玻璃樣陰影、支氣管擴(kuò)張、氣道疾病的跡象、下葉、胸膜下、微嚢的(microcystic)或蜂窩樣變化，兩側(cè)上葉嚢腫和小瘤，兩側(cè)彌散性嚢變。最后對病人進(jìn)行肺功能檢測以確定該病理生理學(xué)是否為梗阻性、限制性、混合梗阻性或限制性或正常。IPF(UIP)中的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)包括不規(guī)則線性陰影(網(wǎng)狀型)。然而，這一觀察可存在于膠原血管病、石棉沉著病和慢性過敏性肺炎中。UIP的遠(yuǎn)端肺實(shí)質(zhì)將以^^窩樣型式纖維化。其它形式的間質(zhì)性纖維化可由以下原因引起淋巴細(xì)胞間質(zhì)性肺炎、膠原血管病、藥物反應(yīng)、肺塵癥(石棉沉著病、鈹中毒、矽肺、硬金屬塵肺和其他)、慢性肉芽腫感染、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(嗜酸細(xì)胞性肉芽腫)、慢性肉芽腫感染、慢性誤吸、慢性過敏性肺炎、機(jī)化性慢性嗜酸細(xì)胞性肺炎、機(jī)化性和機(jī)化中(organizing)彌漫性肺泡損傷、慢性間質(zhì)性肺水肺/被動淤血，放射(慢性)，已痊愈的感染性肺炎。UIP的典型HRCT型包括具有蜂窩樣和牽拉性支氣管擴(kuò)張的雙基底外周網(wǎng)織化(bibasilarperipheralreticulation)。磨玻璃渾濁4b不是該疾病的特點(diǎn)，如果存在的話，通常很少，其中一些實(shí)際上是由纖維化引起的。IPF的兩個最具特征性的特點(diǎn)為下葉蜂窩樣，其對于IPF診斷的優(yōu)勢比為5.36，以及所謂的"上葉不規(guī)則索條影"，對于IPF診斷的優(yōu)勢比為6.28(Hunninghake2003.Chest.124:1215-1223)。成肌纖維細(xì)胞相對不存在于非纖維化組織中。成肌纖維細(xì)胞包含使這些細(xì)胞具有收縮表型的平滑肌肌動蛋白纖維，用于使傷口閉合。a-平滑肌肌動蛋白(aSMA)為成肌纖維細(xì)胞的標(biāo)記。TGFbl為原型促纖維化生長因子，其之前顯示可誘導(dǎo)aSMA表達(dá)(Desmouliere等，1995ExpNephrol3(2):134-9)。使用經(jīng)培養(yǎng)的來自UIP患者的成纖維細(xì)胞和來自非纖維化肺的成纖維細(xì)胞，申請人已發(fā)現(xiàn)TGFbl可在非纖維化和纖維化成纖維細(xì)胞二者中誘導(dǎo)aSMA,但是，誘導(dǎo)的強(qiáng)度在纖維化成纖維細(xì)胞中更大。用PDGF刺激成纖維細(xì)胞可誘導(dǎo)aSMA表達(dá)的中等增加(小于IO倍)，但是僅在纖維化成纖維細(xì)胞中。在這三者中，申請人的數(shù)據(jù)顯示僅CCL2在纖維化成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)大于10倍的aSMA表達(dá)增加。膠原沉著是纖維化的關(guān)鍵標(biāo)志并且溶膠原I和溶膠原III這兩個基因之前已顯示與uip相關(guān)。溶膠原i和溶膠原m蛋白已顯示在uip樣本中在肺和全身均升高(Low等，1992AmRevRespirDis146(3):701-6;Strieter等，2004AmJRespirCritCareMed170(2):133-40;Bensadoun等，1996.AmJRespirCritCareMed154(6Pt1):1819-28.)。申請人:已證明了CCL2在UIP成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)溶膠原I和溶膠原III二者。而且，CCL2的基因誘導(dǎo)強(qiáng)度與兩個促纖維化細(xì)胞因子TGFpl和PDGF-AB產(chǎn)生的作用具有可比性。已詳細(xì)描述了TGFpl在多種組織和器官中的促纖維化作用。TGFpl作用可經(jīng)自分泌機(jī)制進(jìn)一步放大。申請人在用TGF(31刺激的非纖維化和纖維化肺成纖維細(xì)胞中均觀察到這一放大機(jī)制，兩種細(xì)胞類型均表現(xiàn)出TGFP1存在下TGF(31增加。也發(fā)現(xiàn)CCL2可增強(qiáng)TGF卩1基因表達(dá)，并且如同TGFP1的情形一樣，CCL2的TGFpl基因誘導(dǎo)程度在纖維化成纖維細(xì)胞中更大。之前已發(fā)現(xiàn)硬皮病患者的皮膚成纖維細(xì)胞中TGFP受體增力口(Kubo等，2002JRheumatol29(12):2558-64;Kawakami1998.JInvestDermatolll0(l):47-51)。雖然與TGFpi、PDGF兩種TGFp受體亞基均增加，但是TGFpl主要增加TGFPRI，CCL2誘導(dǎo)兩種亞基表明該作用不僅僅歸因于CCL2對TGFpi的誘導(dǎo)。