用于慢性乙型肝炎病毒感染的基于酵母的治療劑的制作方法

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用于慢性乙型肝炎病毒感染的基于酵母的治療劑的制作方法
【專利摘要】披露了用于治療和/或預(yù)防HBV感染及其癥狀的基于酵母的免疫治療組合物、乙肝病毒(HBV)抗原和融合蛋白，以及使用基于酵母的免疫治療組合物、HBV抗原和融合蛋白來預(yù)防性和/或治療性治療HBV和/或其癥狀的方法。
【專利說明】用于慢性乙型肝炎病毒感染的基于酵母的治療劑
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求下述各項(xiàng)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán):2011年2月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/442，204、2011年6月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/496，945和2011年7月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/507，361。美國臨時(shí)申請(qǐng)61/442，204、美國臨時(shí)申請(qǐng)61/496,945和美國臨時(shí)申請(qǐng)61/507，361各自的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。 [0003]序列表的引用
[0004]本申請(qǐng)含有通過EFS-Web以文本文件形式電子提交的序列表。該名為“3923-32-PCT_ST25”的文本文件的大小為476KB，2012年2月7日記錄。該文本文件所含的信息根據(jù)37CFR§ 1.52(e) (5)通過引用全部并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明一般地涉及用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫治療組合物和方法。
[0006]發(fā)明背景
[0007]乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝病毒家族的成員，是世界范圍內(nèi)急性和慢性肝炎的致病因素。HBV疫情在亞洲和非洲流行，HBV感染是中國的地方性流行病(Williams，R.(2006)，"Global challenges in liver disease^, Hepatology(Baltimore, Md.)44(3):521- 526)。已有超過20億人口感染該病毒，據(jù)估計(jì)全世界有3億5千萬慢性HBV感染個(gè)體(“Hepatitis B”，World Health Organization, 2009 ;“FAQ About Hepatitis B”，StanfordSchool of Medicine.2008-07-10)。感染途徑是通過血液和體液接觸，包括輸血和靜脈注射毒品、性傳播、咬傷和損口，以及垂直傳播(例如分娩)。
[0008]已發(fā)現(xiàn)的HBV根據(jù)其包膜蛋白內(nèi)的抗原表位確定有四種主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)。根據(jù)基因組中的核苷酸序列變異有八種不同基因型(A-H)?；蛐偷牟顒e影響著疾病的嚴(yán)重程度、病程和并發(fā)癥的可能性、對(duì)治療的響應(yīng)和對(duì)接種疫苗的可能響應(yīng)(Kramvis et al., (2005), Vaccine23(19):2409 - 2423;Magnius and Norder, (1995),Intervirology38(1-2):24 - 34)。
[0009]HBV的臨床潛伏期通常為2-3個(gè)月；約三分之二這些急性感染者無癥狀或只有輕度、亞臨床癥狀。其余三分之一的急性感染者可能出現(xiàn)黃疸、肝的炎癥、嘔吐、疼痛和/或輕度發(fā)熱，但在多數(shù)成年人中疾病最終消退，很少會(huì)導(dǎo)致肝衰竭。事實(shí)上，約95%的成年人能夠從HBV感染完全恢復(fù)，不會(huì)成為慢性感染。然而，約90%的嬰兒和25% -50%的1_5歲兒童會(huì)持續(xù)慢性感染 HBV (Centers for Disease Control and Prevention, 2010 年 9 月)。在童年成為慢性感染的個(gè)體約有25%、童年后成為慢性感染的約有15%會(huì)過早地死于肝硬化或肝癌，大多數(shù)慢性感染者在出現(xiàn)肝硬化或末期肝病之前仍然沒有癥狀(CDC，2010年9月)。每年全球有I百萬人(美國每年的死亡人數(shù)約2000-4000)死于慢性HBV感染。慢性感染者有升高的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平(肝損傷標(biāo)記物)、肝臟炎癥和/或肝活檢時(shí)可見的纖維化。對(duì)于那些發(fā)展為肝硬化的患者，5年生存率約50%。[0010]HBV感染及其治療通常是通過檢測(cè)病毒抗原和/或針對(duì)抗原的抗體來監(jiān)測(cè)。感染HBV后，第一個(gè)可檢測(cè)到的抗原是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，然后是乙型肝炎“e”抗原(HBeAg)。表明病毒清除的是血清中出現(xiàn)抗HBsAg和/或抗核心抗原(HBcAg)的抗體，又稱為血清轉(zhuǎn)換。大量研究表明在感染HBV的個(gè)體中病毒復(fù)制、血癥水平和發(fā)展為慢性感染狀態(tài)受到通過輔助性⑶4+ (Th)和⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)介導(dǎo)的HBV特異性細(xì)胞免疫的直接和間接影響。發(fā)展為慢性疾病的患者與消除了急性感染的患者相比，往往沒有、有較弱的或者狹隘的HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)。參見例如Chisari, 1997, J Clin Invest99:1472-1477;Maini et al., 1999, Gastroenterology117:1386-1396;Rehermann et al., 2005, Nat Rev Tmmunol2005;5:215-229;Thimme etal., 2001, J Virol75:3984-3987;Urbani et al., 2002, J Virol76:12423-12434;ffielandand Chisari, 2005, J Viro179:9369-9380;Webster et al., 2000, Hepatology32:1117-1124;Penna et al., 1996,J Clin Invest98:1185-1194;Sprengers et al.,2006,JHepatol2006;45:182-189。
[0011]用于預(yù)防HBV的疫苗從1980年代早期已有商品。目前的商品疫苗是沒有傳染性的亞基病毒疫苗，其提供純化的重組乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，在出生時(shí)即可開始給藥。該疫苗已經(jīng)有效地降低了常規(guī)給予疫苗的那些國家的感染發(fā)生率。雖然有幾項(xiàng)免疫療法正在開發(fā)中，包括各種HBV蛋白或抗原表位疫苗和細(xì)胞因子，目前美國沒有已被批準(zhǔn)的用于治療活性HBV感染的免疫療法。
[0012]目前HBV感染的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(SOC)療法主要包括抗病毒藥物，比如替諾福韋(tenofovir) {VIREAD?)、拉米夫定(Iamivudine) (EPIVIR?)、阿德福
韋(adefovir) (HEPSERA?)、替比夫定(telbivudine) (TYZEKA&)和恩
替卡韋(entecavir) (BARACLUDEli),以及干擾素a 2a和聚乙二醇干擾素
a2a(PEGASYSk)。這些藥物，特別是抗病毒藥物通常要長時(shí)間給藥(例如每日或者每
周給藥一到五年或者更久)，而且它們雖然能減慢或者終止病毒復(fù)制，但一般不能提供完全“愈合”或者消除病毒?；诟蓴_素的方法有毒性并且緩解率不太大。抗病毒療法能夠抑制病毒復(fù)制，比干擾素的耐受性好，但正如以上提到的，這些藥物一般無法徹底地治愈病毒，一些情況中不能達(dá)到長期緩解率。而且在一些病例中發(fā)展出了藥物抗性。例如，拉米夫定是一種強(qiáng)力的抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(Pol)的口服抗病毒藥物。因?yàn)槔追蚨軌虮惠^好地耐受，并且現(xiàn)在是非專利藥物，在發(fā)展中國家中它是HBV抗病毒療法的一個(gè)選項(xiàng)。然而，由Pol序列中的點(diǎn)突變?cè)斐傻拿磕?0%病毒抗性率限制了拉米夫定對(duì)HBV的用途。此外，HBV基因型之間對(duì)目前的抗病毒和干擾素治療的反應(yīng)效率不同(Cao, World Journal of Gastroenterology2009 ;15(46): 5761 - 9)，在一些患者中，由于乙型肝炎病毒DNA在感染被清除后仍能呆在體內(nèi)，有可能隨著時(shí)間病毒發(fā)生再次激活。
[0013]因此，雖然標(biāo)準(zhǔn)治療(SOC)療法對(duì)罹患慢性HBV的患者是目前最好的已被批準(zhǔn)的療法，治療時(shí)間長和治療方案的明顯副作用會(huì)導(dǎo)致不依從、減少劑量和停止治療，以及病毒逃避、病毒再活化和對(duì)療法仍然沒有響應(yīng)或者不能維持響應(yīng)的患者。因此，改進(jìn)的HBV感染治療方法是該領(lǐng)域中仍然需要的。[0014]發(fā)明概述
[0015]發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于治療和/或預(yù)防乙型肝炎病毒(HBV)感染和/或HBV感染癥狀的免疫治療組合物。所述免疫治療組合物包含:(a)酵母媒介物；和(b) —或多個(gè)HBV抗原。在一個(gè)方面中，HBV抗原被提供為一或多個(gè)融合蛋白，雖然也可以提供單蛋白HBV抗原。HBV抗原由下述構(gòu)成:(i) HBV表面抗原，其包含全長HBV大(L)、中(M)和/或小⑶表面抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域；(ii) HBV聚合酶抗原，其包含全長HBV聚合酶或其結(jié)構(gòu)域(例如逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域；(iii)HBV核心抗原或者HBV e-抗原，分別包含全長HBV核心蛋白和/或全長HBV e抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域；和/或(iv)HBV X抗原，其包含全長HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域。組合物能夠激發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)對(duì)抗組合物中的一或多個(gè)HBV抗原，和/或?qū)垢腥玖嘶蛘呖赡芨腥灸硞€(gè)體的乙型肝炎病毒HBV的一或多個(gè)抗原。
[0016]在本文描述的任何發(fā)明實(shí)施方案中，包括涉及免疫治療組合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述組合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列包括，但不限于SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:1USEQID NO: 15,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:23,SEQ DI N0:27或SEQ ID NO:31 所代表的氨基酸序列，或者來自另一 HBV毒株/分離株的對(duì)應(yīng)序列。HBV聚合酶的氨基酸序列包括，但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 32所代表的氨基酸序列，或者來自另一 HBV毒株/分離株的對(duì)應(yīng)序列。
[0017]在本文描述的任何發(fā)明實(shí)施方案中，包括涉及免疫治療組合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述組合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，作為HBV抗原或者用在本發(fā)明的融合蛋白或免疫治療組合物中的HBV表面抗原的氨基酸可以包括，但不限于 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 11 的位點(diǎn) 21-47、SEQID NO: 11 的位點(diǎn) 176-400、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9_407、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 6_257、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 6-257、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 92-343、SEQ ID NO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID N0:97、SEQ ID N0:10UW1690-338、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 7_254、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 1-399、或者 SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn)1-399,SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn)1-399,SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn)231-629、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 63-461、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 289-687、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)289-687、或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0018]在本文描述的任何發(fā)明實(shí)施方案中，包括涉及免疫治療組合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述組合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，作為HBV抗原或者用在本發(fā)明的融合蛋白或免疫治療組合物中的HBV聚合酶抗原的氨基酸可以包括，但不限于 SEQ ID N0:2 的位點(diǎn) 383-602、SEQ ID N0:6 的位點(diǎn) 381_600、SEQ ID NO: 10的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 453-680、SEQ ID NO: 14 的位點(diǎn) 370-589、SEQ IDNO: 18 的位點(diǎn) 380-599, SEQ ID NO:22 的位點(diǎn) 381-600, SEQ ID NO:26 的位點(diǎn) 380-599, SEQID N0:30 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 260-604、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 7_351、SEQID N0:40 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 260_604、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 346_690、SEQID NO:94 的位點(diǎn) 90-434、SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 339-566、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn) 255-482、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 250-477、SEQ IDNO: 109 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 642-869、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn)1-228,SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)位點(diǎn) 1_228、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 61-288、或者來自不同 HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0019]在本文描述的任何發(fā)明實(shí)施方案中，包括涉及免疫治療組合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述組合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，作為HBV抗原或者用在本發(fā)明的融合蛋白或免疫治療組合物中的HBV核心抗原的氨基酸可以包括，但不限于 SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:5 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 9 的位點(diǎn) 37-188、SEQ ID NO: 13 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID N0:17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:21 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408_589、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 605_786、SEQ ID NO:38的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ IDNO:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ ID N0:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483_634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579-761、SEQ IDNO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)688-869, SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0020]在本文描述的任何發(fā)明實(shí)施方案中，包括涉及免疫治療組合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述組合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，作為HBV抗原或者用在本發(fā)明的融合蛋白或免疫治療組合物中的HBV X抗原的氨基酸可以包括，但不限于 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 2-154、SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO:4 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 8 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84_126、SEQ ID NO: 12的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO: 16的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ IDNO:20的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:24的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:28的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:32的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 787_939、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 7_159、SEQ ID N0:92 的位點(diǎn)873-1025, SEQ ID NO: 96 的位點(diǎn) 90-242、SEQ ID NO: 100, SEQ ID N0:101 的位點(diǎn) 719-778、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 635-694、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 184-337、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn)521-674、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 582-641、SEQ IDNO: 124 的位點(diǎn) 810-869, SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 582-641, SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60, SEQID NO: 132的位點(diǎn)229-288,SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)1-60，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:⑴包含全長HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域的HBV X抗原；(ii)包含全長HBV大表面抗原(L)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域的HBV表面抗原，和(iii)包含全長HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域的HBV核心抗原。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，免疫治療組合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:(i)HBV X抗原，其含有的氨基酸序列與全長HBV X抗原的位點(diǎn)52-126至少80%相同；(ii)HBV表面抗原，其含有的氨基酸序列與全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同，和(iii)HBV核心抗原，其含有的氨基酸序列與全長HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。所述組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。
