專利名稱：：篩選抑制tm4sf5功能的抗癌化合物和含有查耳酮化合物的抗癌組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種篩選抗癌化合物的方法，具體涉及一種篩選己知TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的化合物的方法。而且，本發(fā)明涉及使用該方法篩選的作為抗癌物質(zhì)的査耳酮(苯丙烯酰苯)化合物，和包括査耳酮化合物作為有效成分的抗癌組合物。
背景技術(shù)：
：跨膜4L6家族成員5(TM4SF5或者L6H)是與作為跨膜4L6超家族的一個成員的腫瘤相關(guān)抗原L6(TM4SF1)同源的蛋白質(zhì)?？缒?L6超家族進一步包括IL-TMP和L6D。L6抗原(TM4SF1)在結(jié)腸、肺部、乳房和卵巢癌中高表達。與L6抗原(TM4SF1)同源的TM4SF5蛋白質(zhì)(L6H)也在一些類型的癌癥中高表達，這些癌癥包括胰腺癌、胃癌，結(jié)腸癌和肝癌(Muller-Pillasch，F(xiàn).等人，208:25,1998;Pascual-LeTallec,L.等人，丄C"".五油cr/"o/.Me威,87:501，2002)。與L6抗原(TM4SF1)相比，TM4SF5mRNA在胃癌組織中以更低水平表達，但在肝癌和胃癌細胞系中過表達(Kaneko,R.等人,顛./(7敝畫/.'96(12):3457,2001)?；谘芯拷Y(jié)果，TM4SF5近來己經(jīng)被登記為新的癌基因，如在美國專利US6,350，581Bl中公開的那樣，其中TM4SF5被命名為人腫瘤相關(guān)抗原(TUAN)。通過在COS7細胞中表達TM4SF5，本發(fā)明的發(fā)明人近來發(fā)現(xiàn)，在Tyr925處的TM4SF5介導(dǎo)的肌動蛋白重組、粘著斑形成和粘著斑激酶(FAK)磷酸化作用經(jīng)整合蛋白-a2亞單位被誘導(dǎo)，并通過用含有細胞生長因子的血清處理而被調(diào)節(jié)(抑制)(Lee,S.Y.等人，Ce//權(quán)312:2983,2006)。但是，TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤生成的分子機理缺乏理解。TM4SF5在分子水平的功能是未知的，并且用于TM4SF5的致癌作用的證據(jù)在生物化學(xué)和細胞生物學(xué)水平上沒有被發(fā)現(xiàn)。另一方面，査耳酮廣泛分布在食用植物中并己知為類黃酮或者異類黃酮(isoflavonoid)的前體。所述查耳酮的衍生物構(gòu)成植物的黃色顏料，影響植物的顏色并保護植物不受有害紫外線照射(MethodologyofNaturalProductChemistry,W.S.Woo,SeoulNationalUniversityPress)。査耳酮衍生物在作為紫菀科的一種的金雞菊植物中含量豐富。有代表性的查耳酮包括2',6'-二羥基-4'-甲氧基查耳酮和紅花素，存在于植物中，包括肉桂、紅花和胡椒。二羥基查耳酮主要包含在Rosaceae和Ericaceae科的一些植物物種內(nèi)。根皮苷為在蘋果皮中最初發(fā)現(xiàn)的二羥基査耳酮，并負責(zé)蘋果樹抗病性。己經(jīng)知道所述査耳酮衍生物具有各種藥物活性，諸如抗原生動物活性(Liu,M.等人，丄Afed.C/iem.,44:4443,2001)抗炎癥活性(Babu，M.A.等人，所oo,g.MedCAem.，10:4035，2003)、免疫調(diào)制(Barfod,L.等人，/"A/www"叩/2"rw"co/.,2:545,2002)、一氧化氮產(chǎn)生的抑制(Rojas,J.等人，A/^/.CAew.Ze仏，12:1951，2002)、抗癌活性(Kumar，S.K.等人，/Met/.C/zem.,46:2813,2003)以及anti-HIV活性(Artico,M.等人，Mecf.C7^淤.，41:3984,1998)。另外，韓國專利公開號10-2003-0036993公開了査耳酮化合物具有對降解基底膜成分的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制活性,(Park,K.H.等人，￡/oorg.Med.C/zem.Le""15:5514,2004)。在這些査耳酮化合物中，磺胺基或磺基取代的査耳酮衍生物已經(jīng)被報道具有在天然產(chǎn)生的査耳酮中沒有顯示的特定生物學(xué)特性。特別是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，磺胺査耳酮衍生物對a-葡萄糖苷酶具有強烈的抑制活性(Park,K.H.等人，Afet/.C/ze肌丄e".，15:5514,2004;KoreanPatentPublication10-0751899)。本發(fā)明的發(fā)明人近來還報道磺基査耳酮衍生物作為選擇性K(+)通道阻斷劑(Park,K.H.等人，MW.C/z綴丄饑，2007)。但是，沒有報道陳述磺胺或者磺基査耳酮衍生物通過抑制癌基因TM4SF5蛋白質(zhì)的機制而具有抗癌活性。在這一點上，本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入全面的研究，從而發(fā)現(xiàn)在人類癌細胞中顯示的TM4SF5的癌基因潛能是由于其刺激上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)的能力，導(dǎo)致接觸抑制喪失。而且，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TM4SF5的癌基因功能經(jīng)過新途徑被介導(dǎo)，該途徑包括一系列步驟，包括粘著斑激酶(FAK)磷酸化作用和細胞液p27kipi聚集，導(dǎo)致RhoA活性抑制并改變細胞形態(tài)?；谶@以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力來篩選抑制TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的抗癌物質(zhì)，從而完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的一個目的在于提供篩選抑制TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的抗癌化合物的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供使用上述方法篩選的抗腫瘤化合物，優(yōu)選為磺胺或者磺基査耳酮化合物，以及包括抗腫瘤化合物作為有效成分的抗癌組合物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了篩選抗癌化合物的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)表達序列號2的多肽的癌細胞，并使用抗癌候選物處理癌細胞；(b)在用抗癌候選物處理的癌細胞中檢測下列中至少一種(i)在編碼粘著斑激酶(FAK)的氨基酸序列的第577位色氨酸(Tyr577)的磷酸化作用，(ii)將FAK結(jié)合到Rho-GTPase活化蛋白質(zhì)(RhoGAP)或者將FAK結(jié)合到與FAK有關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)子(GRAF)，(iii)細胞液p27Kipi的表達水平和穩(wěn)定性，(iv)RhoA活性，和(v)Racl活性；和(c)當(dāng)下列事件發(fā)生時，與當(dāng)沒有用抗癌候選物進行處理時相比較，確定抗癌候選物是否能夠作為抗癌物質(zhì)(i)降低Tyr577上FAK的磷酸化作用，(ii)抑制FAK結(jié)合到RhoGAP或者FAK結(jié)合到GRAF，(m)減少細胞液p27Kipl的表達和穩(wěn)定性，(iv)增強RhoA活性，或者(v)降低Racl活性。在本發(fā)明的方法中，步驟(b)進一步包括檢測選擇下組中至少一種包括細胞形態(tài)，在細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達，細胞-細胞接觸模式或者接觸生長，a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)或者波形蛋白的表達，E-鈣粘蛋白的表達和上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT);并且步驟(c)進一步包括下列事件細胞形態(tài)從桿狀變化成多邊形，降低了在細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達，細胞-細胞接觸的保持，細胞生長的接觸抑制，降低了(x-SMA或者波形蛋白的表達，增加了E-鈣粘蛋白的表達和或者降低了上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)。另外，步驟(b)進一步包括檢測選自下組的至少一種，包括在細胞外基質(zhì)或者血清的存在下細胞轉(zhuǎn)移或者運動，侵入到包括細胞外基質(zhì)的膠原凝膠中，侵入到作為細胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel中，和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性；并且步驟(c)進一步包括下列事件在細胞外基質(zhì)或者血清的存在下降低細胞轉(zhuǎn)移或者運動，降低侵入到膠原凝膠中，降低侵入到Matrigel中，或者MMP活性的降低。本發(fā)明還提供了使用上述方法篩選并由下列化學(xué)式1或2表示的抗成分的抗癌組合物?；瘜W(xué)式1其中，Ri表示R4S02-;R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(CrC5)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(CVCH))芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(CrC5)烷基?；瘜W(xué)式2其中，R,表示R4SCV;R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(d-C5)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(C6-Cu))芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(C廣C5)垸基。通過下列詳細描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和方面將是顯而易見的。圖1顯示了SNU449p,SNU449Cp,Tp,T3,T7和T16細胞以及免疫印跡結(jié)果的照片。圖2顯示了在SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞中用羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色的細胞骨架肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)。圖3顯示了用于指示蛋白質(zhì)的免疫印跡結(jié)果。圖4顯示了用于RhoA和Racl活性的體內(nèi)下拉(pull-down)測定的結(jié)果。圖5顯示了用于SNU449p，SNU449Cp和SNU449Tp細胞的免疫印跡結(jié)果。圖6顯示了圖5的一些細胞的RhoA活性的分析結(jié)果。圖7顯示了用于SNU449Tp細胞的用羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽和DAPI熒光染色的結(jié)果，其己經(jīng)用pEGFP和shTM4SF5轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24小時。圖8顯示了FAK-RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的示意性表示。圖9顯示了用針對pl90RhoGAP,GRAFandFAKforSNU449Tp細胞的抗體免疫印跡的結(jié)果。圖IO顯示了來自SNU449Tp細胞的溶解產(chǎn)物的免疫印跡結(jié)果，其中(HA)3-標記的FAK野生型或者Y577FFAK突變型被過表達。圖11顯示了對照細胞的免疫熒光染色結(jié)果，其中FLAG-標記的GRAF被過表達。圖12顯示了SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞的免疫熒光染色結(jié)果。圖13顯示了具有抗-p27kipl和a-微管蛋白抗體的細胞液和核碎片的免疫印跡結(jié)果。圖14顯示了使用指示抗體的用于p27k^表達水平和SerlO磷酸化作用的免疫印跡結(jié)果。圖15顯示了相對于p27kipl的SerlO磷酸化作用的SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞的免疫熒光染色結(jié)果。圖16顯示了用于檢査p27kipl或者GAPDH基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的RT-PCR和免疫印跡結(jié)果。圖17顯示了在SNU449Tp細胞被pEGFP和shTM4SF5轉(zhuǎn)染后p27kipl和核DNA(使用DAPI)的免疫熒光染色結(jié)果。圖18顯示了具有指示抗體的免疫印跡結(jié)果。圖19顯示了來自SMU449Tp的細胞溶解物的免疫印跡結(jié)果，其中(HA)3-標記的FAK野生型和Y577FFAK突變型被過表達。圖20顯示了來自Huh7，用各種shRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞的細胞溶解物的免疫印跡結(jié)果。圖21顯示了圖20的細胞的免疫熒光染色結(jié)果。圖22顯示了免疫熒光染色的SUN449Cp細胞的共聚焦掃描顯微鏡圖像，其中FLAG-標記的p27kipl被過表達。圖23顯示了SNU449Tp細胞的免疫熒光染色結(jié)果，其中p27kipl的表達被抑制。圖24顯示了具有指示抗體的免疫印跡結(jié)果。圖25顯示了在SNU449Tp細胞的細胞骨架肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的免疫染色結(jié)果，該細胞用活性RhoA63L突變載體轉(zhuǎn)染。圖26顯示了用于LPA處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞的免疫染色結(jié)果。圖27顯示了SNU449Tp細胞的免疫熒光染色結(jié)果，該細胞用活性mDia突變體、活性Racl(Racl61L)和PAK1(PAKl-caax)轉(zhuǎn)染。