專利名稱：梔子提取物在治療慢性乙型肝炎中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及梔子提取物的新用途，尤其涉及梔子提取物在治療慢性乙型肝炎和保護(hù)肝損傷中的用途，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎是一種世界性的常見病，我國屬流行的“重災(zāi)區(qū)”，各種類型病毒性肝炎嚴(yán)重威脅著國人的健康。西方國家以丙型肝炎為最多，而在我國主要流行的卻是乙型肝炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界有3.5億慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，我國感染者約1.2億，由乙型肝炎引起的肝功能不正常患者約有3000萬人，國內(nèi)慢性丙型肝炎的感染率也有約3.2％。此外，慢性病毒性肝炎還與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系，絕大部分肝癌病人有慢性肝炎病史，因此慢性肝炎的治療已成為一個迫切需要解決的重大問題。
目前慢性乙肝的治療，西醫(yī)主要采用抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善肝功能和抗肝纖維化等綜合療法。其中，抗病毒是最主要的措施。主要用于抗病毒的藥物有干擾素和幾種核苷類似物。干擾素對乙型和丙型肝炎的治療有效率約為30％～50％，停藥后約6個月至1年內(nèi)大部分病人會復(fù)發(fā)。干擾素治療藥費(fèi)相當(dāng)昂貴，一個病人用進(jìn)口干擾素需人民幣數(shù)萬元，用國產(chǎn)干擾素亦在1萬元以上。干擾素需要肌肉注射，部分病人用藥后有流感樣癥狀的副反應(yīng)。某些核苷類似物如拉米夫定(lamivudin)、法昔洛韋(famciclovir)對肝炎病毒有一定的治療效果，但亦存在停藥后很快反跳即復(fù)發(fā)現(xiàn)象，藥品價格亦較昂貴?？梢哉f至今世界上尚沒有一種特效的藥物能肯定有效地清除乙肝病毒。在改善肝功能藥物又稱保肝藥或抗肝細(xì)胞損傷藥物方面，市場上銷售的有聯(lián)苯雙酯、肝細(xì)胞生長因子、五味子制劑及其他中草藥復(fù)方制劑等，甘草甜素已由日本研制成功，水飛薊素為德國產(chǎn)品，在世界市場上銷售。這類藥物對降低血清轉(zhuǎn)氨酶、退黃疸有一定效果。這類藥物費(fèi)用較低，副反應(yīng)少，但停止使用后，大多數(shù)病人病情亦會復(fù)發(fā)，且對肝炎病毒陽性指標(biāo)轉(zhuǎn)陰似乎沒有什么療效。免疫調(diào)節(jié)藥有轉(zhuǎn)移因子、白細(xì)胞介素-2、胸腺肽、皮質(zhì)激素等，這類藥物治療慢性肝炎的病例不多，療效尚待肯定，藥費(fèi)較昂貴，且有副反應(yīng)。由此可見，目前尚無滿意的治療慢性病毒性肝炎的藥物。
梔子是茜草科植物山梔Gardeniajasm inoides Ellis.的果實(shí)，性苦寒，無毒，入心、肝、肺、胃經(jīng)，能清熱瀉火、涼血解毒，是一味多年來應(yīng)用于中醫(yī)臨床的常用藥，現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究結(jié)果證明，梔子具有多方面的藥理作用，如保肝利膽、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌消炎、降低血壓、防治動脈粥樣硬化及血栓等多方面作用，其中以保肝利膽作用最為顯著。
研究表明，梔子提取物中含有眾多的化學(xué)成分，如黃酮類(梔子素類)、環(huán)烯醚萜甙類(包括梔子苷、羥異梔子苷、梔子苷酸、京尼平、山梔子苷、車葉草苷等)、三萜類(梔子花酸類)、有機(jī)酸酯類(綠原酸、藏紅花酸類等)，另外還含有D-甘露醇、甾醇類、三萜皂甙類、長鏈烷烴、醇、色素，揮發(fā)油、多糖等成分。迄今為止，尚未分離得到治療慢性乙型肝炎的梔子有效部位提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種治療慢性乙型肝炎并對肝損傷具有保護(hù)作用的梔子有效部位提取物，以重量份計(jì)，該梔子提取物中含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，含梔子苷25％以上。
優(yōu)選的，以重量份計(jì)，該梔子提取物含總環(huán)烯醚萜苷70％以上，含梔子苷50％以上。
梔子提取物中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜甙類、三萜類、有機(jī)酸酯類等成分，其中環(huán)烯醚萜苷類主要包括梔子苷(geniposide)、羥異梔子苷(gardenoside)、京尼平酸(geniposidic acid)、京尼平(genipin)等成分。為了從如此眾多的成分中分離得到有效的抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制和對肝損傷具有保護(hù)作用的有效部位，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)梔子提取物中的總環(huán)烯醚萜苷，尤其是梔子苷是抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制和對肝損傷具有保護(hù)作用的有效成分，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)梔子提取物中含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，含梔子苷25％以上，尤其是含總環(huán)烯醚萜苷70％以上，含梔子苷50％以上的梔子提取物具有顯著的抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制和保護(hù)肝損傷的作用。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種制備上述梔子提取物的方法。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的一種制備梔子提取物的方法，包括以下步驟1).將梔子粉碎，用30-70％乙醇40-60℃浸泡，得浸提液；2).浸提液離心除渣，取上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)60-80％，沉淀，靜置，過濾除沉后回收乙醇至無醇味；3).用水稀釋，過弱極性大孔吸附樹脂柱，待全部通過樹脂柱后，再用上樣體積0.5-2倍量水沖柱，至流出液無色，繼續(xù)用20-50％乙醇沖柱，收集洗脫液，減壓濃縮回收乙醇即得梔子提取物。