[0022]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV X抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60,SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630_689、SEQ ID NO: 122的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ IDN0:10MW16630-689、SEQ ID NO:4 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84_126、SEQ ID N0:8 的位點(diǎn)52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 16的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO:20的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ IDNO:24的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:28的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:32 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn)719-778、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 635-694、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 810-869、SEQ ID NO: 126的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 229_288、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 1-60，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè) 方面中，HBV X抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID N0:130的位點(diǎn) 1-60、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108的位點(diǎn)630-689、SEQ ID NO: 107的位點(diǎn)630-689、SEQ ID NO: 100，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0023]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 63-461、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 1-399、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399、SEQ IDNO: 114 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:1USEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:27,SEQ ID N0:3USEQ IDNO: 93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 1-399、SEQ IDNO: 126 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 231-629,SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 289-687,SEQID NO: 134的位點(diǎn)289-687，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 130的位點(diǎn)63-461、SEQ ID NO: 118的位點(diǎn)1-399、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399、SEQ IDNO: 114的位點(diǎn)1-399、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn)1_399，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。 [0024]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID N0:13(^Wl€462-643、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400_581、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31_212、SEQID N0:5 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO: 13 的位點(diǎn) 31_212、SEQ IDNO: 17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 21 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ IDN0:29的位點(diǎn)31-212、SEQ ID NO: 36 的位點(diǎn) 605_786、SEQ ID NO: 38 的位點(diǎn) 352_533、SEQ IDNO:39 的位點(diǎn) 160-341, SEQ ID NO: 41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQID N0:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 184_395、SEQID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578,SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579_761、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn)400-581, SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 132的位點(diǎn)688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 130的位點(diǎn)462-643、SEQ ID NO: 118的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ IDNO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0025]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白中HBV抗原從N到C端以下列順序排列:HBV X抗原、HBV表面抗原、HBV核心抗原。在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白中HBV抗原從N到C端以下列順序排列:HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV X抗原。
[0026]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列與選自SEQ IDNO: 130、SEQ ID NO: 122或SEQ ID NO: 150的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同，或者完全相同。
[0027]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 130。
[0028]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 150。
[0029]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID N0:122。在一個(gè)方面中，融合蛋白是下述序列從N到C端讀框內(nèi)融合的單個(gè)多肽:(I)SEQ ID N0:37的氨基酸序列；(2)蘇氨酸-絲氨酸的雙氨基酸連接肽；(3) SEQ ID NO: 122的氨基酸序列；和
(4)六氨基酸肽。
[0030]在發(fā)明的另一實(shí)施方案中，免疫治療組合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:(i)HBV大表面抗原(L)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域；和(ii)HBV核心蛋白或HBV e抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)，比如抗HBV大表面抗原(L)和/或HBV核心蛋白或HBV e抗原的免疫反應(yīng)。[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:(i) HBV表面抗原，其含有的氨基酸序列與全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同；和(ii)HBV核心抗原，其含有的氨基酸序列與全長HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。所述組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，構(gòu)成HBV抗原的是包含至少95%全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列融合了包含至少95%全長HBV核心蛋白或HBV e抗原的氨基酸序列。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，構(gòu)成HBV抗原的是包含至少95%全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列融合在包含至少95%全長HBV核心蛋白的氨基酸序列的N端。在一個(gè)方面中，構(gòu)成HBV抗原的是HBV大表面抗原(L)的氨基酸2-400 ;和包含HBV核心蛋白和部分HBVe抗原的HBV前核心蛋白的氨基酸31-212。
[0032]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9_407、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn) 1_399、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1_399、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 1_399、SEQ ID N0:3 或SEQ ID NO: 3 的位點(diǎn) 2-400、SEQ ID NO: 7 或SEQ ID NO: 7 的位點(diǎn) 2-400、SEQ ID NO: 11 或SEQID NO: 11 的位點(diǎn) 2-400、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 15 的位點(diǎn) 2_389、SEQ ID NO: 19 或 SEQID N0:19的位點(diǎn)2-399、SEQ ID NO: 23 或 SEQ ID NO: 23 的位點(diǎn) 2_400、SEQ ID NO: 27 或 SEQID NO:27 的位點(diǎn) 2-399、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:31 的位點(diǎn) 2-400、SEQ ID NO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 231-629,SEQ ID NO: 130的位點(diǎn) 63-461、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 289_687、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 289-687，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 118的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 114的位點(diǎn)1-399、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn)1_399，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0033]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID N0:118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408_589、SEQ IDNO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID N0:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:5 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQID NO: 13 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 21 的位點(diǎn) 31-212、SEQID N0:25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 605_786、SEQID NO: 38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO: 39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID N0:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ ID N0:95 的位點(diǎn) 90_271、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn)579-761、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 120的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID N0:132的位點(diǎn)688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 118的位點(diǎn)400-581、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn)400-581, SEQ ID NO: 114的位點(diǎn)400-581，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0034]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原由SEQ ID NO: 34的氨基酸9_589，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列構(gòu)成。在一個(gè)方面中，構(gòu)成HBV抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或者至少99% 相同、或完全相同:SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 34 的位點(diǎn) 9-589、SEQID NO: 112、SEQ ID NO: 114，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，HBV抗原由全長或接近全長的HBV大表面抗原(L)和全長或接近全長的HBV核心蛋白構(gòu)成。
[0035]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，任何一個(gè)融合蛋白可以包含SEQ ID NO:37的N末端氨基酸序列(附著在融合蛋白的N端)。在另一個(gè)方面中，任何一個(gè)融合蛋白可以包含選自SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N端氨基酸序列。在一個(gè)方面中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 151的氨基酸序列。
[0036]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 118。
[0037]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 151。
[0038]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)來自釀酒酵母的完整熱滅活酵母菌；和(b)所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID N0:34的氨基酸序列。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白。所述HBV抗原由下述構(gòu)成:⑴由全長HBV大(L)、中(M)或小(S)表面抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV表面抗原；(ii)由全長HBV聚合酶的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域或者HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV聚合酶抗原；(iii)由全長HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域或者全長HBV e抗原構(gòu)成的HBV核心抗原；以及(iv)由全長HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV X抗原。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原包含HBV大表面抗原(L)的前SI的肝細(xì)胞受體區(qū)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域和HBV小表面抗原(S)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域。
[0040]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:HBV大表面抗原(L)的前SI的全長肝細(xì)胞受體區(qū)的至少95%、全長HBV小表面抗原(S)的至少95%、HBVB聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少95%、全長HBV核心蛋白或HBV e-抗原的至少95%，以及全長X抗原的至少95%。在一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:HBV大表面抗原(L)，其包含HBV大表面抗原(L)中氨基酸120-368的至少95% ;HBV聚合酶的RT結(jié)構(gòu)域，其包含HBV聚合酶的RT結(jié)構(gòu)域中氨基酸453-680的至少95% ；HBV核心蛋白，其包含HBV核心蛋白中氨基酸37-188的至少95% ；和HBV X抗原，其包含HBV X抗原中氨基酸52-127的至少80%。在一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:HBV大表面抗原(L)的氨基酸21-47，包含前SI的肝細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域；HBV大表面抗原(L)的氨基酸176-400，包含HBV小表面抗原(S) ;HBV聚合酶的氨基酸247 - 691，包含逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域；HBV前核心蛋白的氨基酸31-212，包含HBV核心蛋白和一部分HBV e抗原；以及HBV X抗原的氨基酸2-154。在一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:與HBV大表面抗原(L)的氨基酸120-368至少95%相同的氨基酸序列；與HBV聚合酶的RT結(jié)構(gòu)域中氨基酸453-680至少95%相同的氨基酸序列；與HBV核心蛋白的氨基酸37-188至少95%相同的氨基酸序列；以及與HBV X抗原的氨基酸52-127至少80%相同的氨基酸序列。在一個(gè)方面中，HBV抗原經(jīng)過改造引入了一或多個(gè)表5中列出的T細(xì)胞表位，在此以SEQ ID NOs:42-88或者SEQ ID NOs: 135-140代表。在一個(gè)方面中，HBV大表面抗原(L)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列或者與SEQ ID N0:9795%相同的序列。在一個(gè)方面中，HBV聚合酶的RT結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO:98的氨基酸序列或者與SEQ ID NO:9895%相同的序列。在一個(gè)方面中，HBV核心蛋白包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或者與SEQ ID N0:9995%相同的序列。在一個(gè)方面中，HBV X抗原包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 10095%相同的序列。