圖28顯示了在細胞接觸中涉及的蛋白質(zhì)的免疫印跡結(jié)果。圖29顯示了E-韓粘蛋白、卩-連環(huán)蛋白以及SNU449Cp和SNU449Tp細胞的ZOl的免疫染色結(jié)果。圖30顯示了E-鈣粘蛋白、)3-連環(huán)蛋白以及SNU449Tp細胞的ZOl的免疫染色結(jié)果，其中p27k^的表達被抑制。圖31顯示了來自表達shRNA和shTM4SF5的Huh7細胞的細胞溶解物的免疫印跡結(jié)果。圖32顯示了當(dāng)圖31的細胞用HGF(100ng/ml)處理24小時時用于ZOl定位的免疫染色結(jié)果。圖33顯示了用DAPI染色的SNU449Cp和SNU449Tp細胞的和染色結(jié)果(箭頭表示進行細胞分裂的細胞的重疊的核)以及用于每12小時計數(shù)的細胞數(shù)的圖片。圖34顯示了SNU449Tp細胞的免疫染色結(jié)果，顯示細胞重疊和分裂(箭頭表示正在進行細胞分裂的核)。圖35是顯示SNU449Cp細胞和TM4SF5-表達的T7,T16和T3細胞的S-期數(shù)目的圖片。圖36是顯示SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞的S-期數(shù)目的圖片，所述細胞被shRNA和shTM4SF5轉(zhuǎn)染，其中使用流式細胞計分析細胞周期相分布。圖37到圖40顯示了用于SNU449Cp和SNU449Tp細胞的S-期變化的BrdU免疫染色結(jié)果(圖37)，LPA-處理的SNU449Tp細胞的免疫染色結(jié)果(圖38),用p27kiplshRNA腺病毒轉(zhuǎn)染的SNU449Tp細胞的免疫染色結(jié)果(圖39)，和通過在SNU449T16細胞中重新表達E-鈣粘蛋白的SNU449T16m細胞的免疫染色結(jié)果(圖40)。圖41顯示了SNU449Cp(Cp)、SNU449T16(T16)和SNU449T16m(T16m)細胞中指定分子的表達水平。圖42顯示了用于(3-連環(huán)蛋白，ZOl和E-鈣粘蛋白的SNU449T16(T16)和SNU449T16m(T16m)細胞的免疫染色結(jié)果。圖43顯示了當(dāng)用給定濃度的DMSO或者TSAHC(4'-(p-苯甲磺酰胺)-4-羥基査耳酮)處理時存活的SNU449Cp和SNU449Tp細胞的數(shù)目。圖44顯示了用DMSO或者20|iMTSAHC處理然后用BrdU處理24小時的SNU449Tp細胞的免疫熒光染色的結(jié)果。圖45顯示了用DMSO或者20pMTSAHC處理的SNU449Tp細胞的E-鈣粘蛋白和P-連環(huán)蛋白的免疫熒光染色結(jié)果。圖46顯示了用于指示蛋白的免疫印跡結(jié)果。圖47顯示了p27kipl的免疫熒光染色結(jié)果。圖48顯示了體內(nèi)RhoA活性檢測結(jié)果。圖49顯示了DNA和肌動蛋白細胞骨架的免疫染色結(jié)果。圖50顯示了來自用PNGaseF和EndoH處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞的細胞溶解物的免疫印跡結(jié)果。圖51顯示了當(dāng)用TSAHC處理時TM4SF5-表達細胞和TM4SF5-無表達細胞的生長/增殖變化。圖52顯示了使用SNU449細胞的軟瓊脂測定結(jié)果。圖53顯示了SNU449Cp細胞和TSAHC誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生相比由SNU449Tp和SNU449T16m細胞誘導(dǎo)的腫瘤形成。圖54顯示了腫瘤組織的蘇木精和曙紅(H&E)染色和免疫組化染色結(jié)果。圖55顯示了用于p27kipl，pS10p27kipl和TM4SF5的TM4SF5-誘導(dǎo)腫瘤組織的免疫印跡結(jié)果。圖56顯示了在用TSAHC腹膜內(nèi)注射時動物的腫瘤體積和體重。圖57是顯示由于TM4SF5而導(dǎo)致細胞生長的接觸抑制喪失的示意性圖示。圖58顯示了在SNU449Cp和SNU449Tp細胞中生長到會合形成的敞口的封閉程度，其中細胞在光學(xué)顯微鏡下被觀察。圖59顯示了SNU449Cp和Tp細胞的轉(zhuǎn)移程度，所述細胞用結(jié)晶紫染色然后在光學(xué)顯微鏡下觀察，并在染料溶解后在260nm下測定光吸收。圖60顯示了侵入膠原凝膠基質(zhì)中的SNU449Tp，其中細胞在光學(xué)顯微鏡下被觀察。圖61顯示了侵入Matrigel中的SNU449Tp，其中細胞在光學(xué)顯微鏡下被觀察，以及侵入細胞的數(shù)目。圖62顯示了用于SNU449Tp，T3,T7和T16細胞中MMPs活性的白明膠酶譜，以及用于MMP-9和a-微管蛋白的表達水平的免疫印跡結(jié)果。圖63顯示了SNU449P細胞中MMP-2和MMP-9基因的啟動子轉(zhuǎn)錄活性，所述細胞用MMP-2熒光素酶或MMP-9熒光素酶與pcDNA3.1-MycHis-TM4SF5—起轉(zhuǎn)染。圖64顯示了經(jīng)尾部靜脈內(nèi)注射了TM4SF5表達細胞的鼠肺部組織中形成的腫瘤塊，以及H&E染色的結(jié)果，顯示腫瘤轉(zhuǎn)移。圖65顯示了當(dāng)SNU449Cp和SNU449Tp細胞用或者沒有用TSAHC進行處理時轉(zhuǎn)移的細胞的染色和細胞數(shù)的結(jié)果。圖66顯示了用TSAHC進行處理或沒有用其進行處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞侵入膠原凝膠中。圖67顯示了用TSAHC進行處理或沒有用其進行處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞侵入Matrigel中。圖68顯示了用TSAHC進行處理或沒有用其進行處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞中MMP-2和MMP-2的活性的酶譜結(jié)果。圖69顯示了用所指示的化合物處理的SNU449Cp和SNU449Tp細胞的形態(tài)變化。具體實施方式及優(yōu)選實施例在一個方面，本發(fā)明涉及基于由作為腫瘤誘導(dǎo)物的跨膜4L6家族成員5(TM4SF5)的表達誘導(dǎo)的各種細胞生物學(xué)和生物化學(xué)事件篩選抗癌化合物的方法。由序列號2表示多肽形成的腫瘤相關(guān)蛋白TM4SF5是與腫瘤相關(guān)抗原L6同源的蛋白質(zhì)，所述多肽由序列號1表示的多核苷酸表達產(chǎn)生。TM4SF5是疏水蛋白，其含有四個跨膜區(qū)、兩個細胞外環(huán)和細胞質(zhì)N末端和C末端。TM4SF5在許多類型的腫瘤中高表達，包括胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和肝癌。已知跨膜4超家族(TM4SF)蛋白質(zhì)形成具有細胞粘連分子諸如整合蛋白、增殖和轉(zhuǎn)移的大量四旋蛋白(tetraspanin)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。包括上皮單層的上皮組織通過相鄰細胞之間的細胞-細胞接觸形成，其由細胞粘連相關(guān)分子諸如E-鈣粘蛋白之間的強相互作用介導(dǎo)，或者通過細胞表面整合蛋白受體與細胞間基質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用介導(dǎo)，從而導(dǎo)致對基底上皮細胞表面的強力連接。當(dāng)破裂時，強力連接的組織單層喪失其作為上皮細胞的功能，允許腫瘤細胞從基本腫瘤釋放。整合蛋白是細胞粘連受體家族成員。當(dāng)細胞粘連被整合蛋白與細胞外基質(zhì)介導(dǎo)時，多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子被活化以執(zhí)行它們的功能，并且整合蛋白在調(diào)節(jié)肌動蛋白絲重組中可起到關(guān)鍵作用。在整合蛋白介導(dǎo)的細胞粘連中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包括粘著斑激酶(FAK)和Rho-GTPase活化蛋白質(zhì)(RhoA-GTPase)。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TM4SF5與肝癌上皮細胞(SNU449,KCLBNo.00449)中整合蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)染密切相關(guān)，并且這種關(guān)聯(lián)通過下列觀察被估計(1)TM4SF5表達不增加pY397FAK但增加pY577FAK;(2)Y577FFAK突變通過TM4SF5抑制FAK和RhoGAP之間的結(jié)合；(3)TM4SF5表達經(jīng)它們之間的相互作用通過促進FAK與pl卯RhoGAP或者FAK與GRAF的結(jié)合而抑制RhoA的活性；和(4)與上述機制不同，TM4SF5的表達增強了細胞液p27k^的表達和穩(wěn)定性，導(dǎo)致RhoA活性的下調(diào)(down-regulation)。也就是說，本發(fā)明的發(fā)明人基于上面的結(jié)果進行了深入全面的研究。該研究導(dǎo)致在細胞水平對TM4SF5的功能理解以及TM4SF5致癌機理的生物化學(xué)和細胞生物學(xué)特征的描述。Rho家族蛋白的性質(zhì)GTP結(jié)合蛋白的Rho家族包括RhoA和Racl在細胞粘合和分開中涉及。蛋白質(zhì)以兩種相互轉(zhuǎn)化的形式存在GTP結(jié)合活性形式，在該形式中它們顯示它們的生理活性，和GDP結(jié)合無活性形式，在該形式中它們的功能被阻斷。Rho家族蛋白典型地具有低GTPase活性，并在粘著斑(FA)以及當(dāng)細胞粘著時整合蛋白組裝以及拆分中起關(guān)鍵作用。RhoAGTPase包括RhoA，Racl和Cdc42，RhoAGTPase通過肌動蛋白聚合在肌動蛋白重組中起重要作用，并通過它們的下游效應(yīng)器諸如LIMK，PAK1，MLCK,mDia和ROCK在肌球蛋白輕鏈磷酸化作用中起重要作用。對粘著斑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的補充依賴于粘著斑激酶(FAK)的活性。這是因為通過FAK的蛋白質(zhì)磷酸化作用暴露了用于其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點。也就是說，粘著斑形成增加了FAK缺乏(FAK-deficient)細胞。換言之，F(xiàn)AK的色氨酸磷酸化作用促進了FA形成。而且，F(xiàn)AK在細胞運動中涉及。FAK過表達增強了細胞的運動性和侵入性。這種FAK活性與RhoA密切相關(guān)。在FAK缺乏細胞中RhoA活性增強。這是因為FAK磷酸化作用引起Rho-GTPase活化蛋白(RhoGAP)和與FAK有關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)子(GRAF)(與FAK的C末端區(qū)域結(jié)合)剌激RhoGAP以抑制RhoA活性。但是，Rho家族蛋白的Racl對RhoA起反作用。Racl活化減少了粘著斑形成并增加了細胞的運動性。中斷細胞轉(zhuǎn)移的粘著斑去組裝通過誘導(dǎo)粘著斑分裂的生長因子促進細胞轉(zhuǎn)移。通過TM4SF5表達的FAK的磷酸化和RhoA活性的降低本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TM4SF5的表達不僅增加pY397FAK而且還增加pY577FAK，并通過蛋白質(zhì)之間的相互作用促進FAK與pl90RhoGAP或者FAK與GRAF的結(jié)合。pY-"FAK意味著在577位置處FAK的色氨酸(trrosine)磷酸化作用。因此，根據(jù)TM4SF5的表達的pY"FAK增加代表了FAK磷酸化作用的增加，剌激RhoGAP誘導(dǎo)RhoGAP與FAK或者GRAF與FAK的結(jié)合，導(dǎo)致RhoA活性的降低。在這種情況下，Racl活性增加。圖8是與RhoGAP有關(guān)的FAK-RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TM4SF5-表達細胞中當(dāng)FAK在Tyr577(pY^FAK)上被磷酸化并且c-Src在Tyr416(pY"、Src)上被磷酸化時，Racl活性在兩種情況下都增加，而RhoA活性在兩種情況下都降低(圖3和圖5)。當(dāng)TM4SF5表達使用針對TM4SF5的siRNA抑制時通過TM4SF5的pY577FAK的增加和RhoA活性的抑制被逆轉(zhuǎn)(圖4和圖6)。此外，與不表達TM4SF5的親本細胞相比，TM4SF5表達細胞中在FAK與pl90RhoGAP或者FAK與GRAF之間觀察到強結(jié)合(圖9)。當(dāng)FAK的Tyr577殘基被苯丙氨酸取代以表達突變蛋白質(zhì)時，TM4SF5介導(dǎo)的FAK與pl90RhoGAP或者FAK與GRAF的結(jié)合被降低(圖10)。這些結(jié)果表明在TM4SF5表達細胞中pY577FAK在FAK-RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，并且pyS"FAK的降低、FAK與RhoGAP或者FAK與GRAF的結(jié)合抑制、Racl活性的降低或者RhoA活性的增加抑制了腫瘤基因蛋白TM4SF5的表達。通過TM4SF5表達的細胞質(zhì)p27kipl聚集和RhoA活性的降低本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)p27kipi蛋白質(zhì)在TM4SF5表達細胞中以非常高的濃度存在，這是由于p27k^mRNA和p27k^蛋白質(zhì)在細胞液中的高度穩(wěn)定性(圖12)。相反，在TM4SF5-不表達細胞中，觀察到少量p27kiP1，并且絕大多數(shù)在細胞核中(圖13)。作為細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑的p27k^蛋白質(zhì)在細胞核中具有腫瘤抑制功能是己知的。在G0-G1轉(zhuǎn)變過程中位點10處絲氨酸殘基的磷酸化作用刺激p27kipi轉(zhuǎn)移到細胞液中。SerlO上p27kipl的磷酸化分別通過與stathmin(KIS)和PKB/Akt相互作用的激酶或者通過體內(nèi)靜止細胞中的Mirk/dyrklB和Erkl/2介導(dǎo)。SerlO上的磷酸化作用而不是Thrl87或Thrl57上的磷酸化作用明顯與TM4SF5表達有關(guān)，并有助于P27kipl的細胞液轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定。pT157p27kipl和pT187p27kipl與TM4SF5介導(dǎo)的事件不相關(guān)。