上述制備方法中，步驟1)中將梔子粉碎后優(yōu)選用50％乙醇50℃浸泡兩次，每次3小時以上；步驟2)中上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇優(yōu)選至含醇量達(dá)70％；步驟3)中所述的弱極性大孔吸附樹脂柱優(yōu)選為AB-8大孔吸附樹脂、X-5大孔吸附樹脂或D101大孔吸附樹脂；用水沖柱時，優(yōu)選用上樣體積1倍量水沖柱；至流出液無色，繼續(xù)用30％乙醇沖柱。為了得到總環(huán)烯醚萜苷或梔子苷含量更高的梔子提取物，步驟3)中優(yōu)選將所制備的梔子提取物進(jìn)行精制，即將所得到的梔子提取物進(jìn)一步通過硅膠柱層析，用體積比為6-9∶1-4的氯仿與甲醇為洗脫液，進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即得總環(huán)烯醚萜苷或梔子苷含量更高的梔子提取物。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種藥物組合物，該藥物組合物由治療上有效劑量的上述梔子提取物和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以含有10％-99％重量，優(yōu)選10-60％重量的梔子提取物。
本發(fā)明藥物組合物可按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備成臨床上適宜的口服制劑或非腸道給藥的劑型，例如可以是顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、滴丸劑、口服液；或注射劑、栓劑、氣霧劑等。
本發(fā)明梔子提取物經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，能夠有效抑制乙型肝炎病毒進(jìn)行DNA復(fù)制以及對肝損傷有明顯的保護(hù)作用。
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將梔子粉碎，用30％乙醇40℃溫度下浸泡，得浸提液，浸提液離心除渣，上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)60％，沉淀，靜置過夜。過濾除沉后回收乙醇幾無醇味，按1克生藥10ml比例用水稀釋，得上柱液。
取AB-8大孔吸附樹脂，裝柱，按生藥樹脂比1∶2的比例，將上述提取液通過AB-8大孔吸附樹脂柱，待全部通過樹脂柱后，再用上樣體積0.5倍量水沖柱，至流出液基本無色。繼用20％乙醇沖柱，洗脫液減壓回收乙醇的提取物。
經(jīng)紫外分光光度法測定，此總提取物含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，經(jīng)高效液相色譜法測定此總提取物含梔子苷26％以上。
實(shí)施例2將梔子粉碎，取70％乙醇60℃浸泡兩次，每次3小時以上，合并浸提液，浸提液離心除渣，上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)80％沉淀，靜置過夜。過濾除沉后回收乙醇幾無醇味，按1克生藥10ml比例用水稀釋，得上柱液。
取X-5大孔吸附樹脂，裝柱，按生藥樹脂比1∶2的比例，將上述提取液通過AB-8大孔吸附樹脂柱，待全部通過樹脂柱后，再用上樣體積2倍量水沖柱，至流出液基本無色。繼用50％乙醇沖柱，洗脫液減壓回收乙醇的提取物。經(jīng)紫外分光光度法測定，此總提取物含總環(huán)烯醚萜苷60％以上，經(jīng)高效液相色譜法測定此總提取物含梔子苷40％。
實(shí)施例3粉碎，取50％乙醇50℃浸泡兩次，每次3小時以上，和并浸提液，浸提液離心除渣，上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)70％沉淀，靜置過夜。過濾除沉后回收乙醇幾無醇味，按1克生藥10ml比例用水稀釋，得上柱液。
取D101大孔吸附樹脂，裝柱，按生藥樹脂比1∶2的比例，將上述提取液通過AB-8大孔吸附樹脂柱，待全部通過樹脂柱后，再用上樣體積一倍量水沖柱(約5倍柱體積)，至流出液基本無色。繼用30％乙醇沖柱，洗脫液減壓回收乙醇的提取物。將此提取物通過硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇按比例(8∶2)洗脫，得提取物，此總提取物經(jīng)紫外分光光度法測定，含總環(huán)烯醚萜苷70％以上，經(jīng)高效液相色譜法測定，此總提取物含梔子苷90％以上。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明梔子提取物抗乙型肝炎病毒活性試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、細(xì)胞株2.2.15細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒所保存2、供試樣品本發(fā)明實(shí)施例1、2和3所制備的梔子提取物，分別編號為供試樣品1、2和3；臨用前溶于DMSO(二甲基亞砜)配成1000mg/ml，檢測時用培養(yǎng)液作3倍稀釋，共8個稀釋度。
3、陽性對照藥拉米夫定(3TC)，由葛蘭素威康公司生產(chǎn)。
4、主要試劑乙肝病毒e抗原及s抗原放免檢測試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所提供；α32PdCTP，中國福瑞生物工程有限公司提供；二、試驗(yàn)方法2.2.15細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，36小時后按以上稀釋度分別加入供試樣品及陽性對照藥，同時設(shè)細(xì)胞對照孔，加藥后96小時后分別更換含不同稀釋濃度樣品的培養(yǎng)液，于加藥后第8天分別收集細(xì)胞上清及2.2.15細(xì)胞，點(diǎn)雜交的方法檢測細(xì)胞中HBV DNA復(fù)制程度，分別計(jì)算IC50及SI。試驗(yàn)結(jié)果見表1