[0041]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同。在一個(gè)方面中,HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 124的位點(diǎn)1-399、SEQ ID NO: 126的位點(diǎn)1-399、SEQID N0:132的位點(diǎn)289-687、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 289_687、SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 7,SEQID NO:1USEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:27,SEQ ID N0:3USEQID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQ ID NO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399、SEQID NO: 114 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 1-399、SEQID NO: 120 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 1-399、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 231-629、SEQ ID NO: 130的位點(diǎn)63-461，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0042]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:97,SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 1-249,SEQID NO: 109 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 11 的位點(diǎn) 21-47、SEQID NO: 11 的位點(diǎn) 176-400、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 6-257、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 6-257、SEQID NO:92 的位點(diǎn) 92-343、SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 90-338、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 7-254，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0043]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV聚合酶抗原由HBV聚合酶的RT結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn)642-869、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 1-228、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 61 - 288、SEQ ID NO: 107的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 250-477、SEQ IDN0:11(^W16250-477、SEQ ID NO: 2 的位點(diǎn) 383_602、SEQ ID NO: 6 的位點(diǎn) 381_600、SEQ IDN0:l(^Wlg381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 453_680、SEQ ID NO: 14 的位點(diǎn) 370-589、SEQ IDNO: 18 的位點(diǎn) 380-599, SEQ ID NO:22 的位點(diǎn) 381-600, SEQ ID NO:26 的位點(diǎn) 380-599, SEQID N0:30 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 260-604、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 7_351、SEQID N0:40 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 260_604、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 346_690、SEQID NO:94 的位點(diǎn) 90-434,SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 339-566,SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 255-482、SEQ ID N0:120的位點(diǎn)582-809、SEQ ID NO: 128的位點(diǎn)1-228，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0044]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與全長HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。在一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 132 的位點(diǎn) 688-869、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 688-869、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn)400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID N0:5 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 9 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 13 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID N0:17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:21 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 605_786、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 352_533、SEQ ID NO:39的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ IDNO:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 184-395、SEQID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578,SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579_761、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn)400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0045]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:99的位點(diǎn)、SEQ ID NO:9的位點(diǎn)37-188、SEQ ID NO: 101的位點(diǎn)567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483-634、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 478-629，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0046]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV X抗原由與全長HBV X抗原至少95%相同的氨基酸序列構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV X抗原與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:4、SEQID NO:8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 2-154、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:20、SEQID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 36 的位點(diǎn) 787-939、SEQ ID NO: 39 ^位點(diǎn) 7-159、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 873_1025、SEQ ID NO:96 的位點(diǎn) 90_242、SEQ ID NO: 106的位點(diǎn)184-337、SEQ ID NO: 106的位點(diǎn)521-674、或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0047]在一個(gè)方面中，HBV X抗原由與全長HBV X抗原位點(diǎn)52-126至少80%相同的氨基酸序列構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV X抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 810-869、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 582-641、SEQID NO: 132 的位點(diǎn) 229-288、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 1-60, SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn)630-689,SEQ ID N0:4 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84_126、SEQ ID NO:8 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO: 16 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:20的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84_126、SEQ ID NO:24的位點(diǎn)52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 28 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 32的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO: 101的位點(diǎn)719-778、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn)635-694、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60，或者來自不同 HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0048]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原具有的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 6-939、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 92-1025、SEQ ID NO: 101的位點(diǎn)90-778、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn)7-694，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0049]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO: 110,SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:132 或 SEQ ID NO:134。
[0050]任何一個(gè)融合蛋白可能在一個(gè)方面中包含選自SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:89或SEQ ID NO: 90的N端序列。
[0051]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 101 或 SEQ ID NO: 102。
[0052]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:⑴由HBV大(L)表面抗原的前SI的肝細(xì)胞受體區(qū)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域和HBV小表面抗原(S)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV表面抗原；(ii)由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV聚合酶抗原和(iii)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV核心抗原。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:HBV大表面抗原(L)的前SI的全長肝細(xì)胞受體區(qū)的至少95%、全長HBV小表面抗原的至少95%、HBV聚合酶的全長逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少95%,和全長HBV核心蛋白的至少95%。在一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:全長HBV大表面抗原(L)的至少95%、HBV聚合酶的全長逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少95%，和全長HBV核心蛋白的至少95%。
[0053]在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID N0:12(^Wl6l-399、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 231_629、SEQ ID NO: 112的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 118的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 6_257、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:11、SEQID NO: 11 的位點(diǎn) 21-47、SEQ ID NO: 11 的位點(diǎn) 176-400、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19、SEQID NO:23, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQ ID N0:36 的位點(diǎn) 6-257、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 92-343、SEQ ID NO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO:97, SEQID NO: 101 的位點(diǎn) 90-338,SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 7-254,SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 1-249,SEQID NO: 108 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 1-249、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 1-249、SEQID NO: 122 的位點(diǎn) 1-399, SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 1-399, SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 1-399, SEQID NO: 130 的位點(diǎn) 63-461、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 289-687、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 289-687，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0054]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，氨基酸序列of HBV聚合酶抗原與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 120的位點(diǎn)582-809、SEQ ID NO: 128的位點(diǎn)1-228、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn)250-477、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 260-604、SEQ ID NO:2 的位點(diǎn) 383-602,SEQ ID NO:6 的位點(diǎn) 381-600,SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 381-600,SEQ ID NO: 10的位點(diǎn) 453-680、SEQ ID NO: 14 的位點(diǎn) 370-589、SEQ ID NO: 18 的位點(diǎn) 380-599、SEQ IDNO: 22 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 26 的位點(diǎn) 380-599、SEQ ID NO: 30 的位點(diǎn) 381-600、SEQID NO:36 的位點(diǎn) 260-604、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:40 的位點(diǎn) 7-351、SEQID NO:92 的位點(diǎn) 346-690、SEQ ID NO:94 的位點(diǎn) 90-434、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO: 101的位點(diǎn) 339-566、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 255-482、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 582-809、SEQ IDN0:126 的位點(diǎn) 642-869、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 1_228、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 61-288，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0055]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ IDNO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605_786、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID N0:5 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37_188、SEQID N0:13的位點(diǎn)31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO: 21 的位點(diǎn) 31_212、SEQ IDN0:25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408_589、SEQ IDNO: 36 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO: 38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO: 39 的位點(diǎn) 160-341、SEQID NO:92 的位點(diǎn) 691-872,SEQ ID NO:95 的位點(diǎn) 90-27USEQ ID NO:99,SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483_634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579-761、SEQ IDNO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 688-869、SEQ IDNO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0056]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 6-786 或 SEQ IDNO: 41，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0057]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:⑴由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV聚合酶抗原；和(ii)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV核心抗原。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:與HBV聚合酶的全長RT結(jié)構(gòu)域至少95%相同的氨基酸序列，和與全長HBV核心蛋白至少95%相同的氨基酸序列。 [0058]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID N0:38 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:2 的位點(diǎn) 383_602、SEQ ID NO:6的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 453-680、SEQ IDNO: 14 的位點(diǎn) 370-589, SEQ ID NO: 18 的位點(diǎn) 380-599, SEQ ID NO: 22 的位點(diǎn) 381-600, SEQID NO: 26 的位點(diǎn) 380-599、SEQ ID NO: 30 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 36 的位點(diǎn) 260-604、SEQ ID N0:40 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 260_604、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 346-690、SEQ ID N0:94 的位點(diǎn) 90-434、SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 339_566、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn) 255-482、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 250-477、SEQ IDNO: 109 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 642-869、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn)1-228, SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 1-228、SEQ ID NO: 134 的位點(diǎn) 61-288，或者來自不同 HBV 株的對(duì)應(yīng)序列。
[0059]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:5的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37_188、SEQ ID NO: 13 ^位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:21 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:25 ^位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO:36的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ IDN0:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ ID N0:95 的位點(diǎn) 90_271、SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn)567-718,SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483-634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396_578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579_761、SEQ ID NO: 106的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ IDNO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn)400-581, SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581，SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581，SEQ IDNO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0060]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0061]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述構(gòu)成:(i)由HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV X抗原；和(ii)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV核心抗原。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原由下述構(gòu)成:與全長HBV X抗原至少95%相同的氨基酸序列，和與全長HBV核心蛋白至少95%相同的氨基酸序列。