在表達TM4SF5的肝癌細胞中當(dāng)TM4SF5的表達使用shRNAs或者類似物抑制時，p27kipl的表達和SerlO的磷酸化作用減少，并且細胞液p27k^也減少(圖19和圖20)。這些結(jié)果與近來報道的在p27kiplS10A突變體中p27kipl的細胞液轉(zhuǎn)移被癌基因Ras蛋白抑制的結(jié)果一致。根據(jù)近來的報道細胞液p27kipl己經(jīng)顯示了通過直接結(jié)合而抑制GTP交換因子(GEF)與RhoA的結(jié)合來降低RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。為了識別細胞液p27k^積累和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系，當(dāng)RhoGTPase被活化時檢查了P27kipl的細胞內(nèi)位置。當(dāng)RhoA或其下游媒介mDia被活化時，或者細胞用RhoA活化劑LPA處理時，細胞液p27kiP1表達水平下降(圖27)。這是因為當(dāng)RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被活化時，p27k^蛋白不再穩(wěn)定，并且不再被定位到細胞液中，而是被定位到細胞核中。也就是說，細胞液p27kipl與RhoGTPase之間的存在調(diào)節(jié)聯(lián)系。因此TM4SF5的表達增強了p27"P1的表達和在細胞液中的穩(wěn)定性，導(dǎo)致RhoA活性的下調(diào)。但是，通過TM4SF5介導(dǎo)的p27k^積累的RhoA活性的抑制和通過TM4SF5介導(dǎo)的FAK與RhoGAPs之間的結(jié)合的RhoA活性的抑制由不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起。這通過Y577FFAK突變體(Tyr577被苯丙氨酸取代)的過表達不影響P27kipl的表達和SerlO的磷酸化作用而得到支持(圖18)。與RhoA活性抑制不同，p27一的細胞液積累活化Racl。換言之，活化的Racl及其下游媒介PAK1的表達導(dǎo)致p27kipl的細胞液積累(下一格，圖27)。通過TM4SF5介導(dǎo)的RhoA活性的下調(diào)的細胞形態(tài)變化在不表達TM4SF5的親本肝癌細胞中(SUN449)，肌動蛋白保持多邊形細胞形態(tài)，變得扁平以形成顯微結(jié)構(gòu)。在TM4SF5-表達的SNU449Tp細胞中，沿著細長桿狀細胞形狀形成異常肌動蛋白束(圖2)。在形態(tài)變化中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由Racl和RhoA活性介導(dǎo)。在TM4SF5表達細胞中，Racl活性升高，而RhoA活性降低。當(dāng)TM4SF5表達使用針對TM4SF5的siRNA抑制時這正好反過來。也就是說，引入了siRNA的細胞作為親本細胞恢復(fù)成與具有高度纖維化肌動蛋白結(jié)構(gòu)，而沒有用siRNA處理的細胞保持含有由TM4SF5表達形成的有異常肌動蛋白束的形狀(圖7)。此外，由于p271^1在TM4SF5-表達細胞中高表達，p27k^蛋白質(zhì)表達水平的變化也影響細胞形態(tài)。當(dāng)p27k^在不表達TM4SF5的親本細胞中過表達時，細胞變得細長(圖22)。相反，當(dāng)TM4SF5-表達細胞用抑制p27kipl的表達或者絲氨酸上的磷酸化作用的p27kiplS10A突變體處理時，它們發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，變成與親本細胞的形態(tài)相同的多邊形(圖23)。與細胞液P27kipl介導(dǎo)的形態(tài)變化和Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系有關(guān)，當(dāng)RhoGTPase在TM4SF5-表達細胞中被活化時(通過RhoA活化，mDia活化或者LPA處理)，RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化不再導(dǎo)致p27k^的穩(wěn)定，轉(zhuǎn)而誘導(dǎo)p27k^在細胞核中定位，導(dǎo)致細胞液p27kiP1表達水平的降低，導(dǎo)致形態(tài)變成與親本細胞的形態(tài)相同的多邊形形狀。相反，Racl的活化及其下游媒介PAK1的表達將不表達TM4SF5的親本細胞的形態(tài)變成細長桿狀，并引起p27k^的細胞液積累(圖27)。總的說來，在p27k^與RhoGTPase之間存在調(diào)節(jié)聯(lián)系，通過細胞液p27kipl的RhoGTPase活性調(diào)節(jié)誘導(dǎo)TM4SF5-表達細胞的形態(tài)變化。形態(tài)變化與下面描述的事件有關(guān)。根據(jù)TM4SF5表達的EMT和細胞-細胞接觸(l)上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)的細胞-細胞接觸的降低和誘導(dǎo)本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過TM4SF5表達的細胞液p27kipl積累誘導(dǎo)了細胞-細胞接觸的喪失并促進EMT。當(dāng)細胞間粘著時RhoA蛋白的活性基于細胞類型和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件而變化。前述通過TM4SF5-介導(dǎo)的p27ki"積累的RhoA蛋白活性抑制帶來了細胞內(nèi)肌動蛋白骨架的變化，該肌動蛋白骨架與由鈣粘蛋白/連環(huán)蛋白(cadherin/catenin)復(fù)合物介導(dǎo)的細胞-細胞接觸相關(guān)。不表達TM4SF5的親本細胞表達高水平的細胞粘著分子，包括E-鈣粘蛋白、ZO-l和橋粒斑蛋白(desmoplakin)，它們很好地布置在細胞粘著部位。相反，TM4SF5-表達細胞表達低水平的細胞粘著分子，并顯示不規(guī)則表達模式，因為細胞內(nèi)粘著沒有很好地被建立(圖29)。同時，螺旋(snail,抑制E-鈣粘蛋白表達的轉(zhuǎn)錄因子)的表達降低。因此，E-牽丐粘蛋白表達的降低不依賴于螺旋，但依賴于TM4SF5(圖29)。相反，TM4SF5-表達細胞表達高水平a-SMA和波形蛋白，它們在上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)中涉及。EMT在生理過程中諸如細胞形狀確定和傷口愈合中起重要作用，并在慢性炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移中涉及。通過TM4SF5-介導(dǎo)的p27kipl積累的RhoA活性抑制導(dǎo)致細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成細長形狀，因為Rh0A失活誘導(dǎo)肌動蛋白絲的重組異常。這種形態(tài)變化促進了EMT，使細胞-細胞粘著中斷。TM4SF5-介導(dǎo)的a-SMA表達和EMT—起通過RhoA活性的抑制被誘導(dǎo)，并導(dǎo)致細胞長度的形態(tài)變化。因此，TM4SF5-表達細胞中p27kipl表達的抑制抑制了EMT并保持細胞-細胞接觸。這是因為P27kipl的表達抑制導(dǎo)致p27k^在細胞核中而不是在細胞液中積累，驅(qū)動細胞形態(tài)從細長形狀轉(zhuǎn)變成與親本細胞形狀相同的多邊形形狀。細胞內(nèi)定位的控制，即p27k^蛋白的細胞核和細胞液定位有助于細胞形狀和細胞-細胞粘著形成。另外，當(dāng)表達內(nèi)源TM4SF5的Huh7肝癌細胞中TM4SF5的表達使用針對TM4SF5的shRNA抑制時，HGF4秀導(dǎo)的細胞-細胞解耦聯(lián)被抑制。因此，TM4SF5被認為經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)EMT。(2)接觸抑制的喪失本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在TM4SF5-表達細胞中通過TM4SF5-誘導(dǎo)的EMT的接觸介導(dǎo)的生長抑制的喪失，其中當(dāng)細胞間高密度接觸時細胞不能識別相鄰細胞，因此繼續(xù)分裂并增殖。生長的接觸抑制意味著當(dāng)它們接觸相鄰細胞時細胞停止分裂，導(dǎo)致生長停止。E-鈣粘蛋白誘導(dǎo)的細胞-細胞接觸抑制細胞增殖和腫瘤發(fā)生是己知的。近來的報道揭示了在接觸抑制過程中，細胞顯示降低的擴散并隨后停止生長。因此，如果細胞不通過EMT過程或者類似過程彼此接觸，它們不能識別其他相鄰細胞，因此繼續(xù)分裂，從而導(dǎo)致接觸抑制的喪失。由于它們的多邊形形狀，在以飽和曲線增殖過程中當(dāng)接觸抑制時不表達TM4SF5的親本細胞不能進一步生長。相反，TM4SF5表達的細長細胞喪失細胞間接觸并且繼續(xù)分裂，甚至在高到細胞核重疊的密度下也是如此(圖33)。此外，TM4SF5表達細胞在S-期與親本細胞相比顯示更高比例的細胞數(shù)(圖35)。使用shRNA的TM4SF5表達抑制降低了S-期細胞數(shù)(圖36)。也就是說，由TM4SF5介導(dǎo)的降低的細胞間接觸和EMT誘導(dǎo)導(dǎo)致細胞生長的接觸抑制喪失。圖57示意性地示出了該過程。如圖57所示，被認為是癌基因的TM4SF5的過表達增強了與SerlO上被hKIS或者PKB/Akt磷酸化有關(guān)的p27kipl表達和穩(wěn)定性，并促進了pY577FAK與FAK/RhoGAPs之間的結(jié)合，導(dǎo)致RhoA活性降低。Racl活性與RhoA失活相反。mDia和PAK起到RhoA和Racl下游的作用，調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)和細胞收縮，導(dǎo)致形態(tài)學(xué)變化。這種形態(tài)學(xué)變化誘導(dǎo)了細胞間粘著的喪失，引起細胞不能識別相鄰細胞并繼續(xù)生長，從而導(dǎo)致接觸抑制的喪失。TM4SF5-介導(dǎo)的細胞遷移、侵入和轉(zhuǎn)移如上所述，與TM4SF5表達或者Racl活化有關(guān)的FAK過表達增加了細胞的運動性。由Rho活性和EMT控制的上皮細胞遷移在生理過程諸如細胞形狀確定和傷口愈合中起重要作用，對于慢性炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移來說是必須的。因此，TM4SF5表達細胞比TM4SF5-不表達細胞具有更高的運動性(圖58和59)。遷移細胞從粘著位點解耦聯(lián)并侵入周圍的胞外基質(zhì)(ECM)。TM4SF5表達細胞比TM4SF5-不表達細胞更有效地侵入膠原凝膠中，形成密集的細胞外網(wǎng)絡(luò)(圖60)，并有效地侵入作為胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel(圖61)中。侵入到ECM中的細胞通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)經(jīng)ECM成分降解被部分分解。MMPs是能夠降解細胞底物的Zr^+依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族。在這些家族成員中，降解白明膠和粘連蛋白底物的MMP-2和MMP-9在TM4SF5-表達細胞中具有高活性(SNU449Tp,T3,T7,T16等)(圖62)。特別是，處理高酶活性外，MMP-9顯示了高基因表達(中間格，圖62)。如在實施例11中描述的那樣，基于TM4SF5-表達癌細胞中顯示的細胞運動性和侵入性，采用用于腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的裸鼠模型在體內(nèi)被觀察。由于TM4SF5作為腫瘤誘導(dǎo)劑引起連續(xù)的細胞分裂而在體外在細胞中以及在體內(nèi)在動物模型中沒有適當(dāng)生長控制，TM4SF5在肝癌細胞中或者其他類型的癌細胞中的表達誘導(dǎo)了粘著斑激酶(FAK)磷酸化和細胞液p27k^積累的增加，導(dǎo)致RhoA活性的抑制，細胞繼續(xù)生長，加速了進入S期，形態(tài)變化以及粘著不依賴性生長。當(dāng)TM4SF5表達細胞系被注射到裸鼠(體內(nèi))中時，腫瘤形成。在這一點上，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了基于由作為腫瘤誘導(dǎo)劑的TM4SF5表達誘導(dǎo)的分裂細胞生物學(xué)和生物化學(xué)事件篩選抗腫瘤化合物的方法。在本文中，術(shù)語"抗腫瘤劑"指的是抑制或防止腫瘤生長。抑制或防止腫瘤生長的概念包括與不治療相比當(dāng)用抗腫瘤物質(zhì)治療時降低腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。術(shù)語"腫瘤轉(zhuǎn)移"指的是腫瘤(癌)細胞通過該過程從初始位點擴散到其他身體部位的過程。上述術(shù)語還包括經(jīng)過轉(zhuǎn)移過程形成的腫瘤。本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)表達由序列號2表示的多肽的癌細胞。編碼多肽的代表性多核苷酸為由序列號1表示的多核苷酸。表達序列號2的多肽的腫瘤細胞是表達TM4SF5的細胞系。在一種實施方式中，本發(fā)明的方法可通過建立在上皮細胞中穩(wěn)定地表達TM4SF5的SNU449肝癌細胞系(KCLBNo.00449)來實踐，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細胞系。與所述SNU449不同，SNU398細胞(KCLBNo.00398)也可使用。表達由序列號1表示的核苷酸的多肽的腫瘤細胞的例子包括胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、腦瘤或者肺癌細胞，或者人工建立的癌細胞，但表達腫瘤基因TM4SF5蛋白的任何細胞都可使用。人工建立的癌細胞通過表達腫瘤基因TM4SF5蛋白的細胞作為例子，其使用克隆技術(shù)包括基因操作來建立。本發(fā)明的方法隨后包括使用抗腫瘤候選物處理培養(yǎng)的腫瘤細胞。優(yōu)選地，用預(yù)測能控制由TM4SF5專門誘導(dǎo)的事件的化合物對細胞進行處理。最后，本發(fā)明的方法包括確定與當(dāng)沒有用抗癌候選物進行處理時相比當(dāng)其顯示至少一種下面描述的抗癌功能時的抗癌候選物作為抗癌物質(zhì)?？拱┪镔|(zhì)的抗癌功能基于與TM4SF5表達有關(guān)的前述不同細胞生物學(xué)和生物化學(xué)事件來定義，如下(i)Tyr577上FAK的降低的磷酸化作用；(ii)FAK對RhoGAP或者FAK對GRAF結(jié)合的抑制；(iii)降低的細胞液p27K^表達及穩(wěn)定性；(iv)增加的RhoA活性；以及(v)降低的Racl活性。