結(jié)締組織生長因子(CTGF)已顯示可介導(dǎo)許多TGFpi作用包括膠原產(chǎn)生。TGFbl在纖維化和非纖維化成纖維細(xì)胞二者中誘導(dǎo)CTGF基因表達(dá)增加。而且，PDGF和CCL2在UIP成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)CTGF基因表達(dá)增加。申請人的數(shù)據(jù)顯示TGFpl、PDGF和CCL2增強(qiáng)UIP成纖維細(xì)胞中的IL13Ral表達(dá)。IL-13為Th2-型細(xì)胞因子，其在UIP患者的肺中水平升高。IL-13為體外和體內(nèi)促纖維化模型。IL-13誘導(dǎo)膠原生成和成纖維化纟田胞增殖(Saito2003.IntArchAllergyImmunol2003;132(2):168-76;Ingram2004FasebJ18(10):1132-4)。許多鼠類肺纖維化模型數(shù)據(jù)表明IL13和經(jīng)IL13Ra2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可促纖維化并且也可能經(jīng)TGF(31誘導(dǎo)發(fā)揮作用(Fichtner-Feigl2006.NatMed12(1):99-106)。因此，申請人數(shù)據(jù)顯示在IL13Ra2表達(dá)中TGF卩1、PDGF-AB和CCL2均上調(diào)，這表明CCL2可直接或間接使成纖維細(xì)胞對IL-13介導(dǎo)的應(yīng)答更^:感。標(biāo)志并區(qū)分了來自非纖維化肺的成纖維細(xì)胞與UIP成纖維細(xì)胞的應(yīng)答。之前的研究已表明CCR2表達(dá)于硬皮病患者皮膚的成肌纖維細(xì)胞的動物才莫型已顯示分離自纖維化、Th2-型環(huán)境成纖維細(xì)胞上CCR2的上調(diào)以及這些細(xì)胞對CCR2配體的功能性增加(Hogaboam1999.JImmunol1999;163(4):2193-201.)。但是這是第一個表明CCR2對病變肺成纖維細(xì)胞的促纖維化、功能性作用的研究。CCR2-CCL2抑制已顯示在纖維化體內(nèi)模型中是有益的。就機(jī)制而言，動物模型中纖維化抑制歸因于纖維細(xì)胞募集減少和炎癥反應(yīng)減弱，其可能或不能轉(zhuǎn)換至人類疾病。本發(fā)明基于申請人使用人類成纖維細(xì)胞證明CCR2配體CCL2可驅(qū)動纖維化應(yīng)答并且UIP成纖維細(xì)胞對CCL2具有高反應(yīng)性。因此，該數(shù)據(jù)表明尤其通過拮抗CCL2與CCR2結(jié)合的阻斷、抑制、下調(diào)或拮抗CCR2生物活性的方法可有效緩解呆滯肺功能喪失的對間質(zhì)肺組織快速并且目前不可逆的損傷，鑒于申請人已建立了CCL2對病變肺成纖維細(xì)胞的直接促纖維化作用。在本發(fā)明方法中，可在本文公開的可檢測標(biāo)記的起始時間給予UIPCCR2拮抗劑，包括但不限于CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF。本領(lǐng)域目前與IIDs尤其是IPF診斷和治療相關(guān)的認(rèn)識表明引起纖維化的原因和起始事件如細(xì)胞病理學(xué)中一樣多種多樣(Chapman2004JClinInvest113(2):148-157)。為了確定哪一經(jīng)診斷的患者亞組可受到抗-CCL2療法的幫助，鑒定與CCL2介導(dǎo)疾病相關(guān)的生物標(biāo)記是有價值的。來自IPF組織的研究顯示對MMP-7在基因表達(dá)水平上調(diào)的差異調(diào)節(jié)并且已顯示若干蛋白在支氣管灌洗液和/或血清中上調(diào)，包括KL-6、ENA-78、IP-IO、CCL7、IL-2、IL-8、IL-10和IL-12(p40)。但是，目前為止未發(fā)現(xiàn)這些蛋白與CCL2減弱之間的相互關(guān)系。除CCL2之外的數(shù)個細(xì)胞因子，例如IL-1、PDGF、骨橋蛋白(Osteopontin)、TNF、TGF、CCL3、CXCL8、CXCL5、CXCL12、CXCL9、CXCLIO、CXCLll，已顯示參與了IPF發(fā)病。但是，與CCL2的關(guān)系仍不清楚并且目前為止不同實(shí)驗室對來自IPF患者的成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)分析得到了不同的結(jié)果(為全面了解，見Studer等，2007.ProcAmerThoracicSoc.4(1):p.85-9)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞具有可檢測基礎(chǔ)水平的CCL2并且近期研究顯示外源加入的CCL2可調(diào)節(jié)IL-6產(chǎn)生(Liu，X等，207AmerJRespirCellMolecBiol.37(1):121-8)。