[0062]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:5的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37_188、SEQ ID NO: 13 ^位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:21 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:25 ^位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO:36的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ IDNO:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ ID NO:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483_634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579-761、SEQ IDNO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0063]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV X抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 7-159、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 2-154、SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:4 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO:8 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO: 12的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO: 16的位點(diǎn)52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 20 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO: 24的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO:28的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ IDN0:32的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 787_939、SEQ ID N0:92 的位點(diǎn) 873-1025、SEQ ID NO: 96 的位點(diǎn) 90_242、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 719-778、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 635-694、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 184-337、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn)521-674、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 582-641、SEQ IDNO: 124 的位點(diǎn) 810-869、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60, SEQID N0:132的位點(diǎn) 229-288、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)1_60，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0064]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 39的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0065]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV大表面抗原(L)的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV表面抗原由全長HBV大表面抗原(L)的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少 99% 相同、或者完全相同:SEQ ID NO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 11 的位點(diǎn) 21_47、SEQ ID NO: 11 的位點(diǎn) 176-400, SEQ ID NO: 15, SEQID NO: 19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 9-407、SEQID NO:36 的位點(diǎn) 6-257、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 6_257、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 92_343、SEQ IDNO:93 的位點(diǎn) 90-488、SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 90_338、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn)7-254,SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn)1-249,SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 1-249,SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn)1-399,SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn)1-399,SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 1-399,SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn)1-399、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 231-629、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 63-461、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)289-687、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)289-687，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 93的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0066]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV聚合酶抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV聚合酶抗原由HBV聚合酶的全長逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同，或者完全相同:SEQ ID NO:40的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:94 的位點(diǎn) 90-434、SEQ ID NO:2 的位點(diǎn) 383-602、SEQ ID NO:6 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 10 的位點(diǎn) 453-680、SEQ ID NO: 14的位點(diǎn) 370-589、SEQ ID NO: 18 的位點(diǎn) 380-599、SEQ ID NO:22 的位點(diǎn) 381-600、SEQ IDNO: 26 的位點(diǎn) 380-599、SEQ ID NO: 30 的位點(diǎn) 381-600、SEQ ID NO: 36 的位點(diǎn) 260-604、SEQID N0:38 的位點(diǎn) 7-351、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 260_604、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 346_690、SEQID NO:98, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 339_566、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 255_482、SEQ ID NO: 107的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 250-477、SEQ IDNO: 110 的位點(diǎn) 250-477、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 582-809、SEQ ID N0:126的位點(diǎn)642-869、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 1_228、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 1-228、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)61-288，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 94的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0067]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV核心抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，HBV抗原由全長HBV核心蛋白的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID N0:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:5的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37_188、SEQ ID NO: 13 位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:21 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:25 位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO:36的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ IDNO:41 的位點(diǎn) 605-786,SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 691-872,SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483_634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579-761、SEQ IDNO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:95的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0068]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV X抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由全長HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面中，HBV抗原由全長HBV X抗原的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV X抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQID NO:96 的位點(diǎn) 90-242、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQID NO:4的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO:8的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO: 12的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO: 16的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO: 20 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84_126、SEQ ID NO: 24 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO:28 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO:32 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 787-939、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 7-159、SEQ IDNO:92 的位點(diǎn) 873-1025、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 719-778、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn) 635-694、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 184-337、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 521-674、SEQ IDNO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn)810-869、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60, SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)229-288、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)1_60，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。在一個(gè)方面中，蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:96的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0069]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含任意兩種、三種或四種以上或者本文其他地方描述的免疫治療組合物，特別是任意兩種、三種或四種以上描述的涉及單一 HBV蛋白的免疫治療組合物。
[0070]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)HBV表面抗原蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中每個(gè)HBV表面抗原來自不同HBV基因型。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。
[0071]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)HBV聚合酶蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中每個(gè)HBV聚合酶蛋白來自不同HBV基因型。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。
[0072]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中每個(gè)HBV X抗原來自不同HBV基因型。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。
[0073]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中每個(gè)HBV 核心蛋白來自不同HBV基因型。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由全長HBV核心蛋白的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸31-212構(gòu)成。在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型C ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型D ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型A ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型B。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸37-188構(gòu)成。在一個(gè)方面中，融合蛋白包含來自基因型A、基因型B、基因型C和基因型D的四個(gè)HBV核心蛋白。
[0074]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，任何一或多個(gè)HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:95的位點(diǎn)90-271、SEQ ID NO:1的位點(diǎn)31-212、SEQ ID N0:5 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37_188、SEQID NO: 13 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 21 的位點(diǎn) 31-212、SEQID N0:25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ ID NO:29 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408_589、SEQID NO: 36 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO: 38 的位點(diǎn) 352-533、SEQ ID NO: 39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID N0:92 的位點(diǎn)691_872、SEQ ID NO:99,SEQ ID NO: 101的位點(diǎn) 567-718、SEQ ID NO: 102 的位點(diǎn) 483-634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2-183、SEQ IDNO: 105 的位點(diǎn) 184-395、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579-761、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 112 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581，SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn)400-581，SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn) 630-811、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132的位點(diǎn)688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869、或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.在一個(gè)方面中，HBV抗原具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 105的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0075]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫治療組合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少兩個(gè)HBV核心蛋白和至少兩個(gè)HBV X抗原的融合蛋白，其中每個(gè)HBV核心蛋白來自不同HBV基因型，每個(gè)HBV X抗原來自不同HBV基因型。組合物引發(fā)HBV特異性免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型C ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型D ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型A ;在一個(gè)方面中，HBV基因型包括基因型B。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由全長HBV核心蛋白的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸31-212構(gòu)成。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸37-188構(gòu)成。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV X抗原由全長HBV X抗原的至少95%構(gòu)成。在一個(gè)方面中，每個(gè)HBV X抗原包含HBV X抗原的氨基酸52-127。
