專利名稱：用于多發(fā)性骨髓瘤的治療的aplidine的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及aplidine和類似物的在癌癥治療中、特別是在多發(fā)性骨髓瘤的治療中的用途。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤表現(xiàn)為從單一無性系得到的漿細胞的惡性增殖。術(shù)語多發(fā)性骨髓瘤和骨髓瘤可以互換使用。
漿細胞產(chǎn)生抗體，即通過血液移動以幫助身體去除有害物質(zhì)的蛋白質(zhì)。每種類型的漿細胞通過制造大量的一個類型的抗體而僅對一種特定物質(zhì)作出反應(yīng)。這些抗體發(fā)現(xiàn)并且抵抗那一種物質(zhì)。因為身體有許多類型的漿細胞，可以與許多種物質(zhì)反應(yīng)。當癌癥牽涉到漿細胞的時候，身體繼續(xù)產(chǎn)生越來越多的這些細胞。所有異常和所有完全相同的不需要的漿細胞被稱作骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞傾向于在骨髓中和骨的堅硬的外側(cè)部分中集中。有時它們僅聚集在一塊骨中而且形成單個塊(mass)或腫瘤，被稱作漿細胞瘤。然而，在大多數(shù)情況下，骨髓瘤細胞聚集在許多骨中，常常形成許多腫瘤而且引起其它問題。當這發(fā)生的時候，疾病被稱作多發(fā)性骨髓瘤(MM)。
因為患有MM的人有大量異常的相同漿細胞，同樣，他們有太多的一個類型的抗體。它的產(chǎn)物腫瘤和宿主對它作出反應(yīng)造成多種器官功能障礙和骨痛或骨折的癥狀、腎衰竭、易感性感染、貧血、高血鈣，而且有時有凝固異常情況、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和高粘度的血管表現(xiàn)。
MM是在西方世界中診斷出的列第二位的最普遍的血液學惡性腫瘤，僅在美國每年就有約15,000個新病例的發(fā)病率。不幸地，盡管在過去的約30年中非常努力地致力于對基于細胞毒性的化學治療的治療活性進行改進，MM目前仍被認為是不治之癥，而且MM病人的總存活數(shù)基本上在3-4年中依然沒有變化。重要地，MM診斷的中值年齡＜65歲，而且在診斷上超過1/3的MM病人＜55歲對于相對年輕的MM病人的這個實際的比例，MM的診斷表明，在恰好沒有其它的并存病的情況下，高度的可能性是，他們的總幸存者的壽命將比與其年齡匹配的非MM病人的平均預期壽命更顯著地短。
最近，在MM的治療處理中已經(jīng)有一連串重要的進步，就是2類新抗癌劑的抗-MM活性載入文獻，所述的2類新抗癌劑是沙利度胺(和它的免疫調(diào)節(jié)的衍生物)和蛋白酶體抑制劑。雖然這兩類試劑已經(jīng)顯示，在對常規(guī)的或以高劑量細胞毒素化學療法為基礎(chǔ)的用藥法的復發(fā)/頑固性的MM病人的處理中是有效的，但是顯著比例的MM病人新形成對那些新試劑的耐藥性，同時起始的反應(yīng)者(甚至那些實現(xiàn)了可耐受的完全緩解)可以最終復發(fā)。因此，為了進一步改善MM病人的結(jié)局和有希望去取得對這個目前不能治愈的瘤形成的高治愈率，迫切需要研制新類型的抗MM藥劑。
發(fā)明簡述我們已經(jīng)首次確定了aplidine具有非常有效的抗多發(fā)性骨髓瘤活性。
Aplidine(Dehydrodidemnin B)是從地中海海鞘Aplidiumalbicans中分離的環(huán)狀縮肽。
Aplidine作為在此處使用的術(shù)語aplidine也涵蓋任何藥學可接受的鹽、酯、溶劑合物、水合物或前體藥物化合物，在施用它們后能給接受者提供(直接或間接地)化合物aplidine。鹽和其它衍生物以及前體藥物的制備，可以采用本領(lǐng)域已知的方法實施。
Aplidine類似物包括在WO 02/2596中公開的化合物。
關(guān)于aplidine、Aplidine類似物、它們的用途、組成和合成的更多信息可以在專利申請WO 91/9485、WO 98/1352、WO 99/42125、WO0176616、WO 01/35974、WO02/30441和WO 02/2596中找到。我們通過特別參考這些PCT文本各自的內(nèi)容來引入它們。
已顯示Aplidine在體外和I期和II期臨床試驗中有與抗癌劑一樣有用的可能性。Aplidine具有幾種作用方式，包括阻斷VEGF分泌、抑制蛋白質(zhì)的合成和信號轉(zhuǎn)導以及誘導G1細胞周期停滯。在I/II期試驗中的劑量限制性毒性是肌肉毒性，伴隨值得注意的缺乏嚴重的骨髓抑制。