因此CCL2作為中心介導(dǎo)因子發(fā)揮作用，并且IPF成纖維細(xì)胞環(huán)境中的CCL2的中和可調(diào)節(jié)其它基因和/或蛋白的表達(dá)。使用來自纖維化患者的分離固有成纖維細(xì)胞，申請人已確定來自IPE患者的肺成纖維細(xì)胞比非纖維化成纖維細(xì)胞表達(dá)更高水平的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF。申請人也確定了CNT088(中和性CCL2抗體)可阻斷表達(dá)最高水平的細(xì)胞中這些蛋白的生產(chǎn)。IPF的準(zhǔn)確診斷涉及肺活組織檢查和罕見間質(zhì)性肺炎的組織學(xué)分析。由于這一操作的侵入性，對于初次診斷之后常規(guī)監(jiān)控疾病進(jìn)展不實(shí)用。其它非-侵入性診斷可用但是變化無常。因此需要相對非侵入性的定量診斷工具。可以比手術(shù)組織活檢更小的侵入性取樣組織液例如血清或支氣管肺泡灌洗液。來自所收集細(xì)胞的可溶蛋白和細(xì)胞表面標(biāo)記或基因表達(dá)均可使用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行定量以診斷并監(jiān)測疾病進(jìn)展。監(jiān)測組織的這些基因和/或蛋白可用于測定CNTO888對CCL2的中和程度。因此對來自可獲得外周組織的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF的基因和/或蛋白測定將提供新穎并相對非侵入性的疾病生物標(biāo)記和目標(biāo)中和。在一個評價患者的實(shí)施方案中，將5名或更多患者的血樣采集至用于核酸分析的試管中例如PAXgeneBloodRNA試管(SystemPreAnalytiX)并且可分離總RNA并通過本領(lǐng)域已知的任何方法分析基因表達(dá)，這些方法包括特異于至少CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一的特異探針。如果任何或所有這些基因的表達(dá)水平高于來自未表現(xiàn)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者的癥狀的年齡和性別匹配樣本的兩倍即可選擇患者進(jìn)行治療。在另一個實(shí)施方案中，可基于與年齡和性別相匹配的正常志愿者相比任何或所有這些基因的表達(dá)的變化為2倍或更多來調(diào)節(jié)所選治療患者的劑量選擇。在本發(fā)明方法的另一個實(shí)施方案中，可基于與年齡和性別相匹配的正常志愿者相比任何或所有這些基因的表達(dá)的變化為2倍或更多來監(jiān)測對療法的響應(yīng)。在另一個實(shí)施方案中，可/人表現(xiàn)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎癥狀的患者采集5ml的血液至血清收集管中。使用可商業(yè)購買的multiplex或ELISA試劑盒檢測血清中的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部。如果任何或所有蛋白的表達(dá)水平大于年齡和性別匹配的正常志愿者的2倍即可選擇患者進(jìn)行治療。另一方面，可基于與年齡和性別相匹配的正常志愿者相比CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部的表達(dá)變化為2倍或更多來調(diào)節(jié)所選治療患者的劑量選擇。在另一方面，可基于與年齡和性別相匹配的正常志愿者相比CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部的表達(dá)變化為2倍或更多來監(jiān)測對療法的響應(yīng)。給藥途徑給藥途徑根據(jù)已知和可接受的方法，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、通過門靜脈注射或輸注，通過緩釋或延釋方式局部給藥；通過透粘膜或透皮給藥皮下注射，通過局部應(yīng)用，鼻噴霧劑、栓劑等，或口服給藥。在本發(fā)明的另一方面，可通過至少一個選自以下的方式給藥腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、嚢內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、子宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸廓內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、損傷內(nèi)、推注、陰道的、直腸的、口頰的、舌下的、鼻可憑經(jīng)驗尋找適合預(yù)防、緩解、逆轉(zhuǎn)或停止有需要的患者中慢性排斥反應(yīng)進(jìn)程的抗-CCR2拮抗劑的劑量并取決于活性藥劑的藥效、制劑的濃度和給藥后該藥劑在受者體內(nèi)有效水平的持續(xù)時間。