[0076]在一個(gè)方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQID N0:95 的位點(diǎn) 90-271、SEQ ID NO:1 的位點(diǎn) 31_212、SEQ ID NO:5 的位點(diǎn) 31_212、SEQ IDN0:9 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 37-188、SEQ ID NO: 13 的位點(diǎn) 31-212、SEQ IDNO: 17 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 21 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO: 25 的位點(diǎn) 14-194、SEQ IDNO:29 的位點(diǎn) 31-212、SEQ ID NO:34 的位點(diǎn) 408-589、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 605-786、SEQID NO: 38 的位點(diǎn) 352-53 3、SEQ ID NO: 39 的位點(diǎn) 160-341、SEQ ID NO:41 的位點(diǎn) 605-786、SEQ ID NO:92 的位點(diǎn) 691-872、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 567-718、SEQ IDN0:102 的位點(diǎn) 483-634、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 2_183、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 184_395、SEQID N0:105 的位點(diǎn) 396-578、SEQ ID NO: 105 的位點(diǎn) 579_761、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 2-183、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 338-520、SEQ ID NO: 107 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn)478-629, SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 478-629、SEQ ID NO: 112的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 114 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 116 的位點(diǎn) 400-581、SEQ IDNO: 118 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 120 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 400-581、SEQ ID NO: 128 的位點(diǎn)630-811, SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 462-643、SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn) 688-869、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)688-869，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列。
[0077]在一個(gè)方面中，HBV X抗原的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQID NO:96 的位點(diǎn) 90-242、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 12 的位點(diǎn) 2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQID NO:4的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO:8的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO: 12的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126、SEQ ID NO: 16的位點(diǎn)52-68接著是位點(diǎn)84-126,SEQ ID NO: 20 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84_126、SEQ ID NO: 24 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO:28 的位點(diǎn) 52-68 接著是位點(diǎn) 84-126,SEQ ID NO:32 的位點(diǎn) 52-68接著是位點(diǎn) 84-126、SEQ ID NO:36 的位點(diǎn) 787-939、SEQ ID NO:39 的位點(diǎn) 7-159、SEQ IDNO:92 的位點(diǎn) 873-1025、SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 101 的位點(diǎn) 719-778、SEQ ID NO: 102的位點(diǎn) 635-694、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 184-337、SEQ ID NO: 106 的位點(diǎn) 521-674、SEQ IDNO: 107 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 108 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 109 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 110 的位點(diǎn) 630-689、SEQ ID NO: 122 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 124 的位點(diǎn)810-869、SEQ ID NO: 126 的位點(diǎn) 582-641、SEQ ID NO: 130 的位點(diǎn) 1-60, SEQ ID NO: 132 的位點(diǎn)229-288、SEQ ID NO: 134的位點(diǎn)1_60、或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0078]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 106的氨基酸序列，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
[0079]在本文，包括上文或下文描述的任何實(shí)施方案中，涉及融合蛋白、HBV抗原，或者包含所述融合蛋白或HBV抗原的免疫治療組合物。在再一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白的N端可以附加額外的序列。在一個(gè)方面中，N端序列選自與SEQ ID NO:3795%相同的氨基酸序列、與SEQ ID N0:8995%相同的氨基酸序列或者與SEQ ID N0:9095%相同的氨基酸序列。在一個(gè)方面中，N端序列選自 SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:37 的位點(diǎn) 1_5、SEQ ID N0:89 或 SEQ IDNO: 90，或者來自不同HBV株的對(duì)應(yīng)序列.[0080]在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白由酵母媒介物表達(dá)。在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，酵母媒介物是完整酵母。所述完整酵母在一個(gè)方面中是被殺死的。在一個(gè)方面中，完整酵母被熱滅活。
[0081 ] 在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，酵母媒介物所來自的酵母屬選自:酵母菌屬、假絲酵母屬、隱球菌屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、裂殖酵母屬和耶氏酵母屬。在一個(gè)方面中，酵母媒介物來自酵母菌屬。在一個(gè)方面中，酵母媒介物來自釀酒酵母。
[0082]在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，組合物被配制用于給予受試對(duì)象或患者。在一個(gè)方面中，組合物被配制成通過注射給予受試對(duì)象或患者(例如經(jīng)胃腸外途徑，比如皮下或腹腔內(nèi)或肌內(nèi)注射)。在一個(gè)方面中，組合物在適合給予人的藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制。在一個(gè)方面中，組合物含有90%以上的酵母蛋白。在一個(gè)方面中，組合物含有90%以上的酵母蛋白，并且配制成給予患者。
[0083]在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白在酵母中沒有凝聚。在一個(gè)方面中，融合蛋白在酵母中不形成內(nèi)含體。在一個(gè)方面中，融合蛋白不在酵母中形成VLPs或其他大的抗原顆粒。在一個(gè)方面中，融合蛋白在酵母中形成VLPs或其他大的抗原顆粒。
[0084]在以上或者本文其他地方描述的任何發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，在一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型A。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型B。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型C。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型D。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型E。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型F。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型G。在另一個(gè)方面中，HBV序列來自HBV基因型H。在一個(gè)方面中，HBV序列來自任何以上提到的HBV基因型或者任何已知的HBV基因型或基因亞型的組合。
[0085]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及作為本發(fā)明免疫治療組合物一部分的以上描述的或者本文其他地方描述的任何融合蛋白。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白包含HBV抗原，所述HBV抗原選自，但不限于:(a)由HBV大表面抗原(L)、HBV核心蛋白和HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原；(b)由HBV大表面抗原(L)和HBV核心蛋白構(gòu)成的HBV抗原；(c)由HBV大表面抗原(L)的前SI的肝細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域、HBV小表面抗原(S)、HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域、HBV核心蛋白或HBV e抗原，以及HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原；(d)由HBV大表面抗原(L) ,HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域、HBV核心蛋白或HBV e抗原，以及HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原；(e)由HBV大表面抗原(L)、HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域和HBV核心蛋白構(gòu)成的HBV抗原；(f)由HBV聚合酶(RT結(jié)構(gòu)域)和HBV核心蛋白構(gòu)成的HBV抗原；(g)由HBVX抗原和HBV核心蛋白構(gòu)成的HBV抗原；(h)由HBV大表面抗原(L)的前SI的肝細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域、HBV小表面抗原(S) ,HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域，以及HBV核心蛋白或HBV e抗原構(gòu)成的HBV抗原；(i)由HBV大表面抗原(L)構(gòu)成的HBV抗原；(j)由HBV核心抗原構(gòu)成的HBV抗原；(k) HBV聚合酶，包括逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的HBV抗原；(I)由HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原；(m)由兩個(gè)到四個(gè)HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原、HBV核心抗原，或者HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原，其中所述兩個(gè)到四個(gè)HBV抗原來自不同HBV基因型；以及(η)由兩個(gè)HBV核心抗原和兩個(gè)HBV X抗原構(gòu)成的HBV抗原，其中兩個(gè)HBV核心抗原中的每一個(gè)或者兩個(gè)HBV X抗原中的每一個(gè)來自不同HBV基因型。以上描述了涉及各個(gè)HBV抗原(包括可用于這些抗原的多種序列)的發(fā)明方面。
[0086]在該發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列與選自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 151、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:120、SE Q ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:92,SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99, SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109 和 SEQ ID NO:110。
[0087]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼本文描述的任何一個(gè)融合蛋白的重組核酸分子。在一個(gè)方面中，所述重組核酸分子包含的核酸序列選自，但不限于:SEQ ID NO: 33、SEQ IDN0:35、SEQ ID N0:91、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ IDNO: 129、SEQ ID NO: 131 或者 SEQ ID NO: 133。
[0088]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的細(xì)胞，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染了本文描述的任何重組核酸分子。在一個(gè)方面中，細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
[0089]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及組合物，其包含本文描述的任何融合蛋白。發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及組合物，其包含本文描述的任何重組核酸分子。發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及組合物，其包含本文描述的任何分離的細(xì)胞。
[0090]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及治療受試對(duì)象中乙型肝炎病毒(HBV)感染或者至少一個(gè)由HBV感染導(dǎo)致的癥狀的方法，所述方法包括給予感染了 HBV的受試對(duì)象本文描述的任何免疫治療組合物中的至少一個(gè)，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物。給予受試對(duì)象所述組合物減少受試對(duì)象中的HBV感染或者至少一個(gè)由HBV感染導(dǎo)致的癥狀。
[0091]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及引發(fā)抗HBV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予受試對(duì)象本文描述的任何免疫治療組合物中的至少一個(gè)，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物。
[0092]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及防止受試對(duì)象中HBV感染的方法，所述方法包括給予還未感染HBV的受試對(duì)象本文描述的一或多個(gè)組合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物。
[0093]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及將一個(gè)群體免疫抗HBV，所述方法包括給予所述群體本文描述的一或多個(gè)組合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物。
[0094]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及本文描述的任何一或多個(gè)組合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物)用于治療HBV感染或其癥狀。
[0095]發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及本文描述的任何一或多個(gè)組合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物)用于預(yù)防HBV感染或其癥狀。
[0096]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及本文描述的任何一或多個(gè)組合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物)在制備治療HBV感染或其癥狀的藥物中的用途。
[0097]發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案涉及本文描述的任何一或多個(gè)組合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物)在制備預(yù)防HBV感染或其癥狀的藥物中的用途。
[0098]在涉及以上或者本文其他地方描述的發(fā)明方法或者用途的任何實(shí)施方案的一個(gè)方面中，方法可以包括給予本文描述的至少兩、三、四或更多個(gè)組合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治療組合物。在一個(gè)方面中，可以給予其他能夠預(yù)防或治療HBV感染的組合物或化合物(例如抗病毒化合物、干擾素、其他免疫治療組合物，或者它們的組合)。在一個(gè)方面中，各種組合物或化合物是同時(shí)給予個(gè)體的。在一個(gè)方面中，各種組合物或化合物是順序給予個(gè)體的。在一個(gè)方面中，各種組合物中的每一個(gè)是通過注射到個(gè)體的不同部位給予的。在一個(gè)方面中，本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物的單個(gè)劑量是每劑共40Y.U.-80Y.U.，等量地在個(gè)體的兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)不同部位給予。
[0099]在涉及以上或者本文其他地方描述的發(fā)明方法或者用途的任何實(shí)施方案的一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物導(dǎo)致受試對(duì)象中血清轉(zhuǎn)化或者提高了受試對(duì)象群體中的血清轉(zhuǎn)換率。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物減少血清HBsAg或者造成受試對(duì)象中血清HBsAg丟失或者提高受試對(duì)象群體中血清HBsAg丟失率。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物減少血清HBeAg或者造成受試對(duì)象中血清HBeAg丟失或者提高受試對(duì)象群體中血清HBeAg丟失率。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物減少受試對(duì)象中的HBV病毒負(fù)荷或者提高受試對(duì)象群體中HBV病毒負(fù)荷的減少率。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物造成受試對(duì)象感染細(xì)胞內(nèi)不能檢測(cè)到HBV DNA，或者造成受試對(duì)象群體中HBV DNA陰性率更高。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物減少了受試對(duì)象中的肝損傷或提高了肝功，或者減少了受試對(duì)象群體中的肝損傷率或提高了肝功好轉(zhuǎn)率。在一個(gè)方面中，給予受試對(duì)象組合物提高了受試對(duì)象或者受試對(duì)象群體中的ALT正常化。 [0100]在任何涉及本文描述的HBV抗原、融合蛋白、免疫治療組合物，或者任何使用本文描述的HBV抗原、融合蛋白、免疫治療組合物的方法的實(shí)施方案中，在一個(gè)方面中，組合物還包含至少一個(gè)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，或者與之聯(lián)用。在一個(gè)方面中，組合物還包含一或多個(gè)其他可用于治療HBV感染或緩解癥狀的化合物，或者與之聯(lián)用。在一個(gè)方面中，組合物還包含至少一個(gè)抗病毒化合物，或者與之聯(lián)用。在一個(gè)方面中，抗病毒是核苷酸類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。抗病毒化合物可以包括，但不限于替諾福韋、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、恩替卡韋以及它們的組合。在一個(gè)方面中，抗病毒化合物是替諾福韋。在一個(gè)方面中，抗病毒化合物是恩替卡韋。在一個(gè)方面中，組合物還包含至少一個(gè)干擾素，或者與之聯(lián)用。在一個(gè)方面中，干擾素是干擾素α。在一個(gè)方面中，干擾素是聚乙二醇干擾素a2a。在一個(gè)方面中，干擾素是干擾素入。
[0101]附圖簡述
[0102]圖1的示意圖顯示了乙型肝炎病毒基因組排列。