在該方法中，基于與細胞形態(tài)學(xué)有關(guān)的前述特征和根據(jù)TM4SF5表達的細胞接觸模式，當(dāng)其顯示下列額外的抗癌功能的至少一種時，抗癌候選物被確定為抗癌物質(zhì)-(vi)細胞形態(tài)從桿狀變成多邊形；(Vii)在細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達降低；(Viii)細胞接觸的保持；(ix)細胞生長的接觸抑制；(x)a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)或者波形蛋白(vimentin)表達下降，或者E-鈣粘蛋白的表達增加；和(xi)上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)減少。在(vii)中的細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)選自下組，包括E-鈣粘蛋白、閉合帶-1(zonulaoccludens-l，ZOl),連環(huán)蛋白和橋粒斑蛋白。(ix)中細胞生長的接觸抑制表示細胞數(shù)目的減少，S-期細胞數(shù)的減少或者多層生長的抑制。也就是說，接觸抑制意味著細胞在單層中生長并且當(dāng)多層增殖被抑制且細胞接觸發(fā)生時停止增殖。而且，細胞數(shù)的減少或者S-期細胞數(shù)量的減少通過TM4SF5的N-連接糖基化的失活以及與其相互作用的膜蛋白介導(dǎo)。此外，基于與TM4SF5介導(dǎo)的增加的細胞運動性和侵入有關(guān)的前述特征，當(dāng)其顯示下列額外抗癌功能的至少一種時抗癌候選物被確定為抗癌物質(zhì)(Xii)在胞外基質(zhì)或者血清存在下細胞遷移或者運動性的降低；(Xiii)侵入到包括包外基質(zhì)的膠原凝膠中的抑制；(xiv)侵入到作為胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel中的抑制；和(xv)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的降低。其中優(yōu)選的MMPs為MMP-2或者MMP-9。換言之，作為腫瘤誘導(dǎo)物或者EMT誘導(dǎo)物的TM4SF5的表達抑制通過常規(guī)事件來確定，包括FAK磷酸化作用的抑制或者活性變化；根據(jù)細胞液p27Kipl表達和積累的Rho活性降低的抑制；根據(jù)包括Racl和RhoA的RhoGTPase活性變化的細胞形態(tài)變化的抑審U;分化、上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)或者分化轉(zhuǎn)移降低的抑制；S-期進程的抑制；由接觸抑制喪失誘導(dǎo)的多層生長或者增殖；粘著非依賴性增殖或者在軟瓊脂中增殖的抑制；細胞遷移或侵入的抑制；以及當(dāng)將癌基因表達細胞注射到裸鼠中時腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的抑制。在另一方面，本發(fā)明涉及使用所述方法篩選的用于針對TM4SF5的抗癌作用的抗癌化合物?？拱┗衔镝槍M4SF5的作用與上面描述的那些相同。優(yōu)選地，抗癌物質(zhì)為由化學(xué)式1或2表示的査耳酮化合物。化學(xué)式1其中，Rt表示R4SCV;R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(C廣Cs)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(CVCH))芳基，包括氫，鹵素,氮和(CVC5)烷基，優(yōu)選為甲基、苯基、p-甲苯甲酰基、p-硝基苯基或者p-氟苯基?；瘜W(xué)式2其中，R,表示R4SO"R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(CrC5)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(C6-CuO芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(CVC5)烷基，優(yōu)選為甲基、苯基、p-甲苯甲?；-硝基苯基或者p-氟苯基。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗癌物質(zhì)為下表1中列出的査耳酮化合物。代表性的抗癌化合物為TSAHC[4'-(p-甲苯磺酰胺基)-4-羥基査耳酮]，見表1的描述。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表1中描述的査耳酮化合物1到97具有下述特征:4'-(p-甲苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；3'-(P-甲苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；2'《p-甲苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮;4'-(p-氟苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(o-氟苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-硝基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(o-硝基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(p-氨基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(o-氨基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(甲磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(p-氟苯基磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(m-氟苯基磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(p-硝基苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(p-氨基苯磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(苯磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(甲磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；3'-(p-甲苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；2'-(p-甲苯磺酰胺)-3，4-二羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基查耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-3，4-二羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2，4-二羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基査耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，4-二羥基査耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，4-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，5-二羥基査耳酮；4'-(p-氟苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(o-氟苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-硝基苯磺酰胺)-3，4-二羥基査耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(o-硝基苯磺酰胺)-3，4-二羥基査耳酮；4'-(p-氨基苯磺酰胺)-3，4-二羥基査耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(o-氨基苯磺酰胺)-3，4-二羥基査耳酮；4'-(苯磺酰胺)-3,4-di羥基査耳酮；4'-(甲磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(p-甲苯基苯磺酰胺)-2-氯-4-羥基査耳酮;4'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；374'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；和4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，5-二羥基査耳酮。韓國專利公開號10-2003-0036993公開了查耳酮化合物具有對降解基底膜成分的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制活性。但是，該專利公開文本沒有提出査耳酮化合物的抗癌作用。另外，本發(fā)明的特征在于由化學(xué)式1或2表示的査耳酮化合物含有磺基(S(V)或者磺胺基(S02Nir)。也就是說，本發(fā)明的查耳酮化合物對于TM4SF5的抗癌活性(作用)以磺基(S03—)為基礎(chǔ)。特別是，在實施例12中，當(dāng)査耳酮化合物具有OH、NH2或者OCH3作為A-環(huán)(左環(huán))上的取代基時，該化合物不顯示抑制TM4SF5-介導(dǎo)的多層生長的抗癌活性。相反，當(dāng)磺基被引入到根據(jù)本發(fā)明的查耳酮化合物中時，磺胺基或者磺基査耳酮化合物顯示出抗癌活性，從而抑制TM4SF5的作用。也就是說，磺基引入到査耳酮化合物中賦予了獨特的抗癌活性，這與已知的查耳酮衍生物的活性是不同的。在本實施例中評估了代表性化合物TSAHC[4'-(p-甲苯磺胺基)-4-羥基査耳酮](化合物l，表l)的抗癌作用。根據(jù)本發(fā)明的查耳酮化合物起到專一性抑制TM4SF5介導(dǎo)的事件的拮抗劑作用。使用一種或多種選自包括TSAHC的査耳酮化合物處理TM4SF5表達細胞以依賴于查耳酮化合物濃度(圖43的右側(cè)圖表)的方38式降低長期連續(xù)生長，抑制進入S期(圖44)并恢復(fù)了細胞-細胞接觸(圖45)。相反，根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物的抗癌作用在TM4SF5-不表達細胞中沒有顯示(圖43的左側(cè)圖表)。此外，根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物有效地降低了TM4SF5-誘導(dǎo)的p27kipl,pS1Qp27kipl和pY577FAK表達以及a-SMA或者波形蛋白的表達(圖45)。當(dāng)TM4SF5-表達的SNU449細胞系SNU449Tp使用根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物處理時，細胞液p27kiP1不再穩(wěn)定，導(dǎo)致其細胞液水平下降(圖47)。根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物，特別是TSAHC影響TM4SF5以及與其相互作用的膜蛋白的N-連接的糖基化活性，從而阻礙或者抑制TM4SF5與其他蛋白質(zhì)包括膜中的整合蛋白或者四旋蛋白-網(wǎng)的結(jié)合以執(zhí)行其腫瘤發(fā)生功能。本發(fā)明的化合物的這種效果通過當(dāng)TSAHC處理時對FNGaseF的N-連接的糖基化區(qū)域的靈敏性增加而被觀察到(圖50)。因此，本發(fā)明的查耳酮化合物包括TSAHC被認為與TM4SF5本身連接以修改N-連接糖基化結(jié)構(gòu)并影響TM4SF5與其他蛋白質(zhì)(在四旋蛋白-網(wǎng)中)的關(guān)系，從而抑制TM4SF5的致癌作用。此外，在TM4SF5表達細胞中，本發(fā)明的查耳酮化合物對TM4SF5對RhoA的抑制效應(yīng)起反作用，并將細長細胞形狀恢復(fù)成多邊形形狀(圖49)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的査耳酮化合物抑制TM4SF5介導(dǎo)的事件，從而表明作為TM4SF5拮抗劑起作用的本發(fā)明的査耳酮化合物具有作為TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的治療藥物的潛能。TM4SF5介導(dǎo)的細胞遷移和侵入通過本發(fā)明的査耳酮化合物例如TSAHC也被有效抑制。當(dāng)用TSAHC處理TM4SF5表達細胞時，細胞遷移(圖65)，進入到膠原凝膠(圖66)中以及侵入到Matrigel(圖67)中都被有效抑制。這些結(jié)果表明本發(fā)明的査耳酮化合物抑制在細胞遷移中涉及(圖68)的MMP的酶活性，并且TSAHC能夠有效抑制TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移以及腫瘤誘導(dǎo)。在又一方面，本發(fā)明涉及包括至少一種査耳酮化合物優(yōu)選包括在表1中描述的化合物作為有效成分的抗癌組合物。實施例8顯示了即便當(dāng)用表l中的化合物的一種(TSAHC)處理也顯示出抗腫瘤活性。根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物可以査耳酮衍生物的形式被使用，該衍生物為藥物學(xué)上可接受的鹽的形式。在本發(fā)明中有用的鹽為與藥物學(xué)上可接受的游離酸形成的酸加成鹽。也就是說，査耳酮衍生物可以是藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽的形式,其使用本領(lǐng)域的常用方法形成。游離酸可以是無機酸或者有機酸。這樣的無機酸的例子包括鹽酸、溴酸、硫酸和磷酸。這樣的有機酸的例子包括檸檬酸、醋酸、乳酸、馬來酸、延胡索酸、葡萄糖酸、甲磺酸、琥珀酸、酒石酸、4-甲苯磺酸、雙羥萘酸(embonicacid)、谷氨酸和天冬氨酸。優(yōu)選的無機酸為鹽酸，優(yōu)選的有機酸為甲磺酸。除了其藥物學(xué)上可接受的鹽以外，根據(jù)本發(fā)明的查耳酮化合物可包括可使用常規(guī)方法制備的所有的鹽、水合物及其溶劑化物。