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自閉癥生物標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):11249528閱讀:821來(lái)源:國(guó)知局
自閉癥生物標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明涉及自閉癥生物標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒。



背景技術(shù):

自閉癥(asd,autismspectrumdisorders)或稱孤獨(dú)癥或者孤獨(dú)癥譜系障礙,是廣泛性發(fā)育障礙的一種亞型,以男性多見,起病于嬰幼兒期,主要表現(xiàn)為不同程度的言語(yǔ)發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板,約有3/4的患者伴有明顯的精神發(fā)育遲滯。據(jù)美國(guó)疾病監(jiān)控與預(yù)防中心(cdc)數(shù)據(jù),2015年其發(fā)病率1/45(即2.24%)。我國(guó)尚缺乏全國(guó)性流行病調(diào)查數(shù)據(jù),若以1/100估算,預(yù)估我國(guó)asds患者將超過(guò)1000萬(wàn)。

自閉癥(asd)作為一種兒童精神疾病嚴(yán)重影響患兒的社會(huì)功能,給患兒家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān),但是目前自閉癥通常根據(jù)量表進(jìn)行評(píng)估,沒(méi)有血液診斷方法和有效的治療方案,這樣診斷將依靠主觀經(jīng)驗(yàn)判斷,不僅不能對(duì)自閉癥的發(fā)病提供有效預(yù)警,而且診斷準(zhǔn)確率很低。因此研究自閉癥發(fā)病機(jī)理和可以體現(xiàn)其嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物,并及時(shí)針對(duì)病因進(jìn)行干預(yù)與治療是治療疾病、減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵因素。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了自閉癥生物標(biāo)志物;本發(fā)明還提供了用于診斷自閉癥的試劑盒;本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)。

本發(fā)明第一方面提供了自閉癥生物標(biāo)志物,其包括腸道中的iga水平。

本發(fā)明第二方面提供了所述的生物標(biāo)志物在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明第三方面提供了檢測(cè)腸道中的iga水平的試劑組合在制備用于診斷自閉癥的試劑盒中的用途。

在一優(yōu)選例中,所述檢測(cè)腸道中的iga水平的試劑組合包括elisa檢測(cè)試劑。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑包括含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括hrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液,其是采用品牌為jackson且貨號(hào)為109-036-011的hrp標(biāo)記的羊抗人iga以體積比1∶10000稀釋于含2.5%脫脂牛奶的pbs中獲得。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括含0.2%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括含2.5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括磷酸緩沖鹽溶液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括tmb顯色液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括終止液。

在一優(yōu)選例中,所述終止液為濃度為2m的h2so4溶液。

在一優(yōu)選例中,所述用于診斷自閉癥的試劑盒的使用包括以下步驟:

獲取來(lái)自受測(cè)個(gè)體腸道的第一生物樣品和來(lái)自正常個(gè)體腸道的第二生物樣品;

將第一生物樣品和第二生物樣品進(jìn)行勻漿處理從而提取上清;

將上清分別進(jìn)行等同稀釋后進(jìn)行elisa檢測(cè);

根據(jù)elisa檢測(cè)的結(jié)果對(duì)第一生物樣品和第二生物樣品所含的腸道中的iga水平進(jìn)行差異顯著性分析。

在一優(yōu)選例中,所述第一生物樣品和第二生物樣品均為腸道固體排泄物。

在一優(yōu)選例中,將第一生物樣品和第二生物樣品進(jìn)行勻漿處理從而提取上清包括如下步驟:所述稱取健康對(duì)照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右,均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行勻漿處理,然后20000g離心10分鐘,取上清作為生物樣本提取液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)包括如下步驟:

步驟一:在elisa反應(yīng)板中加入含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體的pbs,4℃密封孵育16小時(shí);拍干反應(yīng)板,用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,再用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,得到包被好的elisa板;

步驟二:在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5%脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應(yīng)板孔中,于37℃孵育1小時(shí);

步驟三:用含0.2%吐溫20的pbs洗滌elisa板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)四次。洗板后在各反應(yīng)板孔加入100ulhrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時(shí);

步驟四:用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)五次。洗板后在各反應(yīng)板孔均加入tmb顯色液100ul顯色,置于37℃保溫15min,然后每孔加入50ul終止液終止反應(yīng);