[0103]圖2的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0104]圖3的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/聚合酶/core/X融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0105]圖4的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV聚合酶/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0106]圖5的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV X/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0107]圖6的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV聚合酶融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0108]圖7的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/聚合酶/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0109]圖8的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/core/聚合酶融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0110]圖9的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/core/X融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0111]圖10的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/core/聚合酶/X融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0112]圖11的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV表面抗原/core/聚合酶融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0113]圖12的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV聚合酶/表面抗原/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。[0114]圖13的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV X/表面抗原/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0115]圖14的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV聚合酶/X/表面抗原/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0116]圖15的示意圖顯示了編碼用于本發(fā)明基于酵母的免疫治療組合物的HBV X/聚合酶/表面抗原/core融合蛋白的重組核酸分子基本結(jié)構(gòu)。
[0117]圖16的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了表達(dá)HBV表面抗原/Core融合蛋白的多個(gè)基于酵母的免疫治療組合物的表達(dá)情況(熱滅活的完整酵母)。
[0118]圖17的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了表達(dá)HBV表面抗原/Core融合蛋白的多個(gè)基于酵母的免疫治療組合物的表達(dá)情況(活的完整酵母)。
[0119]圖18的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了表達(dá)HBV表面抗原/聚合酶/Core/X融合蛋白的多個(gè)基于酵母的免疫治療組合物的表達(dá)情況。
[0120]圖19的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了表達(dá)HBV表面抗原/聚合酶/Core/X融合蛋白的多個(gè)基于酵母的免疫治療組合物的表達(dá)情況。
[0121]圖20的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了多個(gè)基于酵母的免疫治療組合物的表達(dá)情況，其表達(dá)包含表面-core融合蛋白(Sc)或表面-聚合酶_core_X融合蛋白(Sp)的HBV抗原。
[0122]圖21的Western印跡數(shù)碼圖像顯示了 HBV抗原的表達(dá)情況,所述抗原來自培養(yǎng)在UL2培養(yǎng)基中的基于酵母的HBV免疫治療組合物。
[0123]圖22的條形圖顯示了 HBV抗原的平均表達(dá)情況，所述抗原來自培養(yǎng)在UL2培養(yǎng)基或U2培養(yǎng)基中的多個(gè)基于酵母的HBV免疫治療組合物(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0124]圖23的圖形顯示了脾⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答S/Core抗原混合物或者II型MHC SAg模擬表位(mimetope)肽的增殖情況(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)，所述T細(xì)胞來自用表達(dá)HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治療產(chǎn)物免疫的小鼠。
[0125]圖24的圖形顯示了淋巴結(jié)T細(xì)胞應(yīng)答S/Core抗原混合物或者II型MHCSag模擬表位肽的增殖情況(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)，所述T細(xì)胞來自用表達(dá)HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治療產(chǎn)物免疫的小鼠。
[0126]圖25的圖形顯示了淋巴結(jié)T細(xì)胞應(yīng)答S/Core抗原混合物或者II型MHC SAg模擬表位肽的干擾素Y (IFN- Y) ELISpot反應(yīng)，所述T細(xì)胞來自用表達(dá)HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治療產(chǎn)物免疫的小鼠。
[0127]圖26的圖顯示了脾⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答S/Core抗原混合物或者II型MHCSAg模擬表位肽的增殖情況(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)，所述T細(xì)胞來自用表達(dá)HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Spex表示)的基于酵母的免疫治療產(chǎn)物免疫的小鼠。
[0128] 圖27的圖顯示了脾細(xì)胞中的IL-1 β產(chǎn)生情況，所述脾細(xì)胞來自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Pol-E/Core-X抗原(以Sp表示)，左欄；或者(b)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Core抗原(以Sc表示)(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0129]圖28的圖顯示了脾細(xì)胞中的IL_12p70產(chǎn)生情況，所述脾細(xì)胞來自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表示)，左欄；或者(b)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Core抗原(以Sc表示)(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0130]圖29A和29B的圖顯示了脾細(xì)胞中的干擾素Y (IFN- Y )產(chǎn)生情況，所述脾細(xì)胞來自用下述免疫的小鼠:(圖29A)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Core抗原(以Sc表示)或者(圖29B)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表不)(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0131]圖30A-D 的圖顯示了脾細(xì)胞中 IL-1 β (圖 30A)、IL_6(圖 30B)、IL_13(圖 30C)和IL-12p70(圖30D)的產(chǎn)生情況，所述脾細(xì)胞來自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表示)，左欄；或者(b)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物，其表達(dá)HBV表面-Core抗原(以Sc表示)。
[0132]圖31的條形圖顯示了用G1-13002或者G1-13002+抗CD40抗體，但沒有YVEC免疫的小鼠，引發(fā)了與用表達(dá)HBV抗原的EL4腫瘤攻擊時(shí)相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0133]圖32的條形圖顯示了 IFN-Y ELISpot檢測(cè)結(jié)果，該檢測(cè)比較了相對(duì)YVEC，用G1-13008 (SOTRE-C)和G1-13013 (SPEXv2)免疫的小鼠用各種HBV肽和抗原的T細(xì)胞反應(yīng)(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0134]圖33的條形圖顯示了對(duì)用G1-13002進(jìn)行的刺激的IFN-YELISpot反應(yīng)，所述G1-13002來自用預(yù)防性HBV疫苗免疫前和免疫后，以及給予強(qiáng)化劑后的人類受試對(duì)象。
[0135]圖34的條形圖顯示了淋巴結(jié)細(xì)胞的HBV抗原特異性IFN-Y ELISpot反應(yīng)，所述淋巴結(jié)細(xì)胞分離自用G1-13009 (SCORE-D)或G1-13020 (X-SCORE)免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，相對(duì)用酵母對(duì)照(YVEC)免疫的小鼠(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0136]圖35的條形圖顯示了脾細(xì)胞的HBV抗原特異性IFN-Y ELISpot反應(yīng)，所述脾細(xì)胞分離自用G1-13009 (SCORE-D)免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，相對(duì)用酵母對(duì)照(YVEC)免疫的小鼠(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)誤差)。
[0137]圖36的條形圖顯示了淋巴結(jié)細(xì)胞的HBV抗原特異性IFN-Y ELISpot反應(yīng)，所述淋巴結(jié)細(xì)胞分離自用G1-13009 (SCORE-D)或G1-13020 (X-SCORE)免疫的C57BL/6小鼠，相對(duì)用酵母對(duì)照(YVEC)免疫的小鼠或者初次試驗(yàn)小鼠(誤差條帶是標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0138]圖37的線形圖顯示了 C57BL/6小鼠中對(duì)I型MHC限制性HBV肽的HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，所述小鼠用G1-13009 (SCORE-D)或G1-13020 (X-SCORE)免疫，相對(duì)用酵母對(duì)照(YVEC)或基于酵母的免疫治療表達(dá)卵清白蛋白(OVAX)免疫的小鼠。
[0139]圖38的條形圖顯示了 C57BL/6小鼠中對(duì)II型MHC限制性HBV肽的HBV抗原特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，所述小鼠用G1-13009 (SCORE-D)或G1-13020 (X-SCORE)免疫，相對(duì)用酵母對(duì)照(YVEC)或基于酵母的免疫治療表達(dá)卵清白蛋白(OVAX)免疫的小鼠。
[0140]發(fā)明詳述
[0141]本發(fā)明一般地涉及用于防止和/或治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的組合物和方法。發(fā)明包括基于酵母的免疫治療組合物(又被稱為“基于酵母的HBV免疫療法”)，其包含酵母媒介物和HBV抗原，經(jīng)過設(shè)計(jì)能夠在個(gè)體中引發(fā)抗HBV感染的預(yù)防性和/或治療性免疫反應(yīng)；以及所述組合物在防止和/或治療HBV感染及其相關(guān)癥狀中的用途。發(fā)明還包括用于發(fā)明所述的基于酵母的組合物中的重組核酸分子，以及它們編碼的蛋白和融合蛋白在HBV感染的任何免疫治療組合物和/或任何治療性或預(yù)防性方案中的用途，包括任何結(jié)合了本發(fā)明的基于酵母的HBV特異性組合物和任何一種或多種其他HBV感染的治療性或預(yù)防性組合物、試劑、藥物、化合物和/或方案的治療性或預(yù)防性方案。
[0142]在各種免疫療法中，基于酵母的HBV特異性免疫治療組合物的獨(dú)特之處在于本發(fā)明的這些組合物能夠誘發(fā)特異性靶向HBV的先天性免疫反應(yīng)，以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括⑶4依賴性TH17和THlT細(xì)胞反應(yīng)和抗原特異性⑶8+T細(xì)胞反應(yīng)?；诮湍傅腍BV特異性免疫療法所引發(fā)的免疫反應(yīng)的廣度很適合靶向HBV。首先，據(jù)信HBV能夠通過“藏起來”，不誘發(fā)先天性反應(yīng)，因此在感染早期可以躲避先天性免疫反應(yīng)，而不是直接抵消先天免疫(Wieland and Chisari, 2005, J.Virol.15:9369-9380;ffieland, et al., 2004, PNASUSAlOl:6669-6674)。相應(yīng)地，可以預(yù)期如果通過另一種機(jī)制，即本發(fā)明的基于酵母的免疫治療組合物激活，HBV會(huì)對(duì)先天性免疫反應(yīng)敏感。第二，HBV在被感染的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生高水平的抗原表達(dá)，預(yù)計(jì)適應(yīng)性免疫反應(yīng)可以察覺到(Guidotti, et al.，1999，Science284:825-829; Thimme et al., 2003，J.Virol.77:68-76)，急性感染的清除與強(qiáng)力的 CD4.和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)(Maini et al., 1999, Gastroenterol.117:1386-1396; Rehermann etal.，1995，J.Exp.Med.181:1047-1058;Thimme et al.，2003，J.Virol.77:68-76;ffielandand Chisari,2005,J.Virol.15:9369-9380)。因此，預(yù)期基于酵母的HBV免疫療法通過激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)能夠有效地靶向HBV感染的細(xì)胞進(jìn)行破壞和/或有效地增強(qiáng)病毒清除。而且，基于酵母的免疫療法所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)被認(rèn)為既有干擾素獨(dú)立性也有干擾素依賴性(Tamburini et al., 2012, J.1mmunother.35 (I): 14-22);相應(yīng)地，個(gè)體對(duì)HBV 治療標(biāo)準(zhǔn)之一的基于干擾素的療法有或沒有響應(yīng)的能力相信不會(huì)直接影響受試對(duì)象對(duì)本發(fā)明基于酵母的免疫療法的響應(yīng)能力。此外，本文描述的基于酵母的HBV免疫療法組合物經(jīng)設(shè)計(jì)可以靶向HBV的免疫原性和保守性區(qū)域、多個(gè)CTL表位并且包括HBV中那些可能用于靶向規(guī)避的區(qū)域(允許根據(jù)需要對(duì)組合物進(jìn)行改進(jìn)以靶向這類規(guī)避突變)，使它成為一種能夠優(yōu)化抗該病毒的有效免疫反應(yīng)的高度適應(yīng)性HBV療法。
[0143]此外，盡管不被理論所約束，相信基于酵母的HBV免疫療法所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不僅能夠特異性地針對(duì)基于酵母的免疫治療產(chǎn)物所攜帶的靶抗原，還能發(fā)展成可以針對(duì)病毒上的其他免疫表位(即，酵母-抗原組合物帶有的那些之外的表位)。換句話說，對(duì)基于酵母的免疫治療組合物所含抗原和/或表位的初級(jí)細(xì)胞免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致次級(jí)細(xì)胞免疫反應(yīng)，所述次級(jí)細(xì)胞免疫反應(yīng)針對(duì)的抗原和/或表位是被治療受試對(duì)象的感染細(xì)胞中存在的，而基于酵母的免疫治療組合物中沒有的。這樣就發(fā)展出對(duì)每個(gè)被治療受試對(duì)象來說特有的復(fù)合體和無法預(yù)計(jì)的免疫反應(yīng)特性。這些次級(jí)免疫反應(yīng)對(duì)每個(gè)被治療受試對(duì)象的HBV感染分子譜是特異的。與其他治療方式，包括其他免疫治療平臺(tái)相比，基于酵母的免疫治療組合物可能以獨(dú)特的方式推動(dòng)這些下游效應(yīng)。這種現(xiàn)象還可以大概地稱為“表位擴(kuò)展”，代表著使用基于酵母的HBV免疫療法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭固囟℉BV抗原或者甚至抗特定HBV基因型的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)(例如，通過在酵母免疫治療組合物中提供抗原)預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)級(jí)聯(lián)靶向多種額外的HBV抗原，從而產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，能夠?qū)够诮湍傅拿庖咧委熃M合物中代表的那些抗原之外的來自不同HBV基因型或病毒株的抗原。
[0144]正如以上討論過的，變成慢性HBV感染的患者傾向具有較弱的(或沒有)和更狹隘的HBV特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。相應(yīng)地，本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物致力于解決治療活躍感染HBV的患者(包括慢性感染患者)所需要的治療組合物,并進(jìn)一步提供了防止HBV感染的再一種疫苗，其具有產(chǎn)生持久性記憶免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。的確，本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物預(yù)期能夠促進(jìn)抗HBV的持久性記憶T細(xì)胞反應(yīng)(可以預(yù)防感染)，并且提供了保護(hù)慢性感染患者不發(fā)生病毒再激活的長期益處?；诮湍傅腍BV免疫治療組合物作為單一療法或者與其他用于治療HBV的治療方法聯(lián)用(例如與抗病毒化合物聯(lián)用)預(yù)期可以提高慢性感染患者中的下述百分比:實(shí)現(xiàn)清除HBsAg和HBeAg的患者、實(shí)現(xiàn)完全血清轉(zhuǎn)化的患者和/或?qū)崿F(xiàn)在治療結(jié)束后保持病毒清除至少6個(gè)月的患者。
[0145]相應(yīng)地，為了將個(gè)體中的病毒負(fù)荷降低到免疫系統(tǒng)能更有效地處理的水平，可以將基于酵母的HBV免疫療法與抗病毒藥物和/或干擾素療法，和/或其他HBV療法聯(lián)用。HBV病毒效價(jià)一般非常高(可能有多達(dá)IO11肝細(xì)胞被感染)，因此可能戰(zhàn)勝個(gè)體發(fā)起有效CTL反應(yīng)的能力；相應(yīng)地，利用抗病毒藥物減少病毒負(fù)荷結(jié)合利用基于酵母的免疫療法減少HBV特異性CTL活性預(yù)計(jì)對(duì)被感染個(gè)體是有益的。此外，通過使用抗病毒藥物減少病毒負(fù)荷可能還可以減少在大量被感染肝細(xì)胞被靶向破壞的情況下免疫激活的任何副作用?；诮湍傅腍BV免疫療法預(yù)計(jì)還在減少和/或消除潛伏病毒感染的區(qū)室化中發(fā)揮作用。例如，通過PCR顯示有許多組織是HBV陽性的，這些組織被認(rèn)為是潛在的HBV再活化的庇護(hù)所。HBVDNA可以整合到宿主基因組中，使HBV能夠以休眠態(tài)持續(xù)存在，cccDNA是超卷曲的HBV基因組的主要形式，也對(duì)休眠有貢獻(xiàn)。不受到理論的約束，發(fā)明人相信本文描述的基于酵母的HBV免疫療法在消除所有這些類型的可能造成了目前抗病毒方法中看到的無病治愈率低的HBV “庇護(hù)所”中都有作用。
[0146]在另一種情形中，單獨(dú)使用或者與抗病毒或其他HBV療法聯(lián)合使用本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物，如果足夠?qū)崿F(xiàn)完全清除HBsAg，但不能實(shí)現(xiàn)抗HB產(chǎn)生，可以隨后使用或者進(jìn)一步聯(lián)用已有的預(yù)防性亞基疫苗來實(shí)現(xiàn)完全的血清轉(zhuǎn)化。替代地，本文描述的任何一個(gè)融合蛋白還可以作為亞基疫苗單獨(dú)地或者與本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物聯(lián)用，從而實(shí)現(xiàn)完全的血清轉(zhuǎn)化，或者保護(hù)受試對(duì)象免于HBV感染。最后，本發(fā)明的免疫治療組合物非常適于改造和/或與其他免疫治療組合物(包括本文描述的任何免疫治療組合物)聯(lián)用，用于治療抗病毒藥物處理引起的HBV的規(guī)避突變。
[0147]基于酵母的免疫治療組合物以生物學(xué)或藥學(xué)上可接受的組合物給予。相應(yīng)地，如本文描述的完整酵母媒介物必須適合，并且配制成適合對(duì)患者給藥，而不是將酵母作為抗原生產(chǎn)系統(tǒng)，然后從酵母中純化抗原。相反，現(xiàn)有的商品HBV疫苗以及許多開發(fā)中的HBV疫苗，包含在釀酒酵母中產(chǎn)生的隨后通過破壞和純化從酵母釋放的重組HBV蛋白(例如，HBsAg蛋白)，因此最終的結(jié)合了佐劑(例如羥基磷酸鋁硫酸鹽或氫氧化鋁)的疫苗不含可檢測(cè)得到的酵母DNA，并且含有不超過1-5%的酵母蛋白。而本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療組合物含有很容易檢測(cè)到的酵母DNA，并且含有遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于5%的酵母蛋白；通常本發(fā)明的基于酵母的免疫治療劑含有70%以上、80%以上或者一般是90%以上的酵母蛋白。
[0148]為了治療和/或預(yù)防目的，將基于酵母的免疫治療組合物給予患者以便對(duì)患者進(jìn)行免疫。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于酵母的組合物被配制成在藥學(xué)上可接受的賦形劑或制劑中給藥。在一個(gè)方面中，組合物應(yīng)當(dāng)配制成適合給予人類受試對(duì)象(例如，生產(chǎn)條件應(yīng)當(dāng)適合在人體中使用，用于完成組合物和/或制備免疫治療劑的給藥劑量的任何賦形劑或配方應(yīng)當(dāng)適合在人體中使用)。在發(fā)明的一個(gè)方面中，基于酵母的免疫治療組合物被配制成通過比如胃腸外途徑注射(例如通過皮下、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射，或者另一種合適的胃腸外途徑)給予患者或受試對(duì)象。