對于臨床應(yīng)用來說，根據(jù)本發(fā)明的査耳酮化合物及其鹽可單獨給藥，但典型地與賦形劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑(disintegrator)、涂層劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、穩(wěn)定劑、吸收刺激劑和/或軟膏基質(zhì)混合，以適于專門用途或所需目的的適當(dāng)制劑的藥物混合物的形式給藥?；旌衔锉挥糜谧⑸浠蛘呖诜⒅蹦c或局部應(yīng)用。更詳細地，如上所述，包括査耳酮化合物或其鹽的藥物學(xué)抗癌組合物可經(jīng)口給藥，例如以藥片、糖衣藥片、糖衣丸劑、硬或者軟白明膠膠囊、溶液、乳液或者懸浮液的形式給藥。而且，組合物還可經(jīng)直腸給藥，例如以栓劑的形式；局部或者經(jīng)皮給藥，例如以軟膏、油膏、凝膠或者溶液的形式；或者胃腸外給藥，例如以注射液的形式給藥。40對于片劑、糖衣片劑、糖衣丸劑或者硬或者軟白明膠膠囊而言，本發(fā)明的查耳酮化合物可與藥物學(xué)上的惰性無機或者有機賦形劑(藥物學(xué)上可接受的載體)混合。用于片劑、糖衣片劑、糖衣丸劑或者硬或者軟白明膠膠囊的例子包括乳糖、玉米淀粉或者其衍生物、滑石粉以及硬脂酸或其鹽。用于軟白明膠膠囊的合適載體例如是菜油、蜂蠟、脂肪、半固體和液體多羥基化合物以及類似物。但是，基于活性成分的性質(zhì)的不同，在軟白明膠膠囊中常常不需要賦形劑。用于溶液和糖漿制劑的合適賦形劑的例子例如是水、多羥基化合物、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖以及類似物。用于注射液的合適賦形劑例如是水、酒精、多羥基化合物、甘油。菜油以及類似物。用于栓劑和局部或者經(jīng)皮給藥的合適賦形劑例如是天然或者硬化的油、蜂蠟、脂肪、半固體或者液體多羥基化合物以及類似物。藥物組合物還可包括防腐劑、溶解劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯臭劑、用于控制滲透壓的鹽、緩沖液、涂層劑或者抗氧化劑。它們還可含有其他治療上有用的藥物。因此，用于口服給藥的藥物制劑可以是顆粒、藥片、糖衣藥片、膠囊、藥丸、懸浮液或者乳液。親本制劑例如可以靜脈內(nèi)給藥、肌肉給藥或者皮下給藥。對于每種胃腸外給藥來說，組合物可以含有其他物質(zhì)的滅菌水溶液的形式使用，例如含有鹽或者葡萄糖使溶液與血液等滲?？拱﹦┛梢运▌┬问浇o藥或者使用子宮托給藥，或者它們可以洗液、溶液、油膏、藥膏或者撲粉形式局部應(yīng)用?？诜蛘呶改c外給藥的日劑量可以是從5mg到2000mg范圍的本發(fā)明的査耳酮化合物，可以單劑量或者以一些等分劑量的形式給藥。但是，應(yīng)當(dāng)理解，實際劑量實施例此后，將進一步參照實施例對本發(fā)明進行詳細描述。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，這些實施例僅僅用于說明的目的，而不解釋成限制本發(fā)明的范圍。特別是，下列實施例僅僅采用肝癌細胞，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，各種類型的來自人來的癌組織和癌細胞系包括胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、腦瘤、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、膀胱和肺癌細胞都可利用。實施例1:TM4SF5-表達癌細胞的培養(yǎng)(1)細胞系的建立為了建立永久并穩(wěn)定表達TM4SF5的細胞系(GenBankNo.NM-003963)，用含有對照載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX(ClontechLaboratoriesInc.,PaloAlto，CA)和攜帶TM4SF5的逆轉(zhuǎn)錄載體pLNCX感染人肝癌SNU449細胞(KCLBNo.00449)。TM4SF5表達逆轉(zhuǎn)錄病毒按照如下方法制備。使用PCR擴增來自肝癌Huh7細胞(JCRBNo.0403)cDNA庫的TM4SF5，并將其插入到逆轉(zhuǎn)錄載體pLNCX(pLNCX-TM4SF5)的HindlII/Clal酶切位點。pLNCX-TM4SF5構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染到PT67包裝細胞中(ATCCCRL-12284)。選取并培養(yǎng)穩(wěn)定表達TM4SF5的細胞以產(chǎn)生表達TM4SF5的逆轉(zhuǎn)錄病毒(五x/en'me"to/Ce//312:2983,2006)。此后。含有對轉(zhuǎn)載體pLNCX的SNU449被標記為"SNU449Cp(或者Cp)"，表達TM4SF5的SNU449細胞被標記為"SNU449Tp(或者Tp)"。SNU449細胞用表達TM4SF5的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。形成的克隆作為庫(SNU449Cp和SNU449Tp)，并且分離單克隆(TM4SF5-表達的T3,T7，Tll和T16克隆)。為了制備其中TM4SF5表達被抑制的Huh7細胞，Huh7細胞用針對42TM4SF5的shRNA轉(zhuǎn)染以便僅僅選擇性分離具有G418的shTM4SF5表達細胞(500嗎/ml)。在37°C、5%C02下的培養(yǎng)箱中在單獨添加慶大霉素(0.25Hg/ml)或者慶大霉素加上G418(200嗎/ml)的含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選的克隆。(2)材料與方法①針對TM4SF5的抗體的制備TM4SF5的C-末端區(qū)域(用EcoRI消化的氨基酸229到594)被插入到pGEX-5X2載體(PharmaciaBiotech.)中，并且其序列被測定。含有0.3%SDS和蛋白酶抑制劑的PBS被用于得到IPTG誘導(dǎo)的來自DH5a細胞的重組蛋白。表達的蛋白質(zhì)被分離并在SDS凝膠上電泳。從凝膠中提取抗原并用其免疫老鼠。在總共免疫三次之后，從免疫的老鼠中收集血清并評估對于重組蛋白和動物細胞提取物的免疫反應(yīng)性。②蛋白質(zhì)分離和免疫印跡在不同條件下用PBS洗滌細胞之后，使用RIPA制備的在不同實驗條件下得到的細胞裂解物。在特定情況下，采用的細胞用于給定表達載體轉(zhuǎn)染或者使用表達shRNA的腺病毒轉(zhuǎn)染到TM4SF5或者表達siRNA的腺病毒轉(zhuǎn)染到p27kiP1。另外，使用以10pM環(huán)己酰亞胺處理給定的一段時間的細胞。對于所述細胞裂解物，對蛋白質(zhì)進行定量，并使用相等量的蛋白質(zhì)。使用對磷-Y577FAK,磷-Y"6Src,c-Src，RhoA,pl20etn,p-連環(huán)蛋白，pS10p27kipl,FAK,E-鈣粘蛋白，Z01,Racl，pl90RhoGAP，p27kipl，GRAF，hKIS，橋粒斑蛋白，a-微管蛋白，a-連環(huán)蛋白,以及a-平滑肌肌動蛋白Ox-SMA)的抗體進行免疫印跡。③免疫熒光染色為了對細胞內(nèi)蛋白進行免疫熒光染色，將細胞接種在涂敷有10%FBS/RPMI-1640的蓋玻片上并在37。C下培養(yǎng)一天，直到它們顯示它們的典型形態(tài)并穩(wěn)定連接在蓋玻片的表面上。當(dāng)細胞用給定特定基因轉(zhuǎn)染或者用各種病毒轉(zhuǎn)染時，它們在培養(yǎng)給定時間段之后被使用。用10mM溶血磷脂酸(LPA)處理的細胞在與蓋玻片連接一小時之后使用。通過制備用于熒光分析的與對目標蛋白質(zhì)的初級抗體溫育的玻片進行免疫熒光染色，洗去未結(jié)合的抗體分子，與熒光素結(jié)合的第二抗體溫育并洗去未結(jié)合的抗體分子，并且使用羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)對肌動蛋白絲進行染色。被使用的抗體包括針對E-鈣粘蛋白，(3-鈣粘蛋白，F(xiàn)LAG,4'-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，5-溴-2'-脫氧-尿嘧啶(BrdU),p27kipl，Z01(閉合帶-l)以及類似物的抗體。免疫熒光染色的蓋玻片設(shè)置在玻片上并在熒光顯微鏡或者激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。RT-PCR使用RT-PCR對p27kiplmRNA水平進行分析。在用放線菌素D處理之后的不同時間點將總RNA從TM4SF5-不表達細胞中分離并從TM4SF5-表達細胞中分離。然后，從分離的總RNA中純化mRNA。使用mRNA與對p27Kipl專一的引物進行RT-PCR。使用一對引物，正向引物5'-taacccgggacttggagaag-3'(序歹!j號3)以及反向弓|物5'-gcttcttgggcgtctgetc-3'(序列號4)。⑤通過分級分離制備P27kipl的細胞液和核蛋白碎片。P27kiPi的細胞液和細胞核表達水平在表達TM4SF5的SNU449Tp細胞和T16細胞中使用由Liang描述的分級分離方法(NatureMedicine,8:1153-1160，2002)和其他方法被檢査。軟瓊脂測定在含有10%FBS的培養(yǎng)基中的0.7M被注入到60-mm培養(yǎng)板中并允許固化。106個細胞與0.3%瓊脂在含有10%FBS的培養(yǎng)基中混合并在底部瓊脂上分層。培養(yǎng)板在37。C、5%C02下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天。每兩天用添加有200嗎/mlG418的含有10%FBS的培養(yǎng)基替換。觀察形成的細胞克隆并使用裝備有數(shù)碼相機的顯微鏡劃線。44⑦統(tǒng)計分析學(xué)生的"測驗被用作比較方法以確定數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差別。如果P值小于0.05，則組之間的差別被認為是統(tǒng)計學(xué)上有意義的。實施例2:TM4SF5-介導(dǎo)的PY577FAK表達和RhoA活性的抑制(1)TM4SF5表達細胞的形態(tài)學(xué)特征在實施例1中建立的不表達TM4SF5的親本SNU449細胞(SNU449p或p)、永久表達對照載體的SNU449Cp細胞和TM4SF5-表達克隆(SNU449Tp、T3、T7和T16)在光學(xué)顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察。而且，使用抗-TM4SF5抗體和抗-a-微管蛋白抗體進行免疫印跡。為了研究根據(jù)TM4SF5表達的細胞的各種肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)，對照細胞(SNU449Cp)和TM4SF5-表達細胞(SNU449Tp)在蓋玻片上生長并用與羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色。結(jié)果，與親本SNU449p細胞相比，T3、T7、T16和Tp克隆在形態(tài)上為細長形狀(圖1)。SNU449細胞中的肌動蛋白細胞骨架的熒光染色顯示細胞保持線形和具有高纖維肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的多邊形形狀。在TM4SF5-表達的SNU449Tp細胞中，沿著細長形狀的細胞形成異常肌動蛋白束(圖2)。(2)py5"FAK的效果為了研究在前述形態(tài)學(xué)變化中涉及的信號通路，在實施例1中建立的TM4SF5-表達細胞系(SNU449Tp、T3、T7和T16)在Tyr577處的FAK磷酸化(pY^FAK)和Tyr416處的c-Src磷酸化(pY"^Src)以及Racl活性和RhoA活性進行了評估。制備全部細胞裂解物并進行免疫印跡分析，該分析使用針對圖3和圖5中示出的蛋白質(zhì)的每種抗體進行。Racl活性和RhoA活性通過來自體外細胞溶解物的Racl和RhoA的下拉(pull-down)來監(jiān)測。另外，當(dāng)使用對TM4SF5的shRNA(shTM4SF5)抑制TM4SF5的表達時，檢査發(fā)生的變化。親本SNU449p細胞、SNU449Cp對照細胞和各種TM4SF5-表達細胞用針對綠色熒光蛋白(GFP)的shRNA(具有隨機核苷酸序列的拼接shRNA)和針對TM4SF5的shRNA轉(zhuǎn)染。收集細胞并進行免疫印跡和RhoA活性分析。結(jié)果，TM4SF5表達細胞顯示pY577FAK和pY416cSrc蛋白表達的增加和升高的Racl活性，但顯示了降低的RhoA活性(圖3和圖5)。當(dāng)TM4SF5表達被抑制時。由TM4SF5介導(dǎo)的pyS"FAK的水平增加和RhoA活性抑制相反(圖4和圖6)。而且，SNU449Tp細胞用pEGFP和shTM4SF5轉(zhuǎn)染。24小時后，將細胞放置到蓋玻片上并繼續(xù)培養(yǎng)24小時。使用用于肌動蛋白絲的羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽和用于DNA的DAPI進行熒光染色。引入了shTM4SF5的細胞恢復(fù)成與SNU449對照細胞相同的具有高纖維肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的多邊形形狀，而相鄰的不含shTM4SF5的細胞由于TM4SF5的表達而沒有發(fā)生形態(tài)變化(圖7)。(3)RhoA活性的抑制檢査了pY577FAK在通過RhoGAP蛋白質(zhì)的RhoA失活中的作用。將來自Cp和Tp的細胞溶解物用針對FAK的抗體進行免疫沉淀。免疫沉淀的混合物使用針對pl90RhoGAP,GRAF和FAK的抗體進行免疫印跡分析。而且，(HA)3-標記的FAK野生型和Y577FFAK突變型在SNU449Tp細胞中短暫過表達。兩天后，細胞溶解物被免疫沉淀并使用圖10中顯示的抗體進行免疫印跡。結(jié)果，TM4SF5-表達細胞顯示了比TM4SF5-不表達SNU449Cp細胞更強的FAK和pl90RhoGAP之間或者FAK和GRAF之間的結(jié)合(圖9)。當(dāng)其中577位的色氨酸殘基被苯丙氨酸取代的FAK突變體表達時TM4SF5-介導(dǎo)的FAK與pl卯RhoGAP的結(jié)合或者FAK與GRAF的結(jié)合降低(圖10)。這些結(jié)果表明，pY^FAK在一系列到TM4SF5-表達細胞中的RhoA的信號通路中起重要作用。另外，F(xiàn)LAG-標記的GRAF(與FAK相關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)子)在對照細胞中暫時過表達。24小時后，將細胞放置到上述蓋玻片上并培養(yǎng)一天。然后，使用抗-肌動蛋白和抗-FLAG抗體對細胞進行免疫熒光染色。GRAF或者pl卯RhoGAP的暫時表達改變了不表達TM4SF5的對照細胞的形態(tài)(圖11)。這些結(jié)果表明在SNU449細胞中表達的TM4SF5抑制了RhoA的活性，并且這通過FAK-pl卯RhoGAP或者FAK-GRAF相互作用被誘導(dǎo)。