Aplidine顯示有效的抗人腫瘤固體細胞系，特別是抗IC50值分別在0.18nM和0.45nM上的非小細胞肺腫瘤和結(jié)腸腫瘤細胞的體外活性(Faircloth等，1995，Proceedings 8thECCO Congress，Paris，Abstractno。122，529；Lobo等，1997，Anticancer Res，17，333-336)。國立癌癥研究所(NCI)的人體外小組已證實對非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌細胞系的選擇性(Faircloth等，1996，Ann Oncol.，7，34)。
對這種海洋生物縮肽的初期研究提出抗鼠腫瘤(例如B16黑色素瘤)的體內(nèi)活性(Faircloth等，1995，Proceedings 8thECCOCongress，Paris，Abstract no。122，529)。而且，在生產(chǎn)人異種移植腫瘤的老鼠中進行的附加的活體內(nèi)研究，證實了抗乳房MX-1和結(jié)腸CX-1的活性(Faircloth等，1996，Ann Oncol.，7，34)。兒科的白血球過多癥的I期試驗已經(jīng)完成了(Jimeno J。et al.，2002，AnnOncol.，13(suppl。5)，Abst.65P)。最后顯示還證明了aplidine抵抗皮下植入的胃、前列腺和中空纖維的伯基特淋巴瘤人異種移植和膀胱癌的體內(nèi)抗腫瘤活性(Faircloth等，1999，Proc.Am.Assoc。CancerFees.，40，Abstract2612；Faircloth等，1998，Proc.Am.Assoc。Cancer Res.，39，Abstract 227)。
本發(fā)明涉及aplidine和類似物在治療多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及在治療多發(fā)性骨髓瘤中使用的包含aplidine或類似物和藥學上可接受的載體、運載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明進一步提供治療任何受多發(fā)性骨髓瘤侵襲的哺乳動物，特別是人類的方法，該方法包含施用治療上有效量的aplidine或類似物到患病個體。
另一方面本發(fā)明涉及aplidine或類似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供包含分離的容器的試劑盒，該分離的容器包含含有aplidine或類似物的藥物組合物和重建試劑。還提供了重建的方法。
附圖簡述

圖1.經(jīng)aplidine治療的MM細胞系小組的MTT比色法存活率試驗的結(jié)果圖2.Aplidine(20nM，48hrs)抵抗從多重耐藥的MM病人得到的原發(fā)MM腫瘤細胞樣品的體外活性圖3.原發(fā)MM腫瘤細胞(從多重耐藥的MM病人分離)與骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)的共培養(yǎng)不顯著減弱MM細胞對Aplidin的反應(yīng)性圖4.A)來自多重耐藥MM病人的原發(fā)MM腫瘤細胞的Aplidine治療(20nM，0-12hrs)阻止VEGF的分泌圖4.B)Aplidine(20nM，12hrs)通過原發(fā)MM腫瘤細胞、BMSCs，還通過共培養(yǎng)的MM細胞和BMSCs阻止VEGF分泌圖5.Aplidine使原發(fā)MM腫瘤細胞對阿霉素敏感圖6.Aplidine抑制培養(yǎng)中的抗多發(fā)性骨髓瘤的地塞米松(MM1.R)細胞的生長，與腸胃外路線一樣有效(MM1.S)圖7.Aplidine抑制Bcl-2過分表達的MM細胞的生長發(fā)明詳述盡管多發(fā)性骨髓瘤(MM)的治療處理近來有進展，但是當前不存在對于這種疾病的治愈性治療，該疾病是在西方世界中診斷出的列第二位的最普遍的血液學惡性腫瘤。鑒定具有抗MM活性的新治療劑，特別在復發(fā)或?qū)ΤＲ?guī)方法新療法和/或沒有最佳反應(yīng)的病人中仍然是迫切需要優(yōu)先考慮的。