步驟五:分別于終止后,將各反應(yīng)板置酶標(biāo)儀中,讀取od450值。

本發(fā)明第四方面提供了一種自閉癥檢測(cè)試劑盒,包括適用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物的試劑。

在一優(yōu)選例中,還包括分析所述生物標(biāo)志物在體內(nèi)是否異常的工具。

在一優(yōu)選例中,所述適用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物的試劑包括elisa檢測(cè)試劑。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑包括含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括hrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液,其是采用品牌為jackson且貨號(hào)為109-036-011的hrp標(biāo)記的羊抗人iga以體積比1∶10000稀釋于含2.5%脫脂牛奶的pbs中獲得。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括含0.2%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括含2.5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括磷酸緩沖鹽溶液。;

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括tmb顯色液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)試劑還包括終止液。

在一優(yōu)選例中,所述終止液為濃度為2m的h2so4溶液。

在一優(yōu)選例中,所述試劑盒的使用包括以下步驟:

獲取來(lái)自受測(cè)個(gè)體腸道的第一生物樣品和來(lái)自正常個(gè)體腸道的第二生物樣品;

將第一生物樣品和第二生物樣品進(jìn)行勻漿處理從而提取上清;

將上清分別進(jìn)行等同稀釋后進(jìn)行elisa檢測(cè);

根據(jù)elisa檢測(cè)的結(jié)果對(duì)第一生物樣品和第二生物樣品所含的腸道中的iga水平進(jìn)行差異顯著性分析;

任選的,所述第一生物樣品和第二生物樣品均為腸道固體排泄物;

在一優(yōu)選例中,將第一生物樣品和第二生物樣品進(jìn)行勻漿處理從而提取上清包括如下步驟:所述稱取健康對(duì)照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右,均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行勻漿處理,然后20000g離心10分鐘,取上清作為生物樣本提取液。

在一優(yōu)選例中,所述elisa檢測(cè)包括如下步驟:

步驟一:在elisa反應(yīng)板中加入含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體的pbs,4℃密封孵育16小時(shí);拍干反應(yīng)板,用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,再用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,得到包被好的elisa板;

步驟二:在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5%脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應(yīng)板孔中,于37℃孵育1小時(shí);

步驟三:用含0.2%吐溫20的pbs洗滌elisa板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)四次。洗板后在各反應(yīng)板孔加入100ulhrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時(shí);

步驟四:用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)五次。洗板后在各反應(yīng)板孔均加入tmb顯色液100ul顯色,置于37℃保溫15min,然后每孔加入50ul終止液終止反應(yīng);

步驟五:分別于終止后,將各反應(yīng)板置酶標(biāo)儀中,讀取od450值。

本發(fā)明第五方面提供了所述的試劑盒在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明第六方面提供了一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng),包括:

勻漿處理裝置,所述勻漿處理裝置用于將待測(cè)樣品和對(duì)照樣品進(jìn)行勻漿處理從而提取上清;

elisa檢測(cè)裝置,所述elisa檢測(cè)裝置與所述勻漿處理裝置相連,用于檢測(cè)待測(cè)樣品和對(duì)照樣品各自上清經(jīng)elisa檢測(cè)試劑處理后的酶標(biāo)值;以及

分析裝置,所述分析裝置與所述elisa檢測(cè)裝置相連,基于酶標(biāo)值對(duì)其所含的生物標(biāo)志物進(jìn)行差異顯著性分析,根據(jù)分析結(jié)果判斷所述生物樣品是否易患自閉癥。

在一優(yōu)選例中,所述待測(cè)樣品和對(duì)照樣品均為腸道固體排泄物。

在一優(yōu)選例中,將待測(cè)樣品和對(duì)照樣品進(jìn)行勻漿處理包括如下步驟:稱取所述待測(cè)樣品和對(duì)照樣品各0.3克左右,均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行勻漿處理,然后20000g離心10分鐘,取上清作為生物樣本提取液。

在一優(yōu)選例中,所述檢測(cè)待測(cè)樣品和對(duì)照樣品各自上清經(jīng)elisa檢測(cè)試劑處理后的酶標(biāo)值包括如下步驟:

步驟一:在elisa反應(yīng)板中加入含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體的pbs,4℃密封孵育16小時(shí);拍干反應(yīng)板,用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,再用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,得到包被好的elisa板;

步驟二:在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5%脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應(yīng)板孔中,于37℃孵育1小時(shí);