[0149]在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母表達(dá)抗原(例如,通過Western印跡可以檢測(cè)到的)，并且抗原不會(huì)在酵母中凝聚，抗原不會(huì)在酵母中形成內(nèi)涵體，和/或不會(huì)在酵母中形成很大的顆粒(VLPs)或其他大的抗原顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的抗原在酵母中是可溶性蛋白，和/或不從酵母中分泌出來，或者基本或主要不從酵母中分泌出來。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不被理論約束，本發(fā)明人相信本文中詳細(xì)描述的HBV融合蛋白中抗原(包括表面抗原和core抗原)的特定組合，可能還有抗原的排列會(huì)在表達(dá)抗原的酵母中形成VLPs或發(fā)生一定程度的凝聚。結(jié)果，酵母表達(dá)的抗原具有似乎與其整體結(jié)構(gòu)和形式有關(guān)的免疫原性特性，這與抗原內(nèi)帶有的免疫表位(例如，T細(xì)胞表位)的免疫原性特性是分開的特征。當(dāng)本發(fā)明的基于酵母的HBV免疫治療劑中提供了表達(dá)這種融合蛋白的酵母時(shí)，免疫治療組合物獲得了激活先天性免疫系統(tǒng)的性能，這不僅是如以上討論的來自酵母媒介物(象本文描述的所有基于酵母的免疫治療劑)，部分還來自融合蛋白的抗原結(jié)構(gòu)(例如，在酵母中表達(dá)的表面-core融合蛋白也具有類似佐劑的屬性)；此外，正如本文描述的所有基于酵母的免疫治療劑，免疫治療組合物由于融合蛋白(通過提供各種T細(xì)胞表位)獲得了以抗原特異性的方式激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的性能。這種特定的性能組合似乎是基于酵母的免疫治療劑特有的，其中所述免疫治療劑表達(dá)如文中所述的來自HBV的特定表面-core融合蛋白。但是，在本文描述的發(fā)明所有實(shí)施方案中，為了引發(fā)有效的抗HBV免疫反應(yīng)，基于酵母的免疫治療劑應(yīng)當(dāng)很容易被免疫系統(tǒng)的樹突狀細(xì)胞吞噬，酵母和抗原容易被這些樹突狀細(xì)胞加工。
[0150]本發(fā)明的組合物
[0151]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及基于酵母的免疫治療組合物，其可以被用于防止和/或治療HBV感染和/或緩解HBV感染導(dǎo)致的至少一個(gè)癥狀。所述組合物包含:(a)酵母媒介物；和(b) 一或多個(gè)包含HBV蛋白和/或其免疫原性結(jié)構(gòu)域的抗原。在聯(lián)合酵母媒介物的情況下，HBV蛋白最一般是由酵母媒介物(例如，由完整的酵母或酵母原生質(zhì)體酵母原生質(zhì)球，任選進(jìn)一步加工為酵母胞質(zhì)體、酵母空胞(yeast ghost)或者酵母膜提取物或其組分)表達(dá)為重組蛋白，雖然本發(fā)明的實(shí)施方案包括如文中所述將一或多個(gè)這種HBV蛋白加載到酵母媒介物中或者以其他方式與酵母媒介物一起復(fù)合化、附著、混合或者給藥以形成本發(fā)明的組合物。根據(jù)本發(fā)明，在與本發(fā)明的酵母媒介物相關(guān)提到“異源”蛋白或“異源”抗原，包括異源融合蛋白時(shí)，意味著所述蛋白或抗原不是酵母天然表達(dá)的蛋白或抗原，雖然包含異源抗原或異源蛋白的融合蛋白可能也包含酵母天然表達(dá)的酵母序列或蛋白或者它們的組分(例如，如本文描述的α因子前原序列)。
[0152]發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及各種HBV融合蛋白。在一個(gè)方面中，這種HBV融合蛋白可以用于本發(fā)明的基于酵母的免疫治療組合物中。這種融合蛋白，和/或編碼該蛋白的重組核酸分子還可以用于與不是基于酵母的免疫治療組合物聯(lián)用，或者用于產(chǎn)生不是基于酵母的免疫治療組合物，所述組合物包括，但不限于DNA疫苗、蛋白亞基疫苗、重組的基于病毒的免疫治療組合物、殺死的或滅活的病原體疫苗，和/或樹突狀細(xì)胞疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種融合蛋白可以用于HBV的診斷檢測(cè)和/或用于生成抗HBV的抗體。本文描述的示范性HBV融合蛋白提供了 HBV抗原選中的部分，例如聚合酶的選中部分和/或改造的聚合酶；表面抗原的選中部分和/或改造的表面抗原；核心的選中部分和/或改造的核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)；X抗原的選中部分和/或改造的X抗原；以及任何一、二、三或全部四種抗原(表面抗原、核心、X和聚合酶)的選中部分和/或排列，比如，但不限于表面抗原和核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)的選中部分和/或排列；表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)、聚合酶和X抗原的選中部分和/或排列；表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)和聚合酶的選中部分和/或排列；以及表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)和X抗原的選中部分和/或排列。
[0153]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的HBV抗原(包括全長蛋白的免疫原性結(jié)構(gòu)域)被融合到宿主蛋白上，所述宿主蛋白在HBV感染的宿主細(xì)胞中過表達(dá)，而在未感染的細(xì)胞中沒有過表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的HBV抗原(包括全長蛋白的免疫原性結(jié)構(gòu)域)被融合到蛋白R(shí)2上，所述R2是HBV復(fù)制所需要的宿主因子，在一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞中表達(dá)。R2是核糖核苷酸還原酶(RNR)的一個(gè)蛋白成分，對(duì)于HBV的生命周期非常關(guān)鍵(參見例如Cohen et al.，2010，Hepatol.51 (5): 1538-1546)。參照本文提供的公開，發(fā)明的其他實(shí)施方案是顯而易見的。
[0154]乙肝病毒、基因和蛋白。乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝病毒家族的成員，在人和大猩猩類人猿中導(dǎo)致暫時(shí)和慢性肝臟感染。感染哺乳動(dòng)物的嗜肝病毒具有相似的DNA序列和基因組安排，被劃分在正嗜肝病毒(Orthohepadnavirus)屬。乙型肝炎病毒顆粒的外被膜含有脂類和被稱為HBsAg的表面抗原。含有核心蛋白(HBcAg)的核殼體core包圍著病毒DNA和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。正如Seeger and Mason, 2000, Microbiol.Mol.Biol.Rev.64(1):51-68中綜述的，HBV具有一個(gè)3.2kb的部分雙鏈松弛環(huán)形DNA(rcDNA)基因組，當(dāng)病毒基因組被遞送到感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核時(shí)，被轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合的環(huán)形雙鏈DNA(cccDNA)分子。宿主細(xì)胞RNA聚合酶II由cccDNA轉(zhuǎn)錄出四個(gè)病毒RNAs，轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。所述病毒RNAs包括轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生病毒核心和被膜結(jié)構(gòu)蛋白以及前核心、聚合酶和X非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的mRNAs。被翻譯產(chǎn)生core和聚合酶的RNA還作為前基因組RNA (pgRNA)，是逆轉(zhuǎn)錄的模板。PgRNA和聚合酶被核心蛋白包裹，產(chǎn)生病毒核殼體，pgRNA在此被逆轉(zhuǎn)錄為rcDNA。然后含有rcDNA的核殼體被被膜蛋白封閉，從宿主細(xì)胞分泌出來成為成熟的病毒粒子或者被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核以便擴(kuò)增病毒cccDNA。
[0155]表1中顯示了 HBV基因組產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。部分雙鏈的HBV基因組含有被稱為C、X、P和S的四個(gè)基因(也可參見圖1)。
[0156]表1.HBV基因和基因產(chǎn)物
[0157]基因蛋白___
核心蛋白(HBcAg) 形成病毒衣殼，包圍著病毒pgRNA和聚合酶_
__E抗原(HBeAg)__功能未知；可能是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的HBV特異性免疫抑制因子

病毒DNA復(fù)制的聚合酶

結(jié)構(gòu)域1:末端蛋白(TP)結(jié)構(gòu)域，包裝PgRNA并引導(dǎo)負(fù)鏈DNA的
P聚合酶

合成
___結(jié)構(gòu)域2:逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域，RNase H；降解pgRNA_
S HBsAg (表面抗原；小)被膜蛋白，形成表面抗原顆粒；可能抑制免疫功能_
M HBsAg (表面抗原；中
, 被膜蛋白，與S—起形成表面抗原顆粒；可能抑制免疫功能S=前 S2 + S)__
L HBsAg (表面抗原；大被膜蛋白與S—起形成表面抗原顆粒；前SI結(jié)構(gòu)域在病毒被膜的組
__=前SI+前S2 + S) 裝過程中提供核心顆粒的配體；肝細(xì)胞受體；可能抑制免疫功能

轉(zhuǎn)錄反式激活；DNA修復(fù)途徑的調(diào)控；提高胞漿的鈣水平；蛋白
XJf (HBx)降解途徑的調(diào)制；在宿主細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖途徑的
__調(diào)制；HBV復(fù)制的刺激_
[0158]基因C編碼兩個(gè)密切相關(guān)的抗原:一個(gè)21-kDa，被稱為“核心蛋白”或“core抗原”(HBcAg)的蛋白，它能形成病毒衣殼；和17-kDa，被稱為e抗原(HBeAg)的蛋白，它能形成二聚體，但不會(huì)組裝成衣殼。全長核心蛋白是一個(gè)大概183個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含除了 N端10個(gè)氨基酸的整個(gè)e抗原，并在C端含有大約34個(gè)額外的氨基酸，這34個(gè)氨基酸在產(chǎn)生e抗原時(shí)被蛋白水解切割掉。換句話說，核心蛋白和e抗原有149個(gè)共有的氨基酸殘基(這個(gè)區(qū)段有時(shí)被稱為肝炎core抗原)，但N端和C端區(qū)域不同。前核心蛋白是一個(gè)前體蛋白，包含的氨基酸序列含有來自core和e抗原的序列，由該蛋白經(jīng)過蛋白水解加工產(chǎn)生e抗原。細(xì)胞內(nèi)的HBeAg包含前核心殘基_29到-1 (本發(fā)明書中的殘基編號(hào)是按照前核心蛋白內(nèi)的核心蛋白的第一個(gè)氨基酸殘基定義為位點(diǎn)“I”提供的)，這個(gè)區(qū)段含有信號(hào)序列，能夠引導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，氨基酸-29到-11在此被切割；位于氨基酸149和150之間的另一個(gè)蛋白水解切割去除了前核心的C端部分(存在于全長核心蛋白中)，然后剩下的HBeAg(由前核心的氨基酸-10到-1加上HBcAg或core的氨基酸 1-149 構(gòu)成)被分泌為 e 抗原(Standing et al., 1988, PNAS USA85:8405-8409; Ou etal., 1986, PNAS USA83:1578-1582;Bruss and Gerlich, 1988, Virologyl63:268-275;Takahashi et al.，1983，J.1mmunol.130:2903-2907)。在人血清中還發(fā)現(xiàn)了由整個(gè)前核心區(qū)域構(gòu)成的 HBeAg(Takahashi et al.，1992，J.1mmunol.147:3156-3160)。正如提過的，HBcAg (core)形成二聚體組裝成病毒衣殼,含有聚合酶和病毒DNA或pgRNA。HBeAg (e抗原)的功能未知，但它不是HBV復(fù)制或感染所必需的，被認(rèn)為是保護(hù)HBV對(duì)抗免疫系統(tǒng)攻擊的免疫抑制因子(Milich et al., 1990, PNAS USA87:6599-6603; Che et al.，2004，PNASUSA101:14913-14918;Wieland and Chisari, 2005, J.Virol.79:9369-9380) ? 為了清楚起見，在本文描述的HBV序列中(例如，見表3)，提供了來自代表性HBV基因型的前核心的序列，并在前核心序列中標(biāo)識(shí)了核心蛋白和e抗原的位點(diǎn)，其中前核心的第一個(gè)氨基酸被指定為位點(diǎn)I。
[0159]基因P編碼HBV DNA聚合酶(Pol)，該酶由兩個(gè)通過間隔區(qū)連接的主要結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。聚合酶的N端結(jié)構(gòu)域(又被稱為“末端蛋白”或TP)參與pgRNA的包裝和無義鏈DNA的合成引導(dǎo)。C端結(jié)構(gòu)域是具有RNase H(RH)活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。
[0160]基因S含有多個(gè)起始密碼子，編碼三個(gè)以S、M和L表示的被膜蛋白(文中還一般地稱為“表面蛋白”或“表面抗原”)，它們均是感染性病毒顆粒的成分，又被稱為Dane顆粒。S本身還與M和L 一起形成表面抗原顆粒(HBsAg)，該表面抗原顆粒會(huì)從被感染細(xì)胞大量分泌(Seeger and Mason, 2000, Microbiol.Mol.Biol.Rev.64 (I): 51-68; Beck, (2007),^Hepatitis B virus replication^, World Journal of Gastroenterology:WJG13(I):48 - 64)。M和L的密碼子分別位于S的起始密碼子上游大約165 (M)和489 (L)個(gè)核苷酸處。S或“小”表面抗原是表面抗原中最小和最豐富的一種。產(chǎn)生的抗該抗原的抗體代表被感染個(gè)體中的血清轉(zhuǎn)化。M或“中”表面抗原與S相比含有一個(gè)額外的蛋白結(jié)構(gòu)域，被稱為前S2，而L或“l(fā)arge”表面抗原特有的蛋白結(jié)構(gòu)域被稱為前SI (因此L也含有前S2和屬于M和S的其他序列)。前SI含有大概位于前SI的氨基酸位點(diǎn)21和47之間的病毒肝細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域(肝細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn))。前SI中的表位可以激發(fā)中和病毒的抗體。此外，前SI結(jié)構(gòu)域提供了病毒被膜組裝過程中核心顆粒的配體。表面抗原顆粒(HBsAg)可能還通過作為高劑量耐受原抑制免疫系統(tǒng)對(duì)感染細(xì)胞的清除(Reignat et al., 2002, J.Exp.Med.195:1089-1101;ffebster et al.，2004，J.Virol.78:5707—5719)。
[0161]基因X編碼的X抗原(HBx)(還稱為“X蛋白”)參與轉(zhuǎn)錄反式激活、DNA修復(fù)途徑的調(diào)控、提高胞漿的鈣水平、蛋白降解途徑的調(diào)制、在宿主細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖途徑的調(diào)制(Gearhart et al.，2010，J.Virol.)，這增強(qiáng)了對(duì)HBV復(fù)制的刺激。HBx 還與肝癌的進(jìn)展相關(guān)(Kim et al., Naturel991, 351:317-320; Terradillos etal., 0ncogenel997, 14:395-404)。
[0162]HBV是發(fā)現(xiàn)的四種主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)之一,這些血清型的確定是根據(jù)病毒被膜蛋白內(nèi)的抗原表位。根據(jù)基因組中的核苷酸序列變異共有八個(gè)不同的HBV基因型(A-H)。表 2 顯示了基因型的地理分布(Kramvis et al., 2005, Vaccine23 (19): 2409-2423;Magnius and Norder, 19 95, Intervirology38(1-2):24-34;Sakamoto et al., 2006, J.Gen.Virol.87:1873-1882; Lim et al.，2006，Int.J.Med.Sc1.3:14-20)。
[0163]表2
[0164]
HBV基因型j流行地理分布
HBV/A 美洲、歐洲、非洲、東南亞
HBV基因型流行地理分布
HBV/B亞洲(中國、日本、東南亞)、美國
HBV/C亞洲(中國、日本、東南亞)、美國
HBV/D 美國、地中海、中東和印度
HBV/E 撒哈拉以南非洲國家和西非
【權(quán)利要求】
1.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)具有與全長HBV X抗原第52至126位至少80%相同的氨基酸序列的HBV X抗原； (?)具有與全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的HBV表面抗原，和； (iii)具有與全長HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的HBV核心抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的免疫治療組合物，其中所述HBVX抗原的氨基酸序列與選自以下的氨基酸序列為至少95%相同:SEQ ID NO: 130的第1-60位、SEQ ID NO: 110的第630-689位、SEQ ID NO: 122 的第 582-641 位、SEQ ID NO: 107 的第 630-689 位、SEQ ID NO: 108 的第630-689 位、SEQ ID NO: 109 的第 630-689 位、SEQ ID NO:4 的第 52-68 位接著是第 84-126位、SEQ ID NO:8的第52-68位接著是第84-126位、SEQ ID NO: 12的第52-68位接著是第84-126 位、SEQ ID NO: 16 的第 52-68 位接著是第 84-126 位、SEQ ID NO:20 的第 52-68 位接著是第84-126位、SEQ ID NO:24的第52-68位接著是第84-126位、SEQ ID NO:28的第52-68位接著是第84-126位、SEQ ID NO:32的第52-68位接著是第84-126位、SEQ IDNO: 100、SEQ ID NO: 101 的第 719-778 位、SEQ ID NO: 102 的第 635-694 位、SEQ ID NO: 124的第 810-869 位、SEQ ID NO: 126 的第 582-641 位、SEQ ID NO: 132 的第 229-288 位、SEQ IDNO: 134的第1-60位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
3.權(quán)利要求1的免疫治療組合物，其中所述HBVX抗原的氨基酸序列選自:SEQ IDNO: 130 的第 1-60 位、SEQ ID NO: 110 的第 630-689 位、SEQ ID NO: 122 的第 582-641 位、SEQID NO: 109 的第 630-689 位、SEQ ID NO: 108 的第 630-689 位、SEQ ID NO: 107 的第 630-689位、SEQ ID NO: 100、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV表面抗原的氨基酸序列與選自以下的氨基酸序列為至少95%相同:SEQ ID NO: 130的第63-461位、SEQ ID NO: 118的第 1-399 位、SEQ ID NO: 122 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 34 的第 9-407 位、SEQ ID NO: 112 的第 1-399位、SEQ ID NO: 114 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 116 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 3、SEQID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQID NO:31、SEQ ID NO:93 的第 90-488 位、SEQ ID NO: 120 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 124 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 126 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 128 的第 231-629 位、SEQ ID NO: 132的第289-687位、SEQ ID NO: 134的第289-687位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV表面抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 130 的第 63-461 位、SEQ ID NO: 118 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 122 的第1-399 位、SEQ ID NO:34 的第 9-407 位、SEQ ID NO: 112 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 114 的第1-399位、SEQ ID NO: 116的第1-399位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV核心抗原的氨基酸序列與選自以下的氨基酸序列至少95%相同:SEQ ID NO: 130的第462-643位、SEQ ID NO:118的第400-581 位、SEQ ID NO: 122 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 34 的第 408-589 位、SEQ ID NO: 112的第 400-581 位、SEQ ID NO: 114 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 116 的第 400-581 位、SEQ IDNO:1 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 5 的第 31-212 位、SEQ ID NO:9 的第 31-212 位、SEQ IDNO: 13 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 17 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 21 的第 31-212 位、SEQ IDNO: 25 的第 14-194 位、SEQ ID NO: 29 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 36 的第 605-786 位、SEQID NO: 38 的第 352-533 位、SEQ ID NO: 39 的第 160-341 位、SEQ ID NO:41 的第 605-786 位、SEQ ID NO:92 的第 691-872 位、SEQ ID NO:95 的第 90-271 位、SEQ ID NO: 105 的第 2-183位、SEQ ID NO: 105 的第 184-395 位、SEQ ID NO: 105 的第 396-578 位、SEQ ID NO: 105 的第579-761 位、SEQ ID NO: 106 的第 2-183 位、SEQ ID NO: 106 的第 338-520 位、SEQ ID NO: 120的第 400-581 位、SEQ ID NO: 124 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 126 的第 400-581 位、SEQ IDNO: 128 的第 630-811 位、SEQ ID NO: 132 的第 688-869 位、SEQ ID NO: 134 的第 688-869 位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV核心抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 130 的第 462-643 位、SEQ ID NO: 118 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 122 的第 400-581 位、SEQ ID NO:34 的第 408-589 位、SEQ ID NO: 116 的第 400-581 位、SEQ IDNO: 112的第400-581位、SEQ ID NO: 114的第400-581位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 37的N末端氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述多個(gè)HBV抗原在所述融合蛋白中從N末端至C末端按下列次序排列:HBV X抗原、HBV表面抗原、HBV核心抗原。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含與選自SE10.QID NO: 130、SEQ ID NO: 150或SEQ ID NO: 122的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含選自SEQIDNO: 130、SEQ ID NO: 150 或 SEQ ID NO: 122 的氨基酸序列。