療程可為與急性方式相反的以持續(xù)方式進(jìn)行的慢性或持續(xù)給藥以將起始療效(活性)維持更長的時間。或者，該治療可為間斷的或周期性的以提供急性拮抗劑活性階段，之后為患者體內(nèi)拮抗劑活性較低或無拮抗劑活性階段。因此，劑量方案可以不同，這樣可每周一次、兩次、三次或更多次給予抗體并且持續(xù)任意周或者以每周一次，每兩周一次，每三、四、五、六、七、/v、九或十周一次，多次(例如，二、三、四、五、六、七次)纟會予該抗體。就CCR2生物活性的單克隆抗體拮抗劑而言，通常以基于受者體重的量(例如每療程O.l至100mg/kg之間)給予該藥劑。根據(jù)本發(fā)明方法給予的抗體的治療或預(yù)防有效量的示例性并非限制性范圍為0.1-20mg/kg,更優(yōu)選1-10mg/kg。在一個實(shí)施方案中，可以小于10mg/min，優(yōu)選小于或等于5mg/min的速度靜脈輸注給予抗-CCR2或抗-CCL2抗體直至達(dá)到約1至500mg/m2的劑量，優(yōu)選約10至400mg/m2,約18至350mg/m2,更優(yōu)選約250-280mg/m2?？梢詥蝿┝炕蚨鄤┝拷o予抗-CCR2或抗-CCL2抗體。組合療法治療沒有具體的治療證明對IPF有效。支持療法由02治療低氧血和抗生素治療肺炎組成。后期疾病可使所選患者有資格進(jìn)行肺移植。通常憑經(jīng)驗給予IPF患者皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒藥物例如環(huán)磷酰胺(CYTOXAN)、硫唑嘌呤(IMURAN)以試圖停止炎癥進(jìn)程，但是僅有限數(shù)據(jù)支持他們的功效。然而，通常用潑尼松(例如DELTASONE)(0.5至1.0mg/kg口服，每日一次持續(xù)3個月，在之后的3至6個月中逐漸減少至0.25mg/kg每日一次)與環(huán)磷酰胺或硫唑噤呤(l至2mg/kg口服每日一次)組合進(jìn)行治療。一年中每三個月評價臨床的、放射照相的和生理學(xué)響應(yīng)并且相應(yīng)地增加或降低劑量。如果沒有客觀響應(yīng)(objectiveresponse)則孑亭止治療?？估w維化劑曱苯吡啶酮可穩(wěn)定化肺功能并減少惡化。抑制膠原合成(松弛素)、促纖維化生長因子(蘇拉滅)和內(nèi)皮素-1(血管緊張素受體阻斷劑)的抗纖維變性藥物被證明僅在體外有效。干擾素-y-lb與潑尼松組合在小組患者中顯示出希望，但是更大規(guī)模的雙盲多國隨機(jī)化試驗發(fā)現(xiàn)對無進(jìn)展生存期、肺功能或生活質(zhì)量沒有作用。雖然已簡要描述了本發(fā)明，仍在以下實(shí)施例中進(jìn)一步公開本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)施例1:纖維化和非-纖維化成纖維細(xì)胞為了表征與來自組織病理學(xué)的非纖維化肺組織的成纖維細(xì)胞相比的來自UIP患者的成纖維細(xì)胞的固有性質(zhì)，評價來自一類或其它類型組織的原代成纖維細(xì)胞在未受激狀態(tài)下和對已知纖維化病變介導(dǎo)因子，例如TGFbeta、PDGF-AB和CCL2響應(yīng)下的標(biāo)記。成纖維細(xì)胞分離和純化細(xì)胞系由密西根大學(xué)的CoryHogaboam博士提供。如之前所述分離所有的原代成纖維細(xì)胞系(Hogaboam等，1999JImmunol163(4):2193-201)。從取自UIP患者(『4)的肺活組織檢查物分離肺成纖維細(xì)胞并將這些細(xì)胞稱作"纖維化成纖維細(xì)胞"。也從肺腫瘤切除術(shù)(11=5)中取樣的肺組織分離成纖維細(xì)胞并通過組織學(xué)分析確認(rèn)這些樣品為非纖維化的。這些衍生自非纖維化組織的成纖維細(xì)胞被稱作"非纖維化成纖維細(xì)胞"。成纖維細(xì)胞基因表達(dá)NY)中并使其吸附8小時。然后用PBS洗滌細(xì)胞并在無血清培養(yǎng)基(含有l(wèi)-谷氨酰胺的DMEM,青霉素/鏈霉素)中培養(yǎng)過夜。接著在存在或不存在TGFb-l(1或10ng/mL)、PDGF-AB(20或200ng/mL)或CCL2(1或10ng/mL)的條件下刺激細(xì)胞24小時。TGFbl、PDGF-AB和CCL2購自R&DSystems。去除上清并接著使用RNeasyPlusMini-Kits(QIAGEN，Valencia,CA)根據(jù)操作說明分離RNA并使用TaqMana逆轉(zhuǎn)錄試劑(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過實(shí)時PCR4吏用TaqmanaUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems)和預(yù)研發(fā)的Taqmana基因表達(dá)測定法(AppliedBiosystems)根據(jù)操作說明測定促纖維化基因表達(dá)。