表1本發(fā)明梔子提取物抗乙型肝炎病毒活性試驗(yàn)結(jié)果

注TC50對細(xì)胞半數(shù)有毒濃度；IC50對病毒半數(shù)抑制濃度；SI選擇指數(shù)，SI＝TC50/IC50。
試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明梔子提取物能夠有效的抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制。
試驗(yàn)例2本發(fā)明梔子提取物保護(hù)肝損傷作用試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、試驗(yàn)動物昆明種小鼠，雄性，體重20±2g，二級健康動物，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。
2、供試樣品本發(fā)明實(shí)施例1、2和3所制備的梔子提取物，分別編號為供試樣品1、2和3。
二、試驗(yàn)方法及結(jié)果取50只試驗(yàn)動物，按體重隨機(jī)分成五組，每組10只。不銹鋼籠籠養(yǎng)，每籠5只，自由取食2天后，于每天下午1:00灌胃給受試物，第1、2、3組每只分別灌胃0.1ml供試樣品1、2和3，第4組和第5組每組每只分別灌胃0.4ml生理鹽水，連續(xù)給藥5天，于末次給藥后2小時，第1、2、3和4組分別灌胃0.10％CCl4花生油0.4ml/只，第5組灌胃等體積的花生油，禁食不禁水，18h后摘除眼球采血制備血清，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。
全部數(shù)據(jù)結(jié)果均采用x±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。小鼠灌胃CCl4后血清轉(zhuǎn)氨酶和LDH活性極顯著地升高(P＜0.01)，表明肝細(xì)胞已受到破壞，胞內(nèi)酶大量溶出，而預(yù)先灌胃本發(fā)明梔子提取物則可極顯著地抑制CCl4所致的SGPT、SGOT、LDH的升高，并且隨著有效成分含量的加大，梔子提取物的抑制作用越強(qiáng)。
表2本發(fā)明梔子提取物保護(hù)肝損傷作用試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明梔子提取物對于肝損傷有顯著的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.梔子提取物在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途，其中，以重量份計(jì)，所述的梔子提取物含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，含梔子苷25％以上。
2.梔子提取物在制備治療肝損傷藥物中的用途，其中，以重量份計(jì)，所述的梔子提取物含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，含梔子苷25％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征是在制備抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征是以重量份計(jì)，所述的梔子提取物含總環(huán)烯醚萜苷70％以上，含梔子苷50％以上。
5.一種制備權(quán)利要求1或2梔子提取物的方法，包括以下步驟1).將梔子粉碎，用30-70％乙醇40-60℃浸泡，得浸提液；2).浸提液離心除渣，取上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)60-80％，沉淀，靜置，過濾除沉后回收乙醇至無醇味；3).用水稀釋，過弱極性大孔吸附樹脂柱，待全部通過樹脂柱后，再用上樣體積0.5-2倍量水沖柱，至流出液無色，繼續(xù)用20-50％乙醇沖柱，收集洗脫液，減壓濃縮回收乙醇即得梔子提取物。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是步驟1)中將梔子粉碎后用50％乙醇50℃浸泡兩次，每次3小時以上。
7.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是步驟2)中上清液減壓濃縮回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量達(dá)70％。
8.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是步驟3)中所述的弱極性大孔吸附樹脂柱選自AB-8大孔吸附樹脂、X-5大孔吸附樹脂或D101大孔吸附樹脂。
9.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是步驟3)中用水沖柱時，用上樣體積1倍量水沖柱；至流出液無色，繼續(xù)用30％乙醇沖柱。
10.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是步驟3)中將所得到的梔子提取物進(jìn)一步通過硅膠柱層析，用體積比為6-9∶1-4的氯仿與甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療慢性乙型肝炎并具有保護(hù)肝損傷作用的梔子提取物，該梔子提取物中含總環(huán)烯醚萜苷40％以上，含梔子苷25％以上。藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，該梔子提取物能夠有效的抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制，對于肝損傷也有顯著的保護(hù)作用。
文檔編號A61P31/00GK1981832SQ200510130550
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日
發(fā)明者趙世萍, 付桂香, 張德權(quán), 叢笑, 潘琳, 張嵐, 董晞, 張韞, 張遠(yuǎn)春 申請人:中日友好醫(yī)院