步驟三:用含0.2%吐溫20的pbs洗滌elisa板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)四次。洗板后在各反應(yīng)板孔加入100ulhrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時(shí);

步驟四:用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)五次。洗板后在各反應(yīng)板孔均加入tmb顯色液100ul顯色,置于37℃保溫15min,然后每孔加入50ul終止液終止反應(yīng);

步驟五:分別于終止后,將各反應(yīng)板置酶標(biāo)儀中,讀取od450值。

在本文中,術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”應(yīng)做廣義理解,其包括任何能夠反映異常狀態(tài)的任何可檢測(cè)生物指標(biāo),可以包含基因標(biāo)志物,物種標(biāo)志物(種標(biāo)志物/屬標(biāo)志物)以及功能標(biāo)志物(ko/og標(biāo)志物),其具有非常廣泛的用途,可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來(lái)評(píng)價(jià)新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性及有效性。

本發(fā)明具有以下有益效果:

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)自閉癥的致病與腸道中的iga含量有關(guān),因此將腸道中的iga含量作為自閉癥的檢測(cè)標(biāo)志物,這樣自閉癥的診斷將不依靠主觀經(jīng)驗(yàn)判斷,不僅可以對(duì)自閉癥的發(fā)病提供有效預(yù)警,而且可對(duì)其進(jìn)行確診,克服了自閉癥的診斷較大程度的依賴于主觀經(jīng)驗(yàn)判斷的缺陷,極大提高了診斷準(zhǔn)確率。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)階段自閉癥組和對(duì)照組的腸道iga含量的對(duì)比圖,其elisa檢測(cè)時(shí)采用標(biāo)本1(1∶4),縱軸代表od450值,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品。***代表p值小于0.0001,t檢驗(yàn)。

圖2是實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)階段自閉癥組和對(duì)照組的腸道iga含量的對(duì)比圖,其elisa檢測(cè)時(shí)采用標(biāo)本2(1∶40),縱軸代表od450值,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品。***代表p值小于0.0001,t檢驗(yàn)。

圖3是實(shí)施例1中驗(yàn)證階段自閉癥組和對(duì)照組的腸道iga含量的對(duì)比圖,其elisa檢測(cè)時(shí)采用標(biāo)本1(1∶4),縱軸代表od450值,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品。***代表p值小于0.0001,t檢驗(yàn)。

圖4是實(shí)施例1中驗(yàn)證階段自閉癥組和對(duì)照組的腸道iga含量的對(duì)比圖,其elisa檢測(cè)時(shí)采用標(biāo)本2(1∶40),縱軸代表od450值,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品。***代表p值小于0.0001,t檢驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

除非特殊說(shuō)明,本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實(shí)施例和附圖,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明,需要說(shuō)明的是,這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的,而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的,均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件,如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例運(yùn)用elisa檢測(cè)分析健康人群和自閉癥患者的糞便樣本,繼而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),從而確定與自閉癥患者群相關(guān)的生物標(biāo)志物。具體步驟如下:

1.樣品來(lái)源

自閉癥組:來(lái)自深圳市兒童醫(yī)院心理科及言語(yǔ)治療科門診asd患兒,收集時(shí)間為2015年7~12月。納入標(biāo)準(zhǔn):①根據(jù)國(guó)際最新診斷標(biāo)準(zhǔn),即《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders,5thedition,dsm-5),診斷為asd”需要非常多支持”的患兒;②年齡<14歲;③性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他精神疾病(如精神分裂癥等);②患有其他神經(jīng)發(fā)育障礙疾?。虎刍加羞z傳代謝性疾??;④患有嚴(yán)重神經(jīng)疾病以及顱腦損傷史等重大軀體疾病史。

對(duì)照組:來(lái)自深圳市兒童醫(yī)院兒??企w檢兒童。納入標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)精神疾病,身體健康;②與患者組年齡及性別匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。所有入組兒童家長(zhǎng)對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

本研究經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

本研究分兩期:發(fā)現(xiàn)階段和驗(yàn)證階段。

第一期為發(fā)現(xiàn)階段,共收集22例自閉癥患兒,男18例,女4例;年齡2~6歲,平均(2±1)歲。共收集15名對(duì)照兒童,男8名,女7名;年齡1~6歲,平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗(yàn)p>0.05)、年齡(student’sttest,p>0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