實施例3:TM4SF5-介導(dǎo)的細胞質(zhì)p27^聚集(l)根據(jù)TM4SF5表達的p27kipl表達增加為了確定TM4SF5是否通過p27kiPi抑制RhoA的活性，將SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞用針對p27kipl和DAPI的抗體進行免疫熒光染色。細胞的細胞核和細胞質(zhì)根據(jù)在實施例1-(2)的⑤中描述的方法進行分級分離，并使用抗-p27k^和抗-a-微管蛋白的抗體進行免疫印跡分析。結(jié)果，可以看到，在TM4SF5表達細胞中p27k^蛋白以顯著的高濃度定位在細胞質(zhì)中(圖12)。相反，在TM4SF5-不表達細胞中蛋白大多數(shù)以低濃度定位在細胞核中(圖13)。為了研究TM4SF5-介導(dǎo)的p27kipl表達水平與SerlO磷酸化之間的關(guān)系，從實施例1中建立的各種細胞系中制備細胞溶解物，并使用圖14中示出的抗體進行免疫印跡分析。發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)定位的p27k^通過SerlO的磷酸化作用通過人激酶與stathmin(hKIS)和活化PKB/Akt的相互作用被誘導(dǎo)(圖14)。從用放射菌素D(IOmg/ml,ActD)處理的細胞中提取總RNA，并使用RT-PCR分析p27k^和GAPDH的表達。而且，來自用環(huán)己酰亞胺(IOmM,CHX)處理的細胞的細胞溶解物使用針對p27kipl的抗體及逆行免疫印跡分析。帶濃度相對于對照被計算，并顯示如圖(圖16)。47發(fā)現(xiàn)在TM4SF5-表達細胞中顯著增加的p27kipl表達是由于p27kiplmRNA和蛋白質(zhì)的高穩(wěn)定性(圖15)。這進一步確認這樣的結(jié)果使用針對TM4SF5的siRNA抑制TM4SF5的表達恢復(fù)到與TM4SF5-不表達SNU449細胞的形態(tài)相同的形態(tài)，降低了細胞液中p27k^蛋白質(zhì)的水平，并且不誘導(dǎo)SerlO上的p27kiPt的磷酸化作用(圖17)。另外，TM4SF5有助于p27kiPi的細胞液穩(wěn)定性的假設(shè)也被發(fā)現(xiàn)在表達內(nèi)源TM4SF5的各種類型的肝癌細胞中有效。用針對GFP的shRNA、針對TM4SF5的拼接(Scr)shRNA和shRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)源表達TM4SF5的肝癌細胞系。48小時后，制備全部細胞溶解物和SNU449Cp以及SNU449Tp細胞的溶解物并使用圖18中示出的抗體進行免疫印跡分析。結(jié)果，觀察到內(nèi)源表達的TM4SF5的抑制，降低了p27k^的表達和SerlO上的磷酸化作用(圖18)。收集細胞并進行免疫印跡和RhoA活性分析。HA-標記的FAK野生型和Y577FFAK突變型在SNU449Tp細胞中過表達，并使用所示抗體及逆行免疫印跡。結(jié)果，Y577FFAK突變體不影響p27kipl的表達水平或SerlO的磷酸化作用(圖19)。而且，Huh7肝癌細胞用Scr或者shTM4SF5和pEGFP轉(zhuǎn)染并進行免疫熒光染色以用于p27kipl和DAPI。內(nèi)源表達的TM4SF5導(dǎo)致p27k^細胞液水平的降低(圖21)。這些結(jié)果證明，TM4SF5表達增強了p27kipl的表達和細胞液穩(wěn)定性，導(dǎo)致RhoA活性的下調(diào)。特別是，圖19中顯示的結(jié)果表明，在p271^1表達與FAK磷酸化作用之間沒有關(guān)系。因此，導(dǎo)致RhoA活性降低的增加的p27k^表達的TM4SF5-介導(dǎo)事件和通過FAK與RhoGAP之間結(jié)合的RhoA活性降低的另一TM4SF5-介導(dǎo)事件經(jīng)彼此不同的信號通路被誘導(dǎo)。(2)根據(jù)細胞液p27kiP1聚集的細胞形態(tài)變化由于TM4SF5-表達細胞具有如實施例2中所觀察到的細長形狀，以及如實施例3-(1)中觀察到的p27k^高表達，p27kipl表達水平對細胞48FLAG-標記的p27k^野生型在實施例1中建立的SNU449Cp細胞中過表達。48小時后，細胞用DAPI、羅丹明結(jié)合的鬼筆環(huán)肽和FLAG免疫熒光染色。然后，在共焦掃描顯微鏡下對細胞進行觀察。在親本細胞中不表達TM4SF5的p27kipl的過表達將細胞形態(tài)改變成細長形狀(圖22)。SNU449Tp細胞用siRNAp27kipl逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染24小時，用FLAG-標記的p27k^S10A轉(zhuǎn)染以培養(yǎng)24小時，然后進行免疫熒光染色。制備細胞溶解物并使用圖24中所示的抗體進行免疫印跡分析。結(jié)果，在TM4SF5-表達細胞中，p27一表達的抑制與由于SerlO被丙氨酸取代而不能在第10個殘基上被磷酸化的p27kiplS10A突變體的表達一起阻斷了p27kipl的細胞質(zhì)運輸，并將細胞形態(tài)改變成與SNU449或SNU449Cp的細胞形態(tài)相同的多邊形(圖23和圖24)。而且，對于肌動蛋白細胞骨架的免疫熒光染色而言，SNU449Tp細胞用pEGFP轉(zhuǎn)染并且活化的RhoA63L突變體構(gòu)建。結(jié)果，細胞形態(tài)被活化的RhoA逆轉(zhuǎn)成多邊形(圖25)。為了識別細胞質(zhì)p27^'介導(dǎo)的形態(tài)變化和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系，當(dāng)RhoGTPase被活化時檢查了細胞形態(tài)的變化和p27kipl的細胞內(nèi)定位的變化。首先，SNU449Cp和SNU449Tp細胞在蓋玻片上生長。然后細胞用10mM溶血磷脂酸(LPA)、RhoGTPase活化劑處理1小時，并對于DAPI和p27kipl進行免疫染色。LPA處理導(dǎo)致SNU449Tp細胞中p27kipl的細胞質(zhì)水平降低(圖26)。另外，SNU449Tp細胞用pEGFP和活性mDia突變體轉(zhuǎn)染，SNU449Cp細胞用pEGFP和活性Racl(Racl61L)或者PAK1(PAKl-caax)轉(zhuǎn)染。然后，使用免疫熒光染色對細胞進行分析。有趣地是，RhoA、mDia的下游介導(dǎo)子的活化將細胞形態(tài)恢復(fù)成與SNU449或SNU449Cp細胞形狀相同的多邊形。并導(dǎo)致p27k^的細胞質(zhì)表達水平的下降(圖27)。這被認為是因為由于RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化而使p27kipl蛋白質(zhì)不能被進一步穩(wěn)定，從而被定位在細胞核中(圖26和圖27的上面的方格)。相反，即便細胞不表達TM4SF5，活化Racl及其下游介導(dǎo)子PAK1的表達將細胞形狀改變成細長形狀并引起P27kipl的細胞質(zhì)聚集(圖27的中間和下面方格)。這些結(jié)果表明在p27kipl與RhoGTPase包括RhoA和Racl之間存在調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)，并且通過細胞質(zhì)P27kipl的RhoGTPase活性控制誘導(dǎo)了TM4SF5-表達細胞的形態(tài)變化。實施例4:TM4SF5-介導(dǎo)的EMT檢査了TM4SF5對細胞與細胞間接觸的控制的影響。首先，使用免疫印跡測定方法分析了來自TM4SF5-表達細胞和TM4SF5-不表達對照細胞的細胞溶解物的細胞-細胞粘附形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果，包括E-鈣粘蛋白、Z01和橋粒斑蛋白的細胞接觸蛋白的表達在TM4SF5-不表達細胞中顯著增加，而在TM4SF5-表達細胞中則被降低。相反，TM4SF5-表達細胞表達了高水平的在上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)中涉及的a-SMA(圖28)。另外，以高密度生長的SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞被放置在蓋玻片上并使用免疫染色法檢查E-鈣粘蛋白、J3-連環(huán)蛋白和Z01的表達模式。E-鈣粘蛋白、(3-連環(huán)蛋白和ZOl被布置在不表達TM4SF5的SNU449和SNU449Cp細胞中的細胞接觸位點，而這些蛋白質(zhì)零星地分布在其中細胞間接觸沒有被建立的TM4SF5-表達細胞中(圖29)。SNU449Tp細胞用p27kiplshRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，如實施例1中所述，并對E-鈣粘蛋白、P-連環(huán)蛋白和Z01進行免疫染色。當(dāng)p27k^的表達被抑制時，E-鈣粘蛋白、(3-連環(huán)蛋白和Z01以有規(guī)律的形式重新布置(圖30)，并且a-SMA的表達降低。為了識別內(nèi)源表達的TM4SF5在EMT調(diào)節(jié)方面的作用，對于TM4SF5和a-微管蛋白的表達檢査了表達shRNA和shTM4SF5的Huh7(圖31)。而且，細胞用肝細胞生長因子(HGF)(100ng/ml)處理24小時并對ZOl進行免疫染色。由于當(dāng)它們生長時它們形成克隆，Huh7細胞形成非常良好的細胞間接觸，而不管TM4SF5的表達。因此，EMT使用HGF被誘導(dǎo)之后，TM4SF5對細胞-細胞粘著形成的影響被研究。發(fā)現(xiàn)通過HGF的Huh7細胞的解體(或者接觸中斷)減少了TM4SF5-抑制的Huh7細胞。這些結(jié)果表明TM4SF5誘導(dǎo)了細胞間接觸的喪失(圖32)。實施例5:通過TM4SF5的細胞生長的接觸抑制的喪失SNU449Cp和SNU449Tp細胞在蓋玻片上生長并使用DAPI染色以觀察DNA以及細胞骨架肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果在圖33和圖34中顯示。箭頭指示了正在進行細胞分裂的細胞的重疊的細胞核。這表明細胞繼續(xù)分裂，盡管缺少用于生長的其他空間。另外，為了測定細胞的生長率，將5"04個細胞設(shè)置到6-孔板上并每12小時計一次數(shù)。結(jié)果以圖表表示。TM4SF5-表達的SNU449Tp細胞顯示了連續(xù)增加的生長率，而SNU449Cp對照細胞在增殖過程中接觸時不再進一步生長，顯示了飽和的生長曲線。甚至在低細胞濃度下這也可被觀察到。也就是說，在低濃度生長的細胞中，TM4SF5-表達細胞通過細胞分裂增殖，在該過程中兩個細胞核彼此重疊在一起。相反，不表達TM4SF5的SNU449細胞和SNU449Cp細胞在高細胞濃度下也不再進一步生長，在該濃度下相鄰細胞彼此實質(zhì)上接觸(圖34)。另外，對于細胞周期的S期中的細胞的比例，檢査了TM4SF5-表達細胞系(T7、T16和T3)。TM4SF5-表達細胞在S期中顯示了比不表達TM4SF5的SNU449細胞和SNU449Cp更高的細胞數(shù)量比例(圖35)。51而且，SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞用對照shRNA和shTM4SF5轉(zhuǎn)染，用用于DNA的碘化丙啶(propidiumiodide)染色，并使用流式細胞計數(shù)器分析細胞周期相分布。發(fā)現(xiàn)使用shRNA的TM4SF5表達的抑制降低了S-期細胞的數(shù)量(圖36)。BrdU免疫染色還揭示了與TM4SF5-不表達細胞相比，TM4SF5-表達細胞具有顯著高的S期細胞數(shù)，在該期中DNA合成發(fā)生(圖37)。發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致在S期中高細胞比例的這種S-期進程通過LPA-誘導(dǎo)的RhoA活化(圖38)、p27k^表達(圖39)和E-f丐粘蛋白的重新表達(圖40)而被專一性抑制。特別是，其中盡管TM4SF5表達，但E-鈣粘蛋白表達再次被升高調(diào)節(jié)的SNU449T16m細胞(細胞名"SNU449T16m"被確定是因為它們來自SNU449T16細胞)顯示了與TM4SF5-不表達細胞相同的細胞間接觸模式，并降低了a-SMA的表達(圖41)。通過這些結(jié)果，在TM4SF5-表達細胞中E-鈣粘蛋白表達的再次增加表明，TM4SF5通過EMT誘導(dǎo)了細胞生長的接觸抑制喪失，進一步表明在細胞間接觸與接觸介導(dǎo)的生長抑制之間存在密切的功能關(guān)系。實施例6:由TM4SF5形成的腫瘤組織的特征使用兩種方法評估了TM4SF5的腫瘤發(fā)生效果。第一，TM4SF5-表達細胞或者TM4SF5-不表達細胞被設(shè)置在粘附不依賴性生長條件下。細胞在軟瓊脂上培養(yǎng)27天。使用根據(jù)實施例l-(6)中描述的SNU449細胞系進行軟瓊脂測定。在第27天，在相差顯微鏡下觀察細胞克隆。結(jié)果，TM4SF5-表達細胞比TM4SF5-不表達細胞形成更多的克隆。但是，當(dāng)E-鈣粘蛋白在TM4SF5-表達細胞中重新表達時，在449T3m和T16m細胞中細胞克隆的形成顯著降低。這些結(jié)果表明TM4SF5-誘導(dǎo)的EMT與細胞粘著非依賴性生長有關(guān)(圖52)。接著，表達或不表達TM4SF5的各種SNU449細胞系被注射到裸鼠中。使用體重大約20g的4-5周齡的雌性裸鼠BALB/cAnNCrjBgi-nu(Orient.Co.Ltd)。動物被容納在滅菌的籠子中，并提供自由接近的無菌水和食物。所有過程在凈化操作臺中進行，在凈化操作臺中保持層流以提供潔凈的環(huán)境。使用室內(nèi)日光燈將裸鼠保持在12小時光照和12小時黑暗的光循環(huán)下，以便進行日夜生物循環(huán)。SNU449Cp、SNU449Tp、SNU449T16和SNU449T16m細胞的懸浮液被離心，并使用血球計數(shù)器對離心的細胞進行計數(shù)，將它們的濃度調(diào)節(jié)到lx107個細胞/200pl。使用具有26標準度量針的l-ml注射器將制備的細胞皮下注射到裸鼠的側(cè)腹中。實驗動物根據(jù)首爾國立大學(xué)用于實驗動物喂養(yǎng)的臨床前方法保持，并通過SNU449Tp監(jiān)測腫瘤形成。TM4SF5-表達細胞系是高腫瘤形成的，而親本細胞(449p)和對照細胞(449Cp)、449T3m細胞和T16m細胞不形成可檢測腫瘤(圖53)。來自注射有SNU449Cp和SNU449Tp細胞的鼠的腫瘤組織用用于組織學(xué)觀察的蘇木精和曙紅染色，并且使用免疫組化染色法分析p27kiP1和pS10p27^t的表達。免疫組化染色顯示在由TM4SF5誘導(dǎo)的腫瘤組織的中央?yún)^(qū)域的顯著的細胞死亡和p27kipl的細胞液水平和SerlO磷酸化的增加(圖54)。而且，來自上述組織的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物使用免疫印跡方法進行分析。