使用比較性CT法計算定量基因表達(dá)，其中CT值限定為第一次檢測到基因表達(dá)的閾值循環(huán)數(shù)。首先將所關(guān)注基因的基因表達(dá)的倍數(shù)變化對管家基因18S標(biāo)準(zhǔn)化，得到ACT值。纖維化和非纖維化成纖維細(xì)胞表達(dá)的倍數(shù)變化按下式計算ACT(非纖維化)-ACT(纖維化)=AACT，其中非纖維化基因表達(dá)作為校準(zhǔn)因子(calibrator)。歸因于體外刺激的基因表達(dá)的倍數(shù)變化按下式計算AACT=ACT(未受激)-ACT(受激)，其中未受激樣品作為校準(zhǔn)因子。然后計算2-AACT得到與校準(zhǔn)因子相比的最終倍數(shù)變化的相對值。為了測定與非纖維化(n-4)成纖維細(xì)胞相比UIP成纖維細(xì)胞(11=3)中的促纖維化基因表達(dá)中的基線表達(dá)是否存在差異，比較來自兩組患者的未受激細(xì)胞之間的基因表達(dá)。如圖1所示，衍生自UIP患者的成纖維細(xì)胞在所有被分析的基因中具有更高的基線纖維化基因表達(dá)。TGFbl在非纖維化和纖維化成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)aSMA,但是纖維化成纖維細(xì)胞中的誘導(dǎo)強(qiáng)度更大(圖2)。PDGF僅在纖維化成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)aSMA表達(dá)的中度增加。CCL2也僅在纖維化成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)aSMA表達(dá)增加。為了測定UIP成纖維細(xì)胞是否表現(xiàn)水平增強(qiáng)的膠原基因表達(dá)，用CCL2刺激細(xì)胞。圖3A和B顯示CCL2在UIP成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)溶39膠原I和溶膠原III二者。此外，CCL2的基因誘導(dǎo)程度與TGFbl和PDGF-AB產(chǎn)生的作用具有可比性。已詳細(xì)描述了TGFbl的促纖維化作用。TGFbl、PDGF和CCL2誘導(dǎo)TGFbl基因表達(dá)(圖4)。自分泌環(huán)的TGFbl誘導(dǎo)是已知的并由非纖維化和纖維化成纖維細(xì)胞的現(xiàn)有數(shù)據(jù)支持。該實(shí)驗進(jìn)一步證明了CCL2也可增強(qiáng)TGFbl基因表達(dá)。如同TGFbl的情況一樣，CCL2對TGFbl的基因誘導(dǎo)程度在纖維化成纖維細(xì)胞中更大。TGFbl、PDGF和CCL2誘導(dǎo)CTGF基因表達(dá)(圖5)。TGFbl在纖維化和非纖維化成纖維細(xì)胞二者中誘導(dǎo)CTGF基因表達(dá)增加。此外，低劑量PDGF和CCL2誘導(dǎo)UIP成纖維細(xì)胞中CTGF基因表達(dá)增力口。TGFbl、PDGF和CCL2-誘導(dǎo)的TGFbRI和TGFbRII二者亞基基因表達(dá)顯示于圖6A和B。TGFbl對TGFbRI具有更大的作用而CCL2可誘導(dǎo)二者并且TGFbRII的增加更大。TGFbl、PDGF和CCL2-誘導(dǎo)的IL13Ral和IL13Ra2基因表達(dá)顯示于圖7A和B。TGFbl、PDGF和CCL2上調(diào)UIP成纖維細(xì)胞中的IL13Ral表達(dá)。經(jīng)IL13Ra2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最近被證明可通過TGFbl的誘導(dǎo)而促纖維化。所有三種介導(dǎo)因子誘導(dǎo)IL13Ra2表達(dá)上調(diào)，藉此有可能使這些細(xì)胞對IL-13介導(dǎo)的應(yīng)答更l文感。實(shí)施例2將來自IPF和非纖維化患者的肺組織切碎并放入含有20ml培養(yǎng)基(DMEMw/15%FCS，1%PSA,&L-谷氨酰胺)的T75cm組織培養(yǎng)瓶中。每周更換兩次培養(yǎng)基直至形成細(xì)胞集落。將細(xì)胞分離并傳代。第5次傳代后進(jìn)行試驗。RNA分離在DMEM15%FCS1%Glutamax,1%青霉素鏈霉素中以lx105細(xì)胞在500ul/孔的24孔板中過夜培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。在無血清DMEM中將細(xì)胞培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)基換成添加了人血清白蛋白的DMEM并將培養(yǎng)物溫育24和/或48小時。