第二期為驗(yàn)證階段,收集22例自閉癥患兒,男18例,女3例;年齡2~6歲,平均(2±1)歲。共收集16名對(duì)照兒童,男9名,女7名;年齡1~6歲,平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗(yàn),p>0.05)、年齡(student’sttest,p>0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.糞便采集與獲取上清

稱取健康對(duì)照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右,均用兩倍體積的pbs(磷酸緩沖鹽溶液,phosphatebuffersaline))進(jìn)行勻漿處理,然后20000g離心10分鐘,取上清作為生物樣本提取液,進(jìn)行后續(xù)iga含量檢測(cè)。

3.elisa檢測(cè)

(1)反應(yīng)板包被:在elisa反應(yīng)板(品牌為coming,貨號(hào)為9018)中加入含1ug/ml羊抗人iga,igg,igm(h+l)抗體(品牌為jackson,貨號(hào)為109-006-064)的pbs,4℃密封孵育16小時(shí);拍干反應(yīng)板,用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,再用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,得到包被好的elisa板。

(2)加入標(biāo)本:在包被好的elisa板孔中加入標(biāo)本1(1∶4),或標(biāo)本2(1∶40)于反應(yīng)板孔中,于37℃孵育1小時(shí)。

所述標(biāo)本1(1∶4)包括75ul含2.5%脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液;所述標(biāo)本2(1∶40)包括97.5ul含2.5%脫脂牛奶的pbs和2.5ul生物樣本提取液。

(3)加入酶標(biāo)抗體:用含0.2%吐溫20的pbs洗滌elisa板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)四次,洗板后在各反應(yīng)板孔加入100ulhrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液(hrp標(biāo)記的羊抗人iga,具有α鏈特異性,品牌為jackson貨號(hào)為109-036-011,其以體積比1∶10000稀釋于含2.5%脫脂牛奶的pbs中得到hrp標(biāo)記的羊抗人iga的溶液)于37℃孵育1小時(shí)。

(4)顯色:用含0.2%吐溫-20的pbs洗滌板孔,拍干反應(yīng)板,重復(fù)五次,洗板后在各反應(yīng)板孔均加入tmb顯色液100ul顯色,置于37℃保溫15min,然后每孔加入50ul終止液(2m硫酸)終止反應(yīng)。

(5)檢測(cè):分別于終止后,將各反應(yīng)板置酶標(biāo)儀中,讀取od450值。

上述各步驟涉及到的試劑的配制方法如下:

pbs:稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g,磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g,氯化鈉(nacl)8.0g,氯化鉀(kcl)0.2g,加水至1000ml。

含0.2%吐溫-20的pbs:稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g,磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g,氯化鈉(nacl)8.0g,氯化鉀(kcl)0.2g,吐溫-202ml,加水至1000ml。

含2.5%脫脂牛奶的pbs:稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g,磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g,氯化鈉(nacl)8.0g,氯化鉀(kcl)0.2g,脫脂奶粉25g,加水至1000ml。

4.統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)t檢驗(yàn)法分析自閉癥組和對(duì)照組的iga水平是否差異顯著。

結(jié)果:

(1)發(fā)現(xiàn)階段

第一期為發(fā)現(xiàn)階段,共收集22例患兒,男18例,女4例;年齡2~6歲,平均(2±1)歲。共收集15名對(duì)照兒童。發(fā)現(xiàn)階段,通過(guò)t檢驗(yàn)法分析發(fā)現(xiàn),自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對(duì)照,1∶4和1∶40兩個(gè)稀釋度的檢測(cè)結(jié)果差異的p值均小于0.0001.自閉癥患者糞便中iga含量顯著高于健康對(duì)照,如圖1和圖2所示。

(2)驗(yàn)證階段

第二期為驗(yàn)證階段,收集22例患兒,16名對(duì)照兒童,通過(guò)t檢驗(yàn)法分析發(fā)現(xiàn),自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對(duì)照,1∶4稀釋度的檢測(cè)結(jié)果差異的p值均小于0.05,如圖3和圖4所示。

綜上所述,自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對(duì)照,通過(guò)elisa方法且采用標(biāo)本1(1∶4)來(lái)檢測(cè)糞便iga總含量在疾病組和對(duì)照組差異顯著(p值小于0.05),可以作為疾病診斷標(biāo)志物,或者作為疾病治療的靶標(biāo),或者作為治療評(píng)估的指標(biāo),為自閉癥的診斷和治療提供新的思路。

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