TM4SF5-誘導(dǎo)的腫瘤組織顯示了比TM4SF5-不表達細胞被注射到其中的鼠組織更高的p27k^表達和磷酸化(圖55)。實施例7:通過TM4SF5的細胞運動性的增加(1)細胞遷移的評估使用BoydenTranswell小室24孔板(Costar,Cambridge,MA)對細胞遷移進行檢査。經(jīng)SNU449Cp和SNU449Tp細胞以5xl(^個細胞/孔放置在聚碳酸酯過濾器(8pm孔隙度)上的小室中。并在無血清RPMI培養(yǎng)基(RoswellParkMemorialInstitute)中在37°C、5%C02下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5324小時。然后，嵌入小室的膜的上表面上的細胞通過以棉簽擦拭而完全被除去。膜的下表面上的細胞用70%甲醇固定大約7分鐘。SNU449Cp和SNU449Tp細胞生長到匯合并創(chuàng)傷到預(yù)定深度。對傷口的封閉在光學(xué)顯微鏡下經(jīng)時監(jiān)測。結(jié)果，可以看出TM4SF5-表達的細胞顯示了比TM4SF5-不表達細胞更快的傷口愈合(圖58)。將SNU449Cp和SNU449Tp細胞設(shè)置在無血清培養(yǎng)基中的Transwell板的插孔中。將含10%血清的培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基加入到插孔的下部室中。為了評估細胞的經(jīng)時遷移，用0.005%的結(jié)晶紫對細胞染色1分鐘，用PBS洗滌三次，并在光學(xué)顯微鏡下觀察(見圖59的照片)。而且，在染料溶解后，在260nm處測定吸收，并表示為柱形圖(圖59的圖表)。與TM4SF5-不表達細胞相比TM4SF5-表達細胞顯示了增加的細胞遷移(圖59)。(2)酶譜(zymography)測定使用白明膠酶譜對分泌的MMPs的底物降解活性進行研究。在圖62中示出的細胞系在60-mm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。18小時后，將培養(yǎng)基替換成無血清培養(yǎng)基，并將細胞進一步培養(yǎng)24小時。收集培養(yǎng)上清液以得到分泌的MMP，然后進行濃縮。樣品在含有白明膠作用MMPs的底物的連續(xù)SDS-PAGE凝膠中在還原條件下進行電泳。凝膠在1%TritonX-100中洗滌以除去SDS，從而使酶復(fù)性。凝膠然后在酶反應(yīng)緩沖液(IOmMCaCl2,0.15MNaCl，50mMTris-HCl,pH7.5)中在37。C下溫育18小時。凝膠用0.5%考馬斯亮藍R250染色3小時，并在10%醋酸和30%甲醇中脫色直到顯示量帶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TM4SF5-表達的SNU449Tp、T3、T7和T16細胞中降解白明膠和粘連蛋白底物的MMP-2和MMP-9的活性增加。這些結(jié)果表明MMPs的蛋白降解活性通過TM4SF5增加(圖62)。另外，SNU449P用MMP-2熒光素酶或者MMP-9熒光素酶與各種濃54度的pcDNA3.1-MycHis-TM4SF5共轉(zhuǎn)染。36小時后，測定熒光素酶活性以比較MMP基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。發(fā)現(xiàn)MMP-9具有高基因表達水平以及高酶活性(圖63)。這些結(jié)果表明TM4SF5影響了MMP基因的表達水平。(3)使用3D膠原凝膠培養(yǎng)的細胞侵入評估使用Cytodex-3微載體對細胞侵入進行分析。SNU449Cp和SNU449Tp細胞以連接狀態(tài)在微載體小珠上生長，并在37'C下包括含血清培養(yǎng)基的膠原凝膠基質(zhì)中培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察顯示TM4SF5-表達的SNU449Tp細胞侵入到膠原凝膠中(圖60)。還使用BoydenTranswell小室24孔板對SNU449Tp細胞的侵入性進行分析，如在實施例7-(1)中提到的那樣。將Matrigd加入到板的插孔中，并允許在37。C下固化。按照上面描述的方法對細胞進行培養(yǎng)。24小時后，插入室的膜的上表面上的細胞通過使用棉簽擦拭而被完全除去。結(jié)果，36小時后，將己經(jīng)侵入到膜的下側(cè)的細胞染色。發(fā)現(xiàn)SNU449Tp細胞有效地侵入作為細胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel(圖62)。實施例8:抑制TM4SF5的功能的抗癌物質(zhì)(拮抗劑)的確定在預(yù)測調(diào)節(jié)由TM4SF5專一性誘導(dǎo)的細胞內(nèi)事件的化合物中，使用本發(fā)明的方法篩選上面的表1中描述的查耳酮化合物。圖69中示出的査耳酮化合物也被用于抗癌候選物。顯示前述抗癌功能的抗癌候選物被確定為本發(fā)明的抗癌物質(zhì)。所篩選的代表性的化合物在上表1中列出。為了進一步確認抗癌物質(zhì)的抗癌功能，在表l的化合物中，使用了4'-(p-苯甲磺酰胺)-4-羥基查耳酮(TSAHC)。用TSAHC處理的TM4SF5-表達細胞以依賴于TSAHC濃度的方式經(jīng)時降低線性生長(圖43右側(cè)的圖)，抑制S-期的進程(圖44)并恢復(fù)細胞接觸(圖45)。相反，TSAHC不影響TM4SF5-不表達細胞(圖43的左圖)。而且，發(fā)現(xiàn)TSAHC有效地降低了TM4SF5-介導(dǎo)的p27kipl、pSlcp27kipl、pY577FAK和a-SMA的高表達水平(圖46)。TSAHC處理449Tp細胞導(dǎo)致細胞質(zhì)p27kipi水平的下降(圖47)，表明TSAHC作為針對TM4SF5的拮抗劑起作用，從而阻斷了p27k^的穩(wěn)定性。此外，TSAHC恢復(fù)了TM4SF5-表達細胞中RhoA的活性(圖48)，并將細長的細胞形狀恢復(fù)成與TM4SF5-不表達細胞相同的形狀(圖49)。另外發(fā)現(xiàn)TSAHC處理增加了TM4SF5的7V-連接的糖基化區(qū)域?qū)NGaseF的敏感性(圖50)。這些結(jié)果表明TSAHC攻擊TM4SF5自身以改變A^-連接的糖基化結(jié)構(gòu)并影響TM4SF5與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合(在四旋蛋白-網(wǎng)中)，從而抑制了TM4SF5腫瘤形成功能。TSAHC處理抑制了內(nèi)源性表達TM4SF5的細胞的生長或增殖，但不影響不表達TM4SF5的細胞(圖51)。這些結(jié)果表明作為針對TM4SF5的拮抗劑的査耳酮化合物具有對TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤形成的防止和治療效果。對TM4SF5產(chǎn)生50%抑制(1<:5。)的查耳酮化合物的濃度在下表2中給出。表2<<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>730.2288.9833.42928.6958.23011.91044.43110.51170.5328.41287.73319.21367.83433.71483.13526.81549.13624.81666.33715.31753.43817.31850.3399.31940.24032.52053.44115.32172.3實施例9:本發(fā)明的查耳酮衍生物對人類癌細胞系的體外細胞毒性評估使用1989由美國NationalCancerInstitute(NCI)發(fā)展的磺基羅丹明B(SRB)法對本發(fā)明的査耳酮衍生物對人類癌細胞系的體外細胞毒性進行了評估。使用HCT15(結(jié)腸腺癌；ATCCCCL-225)、PC-3(前列腺癌；ATCCCRL-1435)以及A-549(肺癌；ATCCCCL-185)細胞系。在所有這些癌細胞韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究院(KRIBB)進行亞克隆。將人類癌細胞系在含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoCat.57No.31800)中在培養(yǎng)箱中37。C、5。/。C02下培養(yǎng)，并每周進行兩次亞克隆。使用含0.25%色氨酸(Sigma)和3mMCDTA(1,2-環(huán)己二胺四乙酸,Sigma)的磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma)將細胞從連接的表面上分離。將待測化合物(表1中闡明的查耳酮衍生物)溶解在少量二甲基磺酸(DMSO,Sigma)中，并在培養(yǎng)基中稀釋到所需濃度。DMSO的終濃度小于0.5%。稀釋的化合物(終濃度30,10,3,1和0.3pg/ml)通過0.22-|tim微過濾器(Millipore)滅菌?；衔飳θ祟惏┘毎档募毎拘允褂玫湫蚐RB法評估。本發(fā)明的査耳酮衍生物對人類癌細胞系的細胞毒性(ED5。，嗎/ml)在下表3中概述。表3化合物HCT-15A-549PC-3化合物HCT-15A-549PC-3135383750910923736395161311340353752765438343753878542404754799637413355671273330375668303134579109244031581112101030303259913201139384160478123735376112101058<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明的查耳酮化合物由于它們對人類癌細胞系的細胞毒性而具有作為抗癌劑的潛能。實施例10:TSAHC對腫瘤發(fā)生的抑制效果(1)TSAHC給藥在實施例6中制備的在裸鼠中形成的腫瘤的長度和寬度每兩天使用卡鉗測定一次。根據(jù)下列方程估計腫瘤體積體積(mm、-長度x寬度2x1/2,長度:長直徑，寬度短直徑。當(dāng)在裸鼠中誘導(dǎo)的腫瘤(即植入到鼠中的腫瘤)達到200mmS的尺寸時，將鼠分成兩組。將TSAHC(5mg/kg和50mg/kg)懸浮在生理鹽水中并在三周的時間段內(nèi)每兩天使用26標準度量注射器經(jīng)腹膜注射一次。(2)腫瘤組織的免疫組化和免疫印跡在SNU449Tp注射后的第六周或者在TSAHC給藥后的第三周，通過頸部錯位將裸鼠殺死。為了進行免疫組化檢査，將腫瘤組織切割下來，用甲醛固定，并用石蠟包埋。為了使用免疫印跡法檢査蛋白質(zhì)表達水平，將切割的腫瘤組織立即在液氮中冰凍并溶解在含有0.1%SDS的RIPA緩沖液中以獲得用于分析的蛋白質(zhì)混合物。6-iim的石蠟切片進行蘇木精和曙紅染色并進行免疫組化檢査。結(jié)果，在諸如TM4SF5-表達細胞的鼠中形成的腫瘤(n=6)繼續(xù)增大。相反，當(dāng)TSAHC以5mg/kg或者50mg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射時，腫瘤尺寸分別下降45%和88%(圖56)。實施例ll:TSAHC對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用(l)用于腫瘤轉(zhuǎn)移的動物模型的建立根據(jù)與腫瘤誘導(dǎo)模型(參見實施例6)中相同的方法制備用于腫瘤轉(zhuǎn)移的實驗動物模型。將SNU449Cp和SNU449Tp細胞懸液離心，并使用血球計對濃縮細胞計數(shù)。將lx107個細胞靜脈注射到裸鼠的尾部。3周后，將鼠殺死，并切下肺組織，用甲醛固定并用蘇木精和曙紅染色。當(dāng)將TM4SF5-表達細胞注射到鼠中時，在肺組織中形成腫瘤團塊(圖64)。在圖64中，箭頭指示形成的其中擠滿細胞的腫瘤塊。(2)TSAHC對TM4SF5-介導(dǎo)的細胞遷移和侵入的抑制SNU449Cp細胞和SNU449Tp涂敷在6-孔板上并培養(yǎng)24小時。然后用20tiMTSAHC處理細胞以培養(yǎng)18小時。將細胞轉(zhuǎn)移到Transwell室的插孔中。18小時后，將遷移的細胞固定、染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。對細胞計數(shù)，結(jié)果以圖表表示(圖65)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSAHC抑制TM4SF5-介導(dǎo)的細胞遷移。SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞被允許與微載體小珠連接，并在20(iMTSAHC存在下培養(yǎng)18小時。在包括含血清培養(yǎng)基的膠原凝膠基質(zhì)中培養(yǎng)小珠-細胞，并在給定時間點觀察侵入到膠原凝膠中的細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSAHC抑制TM4SF5-介導(dǎo)的細胞侵入膠原凝膠中(圖66)。61根據(jù)上述相同的方法，將細胞接種在涂敷由厚的Matrigel層的Transwell小室中，并培養(yǎng)24小時。對侵入到Matrigel中的細胞進行計數(shù)，結(jié)果以圖表顯示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSAHC有效抑制細胞侵入到Matrigel中(圖67)。另外，Cp細胞和Tp細胞用20nMTSAHC處理24小時。將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，并將細胞進一步培養(yǎng)18小時。收集培養(yǎng)上清液，濃縮并使用酶譜進行分析(見上述)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSAHC抑制TM4SF5-介導(dǎo)的MMP活性(圖68)。這些結(jié)果表明，TSAHC有效抑制了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程和發(fā)生。實施例12:TSAHC與其類似物的效果比較比較了TSAHC與其結(jié)構(gòu)類似物對TM4SF5-介導(dǎo)的事件的影響。在該測試中使用的二甲基磺酸(DMSO)和査耳酮類似物具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式DMSO4,4'-二羥基査耳酮4'-甲氧基-4-羥基査耳酮H2N"W。H4'-氨基-4-羥基查耳酮SNU449Cp細胞和SNU449Tp細胞被涂敷在6-孔板上并用20上述化合物處理24小時。使用光學(xué)顯微鏡監(jiān)測細胞的形態(tài)變化。