為了收獲RNA，使用RNeasymini試劑盒(Qiagen，Inc.Valencia,CA)根據(jù)操作說明裂解所培養(yǎng)細(xì)胞。使用2100BioAnalyzer(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)測定RNA的質(zhì)和量。RT-PCR4吏用TaqMan試劑(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)才艮氺居方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，25。C反應(yīng)10分鐘，48。C反應(yīng)30分鐘，95。C反應(yīng)5分鐘。使用帶有ABIPrism7900序列檢測系統(tǒng)的定制ABI低密度陣列(一式兩份根據(jù)試驗需要的引物和探針(duplicateAssays-on-Demandprimersandprobes))進(jìn)4亍實(shí)日于PCR。在AmpliTaqGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)存在下，將反應(yīng)物于50°C溫育2分鐘然后95°C溫育10分鐘。接著進(jìn)行40個循環(huán)的反應(yīng)，每個循環(huán)95。C15秒，60。Cl分鐘。內(nèi)源對照GAPDH用于使用DCT方法標(biāo)準(zhǔn)化樣品以進(jìn)行相對定量。免疫檢測如上所述過夜培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。取樣上清使用LINCOplex人細(xì)胞因子/趨化因子30plexpanel(Millipore)、ENA-78Quantikine試劑盒和IL-13RA2ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng))進(jìn)行沖企測。結(jié)果由RT-PCR在24小時評價來自7個IPF肺成纖維細(xì)胞系和5個非纖維化肺成纖維細(xì)胞系的cDNA以得出CXCL5、CCL2、IL13ra2和IL-6的相對表達(dá)。表1顯示了各IPF細(xì)胞系對于非纖維化細(xì)胞系的平均dCt(靶Ct-GAPDHCt)的相對倍數(shù)表達(dá)。IPF細(xì)胞系126具有CXCL5、IL13ra2和IL-6的最高表達(dá)。7個細(xì)胞系中的6個CCL2表達(dá)大于或等于非纖維化細(xì)胞的兩倍。5個細(xì)胞系的CXCL5和IL6表達(dá)水平大于或等于非纖維化細(xì)胞的兩倍并且4個細(xì)胞系的IL13ra2表達(dá)大于或等于非纖維化細(xì)胞的兩倍。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>蛋白質(zhì)分析通過ELISA或multiplex檢測5個UIP細(xì)胞系和5個非纖維化細(xì)胞系上清的IL-6、IL-8、CCL2、CXCL5、G-CSF和VEGF的蛋白質(zhì)表達(dá)。表2和3以pg/ml顯示了所有被檢測細(xì)胞系的蛋白水平。纖維化細(xì)胞系148具有IL-6、IL-8、G-CSF、CCL2和VEGF的最高水平表達(dá)。細(xì)胞系126的CXCL5(16430pg/ml)最高。IL-8表達(dá)大于或等于所有5個細(xì)胞系非纖維化表達(dá)中值的2倍。CCL2和L-6表達(dá)大于或等于5個細(xì)胞系中4個非纖維化表達(dá)中值的2倍。G-CSF表達(dá)大于或等于2個細(xì)胞系非纖維化表達(dá)中值的2倍。VEGF表達(dá)大于或等于3個細(xì)胞系非纖維化表達(dá)中值的2倍。CXCL5表達(dá)大于或等于2個細(xì)胞系非纖維化表達(dá)(對于數(shù)值大于O者)中值的2倍。比較纖維化和非纖維化細(xì)胞系的中值表明纖維化和非纖維化細(xì)胞之間中值差異的相對強(qiáng)度方面IL8>IL6^CCL2>VEGF。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>為了進(jìn)一步確定這些介導(dǎo)因子之間的關(guān)系，用CCL2-中和抗體CNT0888(分別由SEQIDNO,27和28給出的重鏈和輕《連可變區(qū)組成)或無關(guān)同種型匹配的抗體處理纖維化細(xì)胞系126，并且將基因和蛋白表達(dá)水平與相同細(xì)胞系不存在抗體時相比?；虮磉_(dá)結(jié)果見表4，蛋白表達(dá)見表5。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>抗-CCL2抗體(CNT0888)存在下不能準(zhǔn)確檢測CCL2，盡管可在治療中監(jiān)測抗-CCL2的存在。