12.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)具有與全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的HBV表面抗原，和； (?)具有與全長HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的HBV核心抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
13.權(quán)利要求12的免疫治療組合物，其中所述HBV抗原由以下組成:包含至少95%的全長HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列與包含至少95%的全長HBV核心蛋白的氨基酸序列的N末端融合。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的免疫治療組合物，其中所述HBV表面抗原的氨基酸序列與選自以下的氨基酸序列至少95%相同:SEQ ID NO: 118的第1-399位、SEQ ID NO:34的第9-407位、SEQ ID NO: 116 的第 1-399位、SEQ ID NO: 112 的第 1-399位、SEQ ID NO: 114 的第 1-399 位、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 19,SEQID NO:23,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:93 的第 90-488 位、SEQ ID NO: 120 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 122 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 124 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 126的第 1-399 位、SEQ ID NO: 128 的第 231-629 位、SEQ ID NO: 130 的第 63-461 位、SEQ IDNO: 132的第289-687位、SEQ ID NO: 134的第289-687位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV表面抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 118 的第 1-399 位、SEQ ID NO:34 的第 9-407 位、SEQ ID NO: 112 的第1-399 位、SEQ ID NO: 114 的第 1-399 位、SEQ ID NO: 116 的第 1-399 位、或來自不同 HBV 株的相應(yīng)序列。
16.權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV核心抗原的氨基酸序列與選自以下的氨基酸序列至少95%相同:SEQ ID NO: 118的第400-581位、SEQ ID NO:34的第 408-589 位、SEQ ID NO: 116 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 112 的第 400-581 位、SEQ IDNO: 114 的第 400-581 位、SEQ ID NO:1 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 5 的第 31-212 位、SEQ IDNO:9 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 13 的第 31-212 位、SEQ ID NO: 17 的第 31-212 位、SEQ IDNO:21 的第 31-212 位、SEQ ID NO:25 的第 14-194 位、SEQ ID NO:29 的第 31-212 位、SEQID NO: 36 的第 605-786 位、SEQ ID NO: 38 的第 352-533 位、SEQ ID NO: 39 的第 160-341 位、SEQ ID NO:41 的第 605-786 位、SEQ ID NO:92 的第 691-872 位、SEQ ID NO:95 的第 90-271位、SEQ ID NO: 105 的第 2-183 位、SEQ ID NO: 105 的第 184-395 位、SEQ ID NO: 105 的第396-578 位、SEQ ID NO: 105 的第 579-761 位、SEQ ID NO: 106 的第 2-183 位、SEQ ID NO: 106的第 338-520 位、SEQ ID NO: 120 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 122 的第 400-581 位、SEQID NO: 124 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 126 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 128 的第 630-811位、SEQ ID NO: 130 的第 462-643 位、SEQ ID NO: 132 的第 688-869 位、SEQ ID NO: 134 的第688-869位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
17.權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述HBV核心抗原的氨基酸序列選自:SEQ ID NO: 118 的第 400-581 位、SEQ ID NO:34 的第 408-589 位、SEQ ID NO: 116 的第 400-581 位、SEQ ID NO : 112 的第 400-581 位、SEQ ID NO: 114 的第 400-581 位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
18.權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述多個(gè)HBV抗原由與選自以下的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列組成:SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 116, SEQ IDNO: 34的第9-589位、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114，或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
19.權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:37的N末端氨基酸序列。
20.權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:151或SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
21.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)由全長HBV大(L)、中(M)或?、潜砻婵乖闹辽僖粋€(gè)免疫原性域組成的HBV表面抗原； (?)由全長HBV聚合酶的至少一個(gè)免疫原性域或HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)域的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV聚合酶抗原；(iii)由全長HBV核心蛋白或全長HBVe抗原的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV核心抗原；以及 (iv)由全長HBVX抗原的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV X抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
22.權(quán)利要求21的免疫治療組合物，其中所述HBV抗原由與選自以下的氨基酸序列至少 95% 相同的氨基酸序列組成:SEQ ID NO: 134,SEQ ID NO: 132,SEQ ID N0:36 的第 6-939位、SEQ ID NO:92 的第 92-1025 位、SEQ ID NO: 101 的第 90-778 位、SEQ ID NO: 102 的第7-694位、SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:124、SEQ ID NO: 126，或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
23.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)由HBV大表面抗原(L)的pre-Sl的肝細(xì)胞受體區(qū)的至少一個(gè)免疫原性域和HBV小表面抗原(S)的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV表面抗原； (?)由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶域的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV聚合酶抗原；和 (iii)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV核心抗原。其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
24.權(quán)利要求23的免疫治療組合物，其中所述HBV抗原由與選自以下的氨基酸序列至少 95% 相同的氨基酸序列組成:SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 41 的第 6-786位、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
25.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)域的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV聚合酶抗原；和 (?)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV核心抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
26.權(quán)利要求25的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有與SEQID NO: 38的氨基酸序列或來自不同HBV株的相應(yīng)序列至少95%相同的氨基酸序列。
27.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由以下組成: (i)由HBV X抗原的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV X抗原；和 (?)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV核心抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
28.權(quán)利要求27的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含與SEQID NO: 39的氨基酸序列或來自不同HBV株的相應(yīng)序列至少95%相同的氨基酸序列。
29.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原選自下組: (i)由HBV大表面抗原(L)的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV表面抗原； (?)由HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶域的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV聚合酶抗原； (iii)由HBV核心蛋白的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV核心抗原；和 (iv)由全長HBVX抗原的至少一個(gè)免疫原性域組成的HBV X抗原；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
30.權(quán)利要求29的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含與以下氨基酸序列至少95% 相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:95、SEQID NO: 96、或來自不同HBV株的相應(yīng)序列。
31.權(quán)利要求29的免疫治療組合物，其包含免疫治療組合物的(i)、(ii)、(iii)或(iv)項(xiàng)中任意兩、三或四項(xiàng)。
32.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述多個(gè)HBV抗原由選自HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原、HBV核心抗原或HBV X抗原的兩種、三種或四種HBV抗原的至少一個(gè)免疫原性域組成，其中每種所述HBV抗原來自不同的HBV基因型；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
33.權(quán)利要求32的免疫治療組合物，其中所述HBV抗原由4種HBV核心抗原組成，且其中所述融合蛋白具有與SEQ ID NO: 105或來自不同HBV株的相應(yīng)序列至少95%相同的氨基酸序列。
34.免疫治療組合物，其包含: a)酵母媒介物；和 b)包含至少2種HBV核心蛋白和至少2種HBVX抗原的融合蛋白，其中所述每種HBV核心蛋白來自不同的HBV基因型，并且其中每種HBV X抗原來自不同的HBV基因型；其中所述組合物引發(fā)HBV特異性的免疫應(yīng)答。
35.權(quán)利要求34的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有與SEQID NO: 106或來自不同HBV株的相應(yīng)序列至少95%相同的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述融合蛋白由酵母媒介物表達(dá)。
37.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物是全酵母。
38.權(quán)利要求37的免疫治療組合物，其中所述全酵母被殺死。
39.權(quán)利要求37的免疫治療組合物，其中所述全酵母被熱滅活。
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
41.權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)的免疫治療組合物，其中所述組合物含有超過90%的酵母蛋白并且配制為通過注射來對(duì)患者施用。
42.免疫治療組合物，其包含: a)來自釀酒酵母的加熱滅活的全酵母；和 b)由所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 130。
43.免疫治療組合物，其包含: a)來自釀酒酵母的加熱滅活的全酵母；和 b)由所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 150。
44.免疫治療組合物，其包含: a)來自釀酒酵母的加熱滅活的全酵母；和 b)由所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 118。
45.免疫治療組合物，其包含: a)來自釀酒酵母的加熱滅活的全酵母；和 b)由所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 151。
46.免疫治療組合物，其包含: a)來自釀酒酵母的加熱滅活的全酵母；和 b)由所述酵母表達(dá)的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 34的氨基酸序列。
47.包含多個(gè)HBV抗原的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含一種與以下的氨基酸序列至少 95% 相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 118, SEQ IDNO:151，SEQ ID NO:34， SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:122，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:126，SEQID NO:128，SEQ ID NO:132，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ IDNO:116，SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ IDNO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:97，SEQ IDNO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:105，SEQID NO:106，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:109 和 SEQ ID NO:110。
48.編碼權(quán)利要求47的融合蛋白的重組核酸分子。
49.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子包含選自以下的核酸序列:SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113，SEQID NO:115，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:123，SEQ IDNO:125，SEQ ID NO:127，SEQ ID NO:129，SEQ ID NO:131 或 SEQ ID NO:133。
50.用權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的分離的細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
52.包含權(quán)利要求47的融合蛋白的組合物。
53.包含權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的重組核酸分子的組合物。
54.包含權(quán)利要求50或權(quán)利要求51的分離的細(xì)胞的組合物。
55.在受試者中治療乙肝病毒(HBV)感染或至少一種起因于HBV感染的癥狀的方法，包括對(duì)已被HBV感染的受試者施用至少一種依照權(quán)利要求0-0或0-0中任一項(xiàng)的組合物，其中對(duì)所述受試者施用組合物減輕了受試者中的HBV感染或至少一種起因于HBV感染的癥狀。
56.權(quán)利要求55的方法，其中對(duì)所述受試者施用所述組合物導(dǎo)致所述受試者中的血清轉(zhuǎn)化。
57.權(quán)利要求55的方法，其中對(duì)所述受試者施用所述組合物降低了所述受試者中的HBV病毒負(fù)載。
58.權(quán)利要求55的方法，其中對(duì)所述受試者施用所述組合物減少了所述受試者中的肝損傷。
59.權(quán)利要求55的方法，其還包括對(duì)所述受試者施用一種或多種另外的可用于治療或減輕HBV感染癥狀的化合物。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述化合物為抗病毒化合物。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述抗病毒化合物是核苷酸類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述抗病毒化合物選自下組:替諾福韋(tenofovir)、拉米夫定(Iamivudine)、阿德福韋(adefovir)、替比夫定(telbivudine)、恩替卡韋(entecavir)及其組合。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述抗病毒化合物是替諾福韋。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述化合物是干擾素。
65.引發(fā)針對(duì)HBV抗原的抗原特異性的、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)受試者施用至少一種依照權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物。
66.在受試者中預(yù)防HBV感染的方法，包括對(duì)尚未被HBV感染的受試者施用至少一種依照權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物。
67.針對(duì)HBV使一群個(gè)體免疫的方法，包括對(duì)所述個(gè)體群體施用至少一種依照權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物。
68.權(quán)利要求55-67中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括施用至少兩種依照權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物。
69.權(quán)利要求68的方法，其中同時(shí)對(duì)個(gè)體施用所述組合物。
70.權(quán)利要求68的方法，其中序貫地對(duì)個(gè)體施用所述組合物。
71.權(quán)利要求68的方法，其中通過注射到個(gè)體上的不同部位來施用所述每種組合物。
72.權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物，其用于治療HBV感染或其癥狀。
73.權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物，其用于預(yù)防HBV感染或其癥狀。
74.權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療HBV感染的藥物中的用途。
75.權(quán)利要求1-46或52-54中任一項(xiàng)的組合物在制備用于預(yù)防HBV感染的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K14/02GK103476426SQ201280018222
【公開日】2013年12月25日申請(qǐng)日期:2012年2月9日優(yōu)先權(quán)日:2011年2月12日
【發(fā)明者】D.阿佩里安, T.H.金, 郭志敏, C.科伊肖特申請(qǐng)人:全球免疫股份有限公司

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技術(shù)研發(fā)人員：D.阿佩里安;T.H.金;郭志敏;C.科伊肖特
技術(shù)所有人：全球免疫股份有限公司
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