62如圖69所示，在相同的處理條件下(20|iM,24小時的處理)，與上述幾乎具有與TSAHC相同結(jié)構(gòu)或者被不同R基團取代的TSAHC類似物不同，發(fā)現(xiàn)丁8八11(:有效地刺激了不是多層而是單層分布的丁]^485-表達細胞的生長,并將細胞形狀改變成與不表達TM4SF5的SNU449相同的形狀。這些結(jié)果表明TM4SF5對細胞生長的接觸抑制的影響由TSAHC化合物的專門R基團調(diào)節(jié)。如上述化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示的TSAHC類似物具有OH、NH2或者OCH3作為查耳酮A-環(huán)(左環(huán))上的取代基。這樣的TSAHC類似物不顯示抗腫瘤活性，不抑制TM4SF5-介導(dǎo)的多層生長。相反，磺胺類査耳酮化合物諸如磺基被引入其中的TSAHC通過抑制TM4SF5的功能而顯示抗腫瘤活性。也就是說，磺基引入到査耳酮化合物中賦予了與己知的査耳酮衍生物不同的獨特抗腫瘤活性。工業(yè)實用性如上面詳細描述的那樣，本發(fā)明提供了基于TM4SF5-介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生來篩選抗癌物質(zhì)的方法。該方法在篩選作為對腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的拮抗劑起作用的治療和預(yù)防物質(zhì)方面是有用的。另外，本發(fā)明的包括使用上述方法篩選的査耳酮化合物的抗癌組合物顯示了抗癌活性，并且體重不減輕，在肝和脾中沒有異常出現(xiàn)，并且沒有毒副作用。因此，該化合物作為抗癌藥物是有用的。雖然已經(jīng)參照特定特征對本發(fā)明進行了詳細描述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本說明書僅僅用于優(yōu)選實施方式，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物來限定。6權(quán)利要求1、一種篩選抗癌化合物的方法，包括(a)培養(yǎng)表達序列號2的多肽的癌細胞，并使用抗癌候選物處理癌細胞；(b)在用抗癌候選物處理的癌細胞中檢測下列中的至少一種(i)在編碼粘著斑激酶(FAK)的氨基酸序列的第577位色氨酸(Tyr577)的磷酸化作用，(ii)將FAK結(jié)合到Rho-GTPase活化蛋白質(zhì)(RhoGAP)或者將FAK結(jié)合到與FAK有關(guān)的GTPase調(diào)節(jié)子(GRAF)，(iii)細胞液p27Kip1的表達水平和穩(wěn)定性，(iv)RhoA活性，和(v)Rac1活性；以及(c)當(dāng)下列事件發(fā)生時，與當(dāng)沒有用抗癌候選物進行處理時相比較，確定抗癌候選物是否能夠作為抗癌物質(zhì)(i)降低Tyr577上FAK的磷酸化作用，(ii)抑制FAK結(jié)合到RhoGAP或者FAK結(jié)合到GRAF，(iii)減少細胞液p27Kip1的表達和穩(wěn)定性，(iv)增強RhoA活性，或者(v)降低Rac1活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，細胞液p27Kipl為Ser10上磷酸化的p27Kipl。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，步驟(b)進一步包括檢測選擇下組中至少一種該組包括細胞形態(tài)，在細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達，細胞-細胞接觸模式或者接觸生長，a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)或者波形蛋白的表達，E-鈣粘蛋白的表達，和上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT);并且步驟(c)進一步包括下列事件細胞形態(tài)從桿狀變化成多邊形，降低了在細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達，細胞-細胞接觸的保持，細胞生長的接觸抑制，降低了oi-SMA或者波形蛋白的表達，增加了E-鈣粘蛋白的表達，或者降低了上皮-間葉細胞轉(zhuǎn)移(EMT)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，細胞-細胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)選自下組，該組包括E-鈣粘蛋白、閉合帶-1(ZOl)，p-連環(huán)蛋白和橋粒斑蛋白。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，細胞生長的接觸抑制通過細胞數(shù)的減少、S-期細胞數(shù)量的減少或者多層生長的抑制來進行。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，細胞數(shù)的減少或者S-期細胞數(shù)量的減少通過膜蛋白的N-連接的糖基化的失活而被介導(dǎo)。7、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，步驟(b)進一步包括檢測選自下組中的至少一種，該組包括在細胞外基質(zhì)或者血清的存在下細胞轉(zhuǎn)移或者運動，侵入到包括細胞外基質(zhì)的膠原凝膠中，侵入到作為細胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel中，和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性；并且步驟(c)進一步包括下列事件在細胞外基質(zhì)或者血清的存在下降低細胞轉(zhuǎn)移或者運動，降低侵入到膠原凝膠中，降低侵入到Matrigel中，或者降低MMP活性。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，所述MMP為MMP-2或MMP-9。9、根據(jù)權(quán)利要求1的抗癌化合物的篩選方法，其特征在于，癌細胞來自選自下組的癌癥，該組包括胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、腦瘤、乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、食道癌、子宮癌和肺癌。10、由下列化學(xué)式1或2表示的抗癌査耳酮化合物，其特征在于，化學(xué)式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，R^表示R4S(V;R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(CrC5)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(C6-CuO芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(CrCs)烷基，化學(xué)式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，Ri表示R4S(V;R2和R3為獨立的氫或者羥基；R4為(d-C5)烷基或者具有選自下組的一個或多個取代基的(CVCH))芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(CrCs)烷基。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的抗腫瘤查耳酮化合物，其特征在于，查耳酮化合物為選自下組的至少一種，該組包括4'-(p-甲苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮4'-(p-甲苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮3'-(p-甲苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮2'-(p-甲苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮4'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮3'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮;3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮;2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮;4'-(p-氟苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(o-氟苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(p-硝基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮;4'-(0-硝基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(p-氨基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮;4'-(o-氨基苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(苯磺酰胺)-4-羥基査耳酮；4'-(甲磺酰胺M-羥基査耳酮；4'-(P-甲苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(p-氟苯基磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(m-氟苯基磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(p-硝基苯磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(p-氨基苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(甲磺酸)-4-羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-3，4-二羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,4-二羥基査耳酮；4'-(p-甲苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；3'-(p-甲苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；2'-(p-甲苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2，5-二羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基査耳酮；3'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；2'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮;4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，4-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-3，4-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；4'-(p-氟苯磺酰胺)-3，4-二羥基查耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(o-氟苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(p-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(o-硝基苯磺酰胺)-3，4-二羥基查耳酮；4'-(p-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(o-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(苯磺酰胺)-3，4-di羥基査耳酮；4'-(甲磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(p-甲苯基苯磺酰胺)-2-氯-4-羥基查耳酮;4'-(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；74'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2，4-二羥基査耳酮；4'-(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基査耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2，3-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；和4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮。12、一種抗癌組合物，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的查耳酮化合物作為有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及一種篩選抗癌化合物的方法和使用該方法篩選的抗癌化合物，具體涉及一種篩選抗癌化合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)表達癌基因蛋白跨膜4L6家族成員5(TM4SF5)的癌細胞，其表達為序列號2的多肽，使用抗癌候選物處理癌細胞，并且當(dāng)候選物顯示對腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的拮抗活性時基于通過TM4SF5的分子機理的一些事件確定抗癌候選物。本發(fā)明還涉及使用該方法篩選的具有抗癌活性的查耳酮化合物，以及包括該化合物作為有效成分的抗癌組合物。文檔編號A61K31/135GK101528210SQ200780027477公開日2009年9月9日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日發(fā)明者樸基憲,李申愛,李重元,柳永裴,柳炯元申請人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財團;慶尚大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團