使用CNTO888的蛋白質(zhì)減少的最高倍數(shù)為G-CSF(6803倍)。最低倍數(shù)為VEGF(4倍)G-CSF〉IL6=CXCL5>IL8〉VEGF。在多個時間點(diǎn)通過肺活組織檢查監(jiān)測疾病進(jìn)程是不實(shí)際的。一組由CCL2減弱的促纖維化標(biāo)記已得到鑒定并可于活體外加以測定以評價CCL2活性。使用已鑒定的標(biāo)記作為替代標(biāo)記，使得能夠在治療中監(jiān)測抗體活性以輔助確定治療選項例如劑量和時間。其次，我們已確定了IPF肺成纖維細(xì)胞種群中促纖維化基因/蛋白表達(dá)譜的大幅度差異性，其可指示對抗-CCL2療法具有潛在響應(yīng)性的患者亞群。使用促纖維化組的基因/蛋白作為疾病替代標(biāo)記可提供疾病進(jìn)程的定量和相對非侵入性量度標(biāo)準(zhǔn)。權(quán)利要求1.使用至少一種MCP-1拮抗劑在具有至少一種形式纖維化的患者中抑制至少一種人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的方法，其包括給予MCP-1抑制有效量的至少一種MCP-1拮抗劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述MCP-1拮抗劑選自小分子和蛋白質(zhì)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述小分子選自能阻斷CCL2結(jié)合至CCR2B或抑制CCR1或CCL2自身的吲哚衍生物、環(huán)胺衍生物、脲基衍生物、雜環(huán)化合物、酰基苯胺或功能性吡咯。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白選自可溶受體、抗體、肽、其片段或其融合蛋白。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白進(jìn)一步包含可增加所述蛋白血漿半衰期的化合物或蛋白。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少一個包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈的可變區(qū)，所述MCP-1抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)二者，其包含SEQIDNO:27和28。7.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)，所述抗體包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。8.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少一個包含至少一個重鏈和至少一個輕鏈的可變區(qū)，所述MCP-1抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)二者，其包含SEQIDNO:27和28。9.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)，所述抗體包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有的重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。10.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少一條重鏈或輕鏈CDR,其具有至少SEQIDNO:6、7、9、13、14和16之一的氨基酸序列。11.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體包含至少SEQIDNO:2-5之一的重鏈或輕鏈可變區(qū)，其進(jìn)一步包含重鏈或輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或選自SEQIDNO:6-26的其配體結(jié)合部分；并且4壬選與框架區(qū)功能性相關(guān)，進(jìn)一步任選包含至少人免疫球蛋白的CH1、鉸鏈、CH2或CH3。12.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體以選自至少1(T9M、至少1(T1QM、至少10"1M或至少l(T12M的至少之一的親和力與MCP-1結(jié)合。13.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體實(shí)質(zhì)上調(diào)節(jié)至少一個MCP-1多肽的至少一種活性。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述小分子或蛋白以進(jìn)一步包含至少一種藥理學(xué)可接受載體或稀釋劑的組合物形式提供。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括給予選自至少以下之一的至少一種化合物或多肽可檢測標(biāo)記或受體、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、體液或電解質(zhì)平衡藥物、血液學(xué)藥物、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)藥物、目艮、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)產(chǎn)品、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述抑制有效量為0.001-50mg/所述細(xì)胞、組織、器官或動物的公斤數(shù)。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述給藥通過至少一種選自以下的方式進(jìn)行腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、嚢內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、子宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心月幾內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸廓內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、損傷內(nèi)，推注、陰道的、直腸的、口頰的、舌下的、鼻內(nèi)的或經(jīng)皮的。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維化為器官特異纖維化或系統(tǒng)纖維化。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述器官特異纖維化至少與肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化、眼纖維化、骨髓纖維化或其他纖維化之一相關(guān)。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述肺纖維化至少與藥物誘導(dǎo)的肺纖維化、哮喘、肉狀瘤病或慢性阻塞性肺病之一相關(guān)。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述肝纖維化至少與肝^/f匕、血吸蟲病肝硬變或膽管炎之一相關(guān)。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述肝硬化選自丙型肝炎后肝硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述膽管炎為硬化性膽管炎。24.權(quán)利要求19的方法，其中所述腎纖維化與狼瘡腎小球硬化癥相關(guān)。25.權(quán)利要求19的方法，其中所述心纖維化與至少一種類型的心肌梗塞相關(guān)。26.權(quán)利要求19的方法，其中所述血管纖維化至少與血管成形術(shù)后動脈再狹窄或動脈粥樣硬化之一相關(guān)。27.權(quán)利要求19的方法，其中所述皮膚纖維化至少與瘢痕瘤或腎原性纖維組織形成皮膚病之一相關(guān)。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述眼纖維化至少與眶后纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變之一相關(guān)。29.權(quán)利要求19的方法，其中所述骨髓纖維化至少與特發(fā)性骨髓纖維化或藥物誘導(dǎo)的骨髓纖維化之一相關(guān)。30.權(quán)利要求19的方法，其中所述其它纖維化選自帕榮雷氏病、杜氏掌腱膜攣縮癥或皮肌炎。31.權(quán)利要求18的方法，其中所述系統(tǒng)纖維化選自系統(tǒng)硬化病和移纟直物抗宿主病。32.本文所述任何發(fā)明。全文摘要提供抗-MCP-1/CCR2拮抗劑療法用于控制或逆轉(zhuǎn)纖維化相關(guān)疾病，包括但不限于例如用于調(diào)節(jié)與纖維化進(jìn)程包括膠原基質(zhì)沉積和肺泡萎陷相關(guān)的促纖維化標(biāo)記的MCP-1/CCR拮抗劑療法。文檔編號A61K39/395GK101616689SQ200780044419公開日2009年12月30日申請日期2007年10月5日優(yōu)先權(quán)日2006年10月5日發(fā)明者A·達(dá)斯,F·塞德,L·默里申請人:森托科爾奧索生物科技公司