我們發(fā)現(xiàn)了Aplidine(APL)，一種新的來源于海洋生物的縮肽，其在體外非常有效地對抗MM細胞。特別地，我們觀察到與臨床有關(guān)的APL濃度有對抗一大組人MM細胞系的活性，包括抗傳統(tǒng)的抗MM試劑(例如地塞米松、烷化劑、蒽環(huán)類抗生素)或新型抗MM試劑(例如沙利度胺、調(diào)節(jié)免疫的沙利度胺衍生物、蛋白酶抑制劑PS-341[bortezomib]、Apo2L/TRAIL)，或針對MM細胞的細胞過度表達的主要抗細胞凋亡調(diào)節(jié)劑的MM細胞系。MTT比色法存活率試驗顯示aplidine是普遍有效地對抗我們小組的細胞系，其IC50用量范圍為10nM或更少(對于壓倒性多數(shù)的這些MM細胞系)。重要地，通過APL的濃度觸發(fā)這有效的體外抗MM活性，所述APL的濃度是在這種試劑的I期臨床試驗在實體瘤中臨床上達到的。而且這些IC50值比得上這種試劑在大多數(shù)APL敏感的實體瘤模型中的體外活性。
進一步證實APL的在體外抗MM活性不是僅局限于一種細胞系模型，我們也試驗過APL對抗從對沙利度胺或它的類似物和/或蛋白酶體抑制耐藥的病人新分離的原發(fā)MM腫瘤細胞的影響。在來自MM病人(對于CD138+CD38+MM腫瘤細胞的純度＞90％)的10個原發(fā)腫瘤樣品的預試驗中，我們觀察到的aplidine的體外抗MM活性與從我們的細胞系小組的試驗獲得的結(jié)果一致?？偟膩碚f，aplidine對抗原發(fā)MM腫瘤樣品和MM細胞系的體外研究結(jié)果顯示，這種試劑可以有效地對抗寬廣范圍的MM細胞，包括那些直接生成或后天性的抵抗常規(guī)治療或其它有效抗MM活性的新試劑的MM細胞。
雖然細胞因子或細胞粘附介導的局部骨髓(BM)微環(huán)境(例如BM基質(zhì)細胞)的相互作用保護來自常規(guī)治療(例如地塞米松或細胞毒素化學療法)(refs)的MM細胞，但是APL能夠克服在MM細胞與BM基質(zhì)細胞的共培養(yǎng)模型中的這種保護效應(yīng)。
除此之外，通過在離體的共培養(yǎng)模型中的MM細胞或BM基質(zhì)細胞，APL使MM細胞對細胞毒素化學療法誘導的細胞死亡和促血管生成細胞活素(例如VEGF)的取消分泌敏感。這提示aplidine可以與常規(guī)的以細胞毒素化學療法為基礎(chǔ)的方案結(jié)合以達到增強的抗MM活性。對MM細胞與其它抗癌藥對APL的靈敏度模式的比較分析，顯示用APL處理的MM的劑量-反應(yīng)關(guān)系不同于那些與藥物給藥相關(guān)的劑量-反應(yīng)關(guān)系。這進一步支持通過與來自那些當前可以得到的抗MM藥物不同的分子機制介導APL的抗MM性質(zhì)的理念，而且還提示APL甚至可以有效地抗MM的亞型，所述亞型能對其它現(xiàn)在臨床研制中的新療法有抵抗力。這些發(fā)現(xiàn)與實體瘤的臨床試驗中APL的有利的安全圖譜相匹配。
對于本發(fā)明，aplidine的類似物可以用來代替APL，aplidine本身。典型的所述化合物是如WO0202596詳細說明的。本發(fā)明的化合物的例子包括在WO0202596中給出的優(yōu)選的化合物，而且我們特別引入該專利說明書優(yōu)選化合物的詳述和在WO0202596中給出的有關(guān)方面。更優(yōu)選地，類似物在結(jié)構(gòu)上接近aplidine，而且通常與aplidine在在一個氨基酸或末端側(cè)鏈方面不同。不同的氨基酸可以在分子的循環(huán)部分中或在側(cè)鏈中。所述化合物的許多例子在WO0202596中給出，而且它們是本發(fā)明使用的候選方案。
aplidine或類似物的藥物制劑可以通過任何適當?shù)耐緩嚼缤ㄟ^口腔(包括含服或舌下)、直腸、鼻、局部(包括含服、舌下或經(jīng)皮膚)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈注射或皮內(nèi))途徑以適合于施用。所述成分可以通過任何藥學領(lǐng)域已知的方法制備，例如通過采用將有效成分與載體或運載體(輔藥)締和而帶入。
包含aplidine或類似物的藥物組合物的例子，包括適合于靜脈內(nèi)施用組分的液體(溶液，混懸液或乳劑)，而且它們可能含有純粹的化合物或與其組合的任何載體或其它藥理學活性物質(zhì)。溶解的aplidine在熱應(yīng)激試驗和光應(yīng)激試驗條件下顯現(xiàn)實質(zhì)性降解，并且發(fā)展了凍干劑型，見WO99/42125引入此處作為參考。
可以通過靜脈輸注施用aplidine和類似物或本發(fā)明的組合物?？梢允褂米罡哌_72小時的輸液時間，更優(yōu)選1-24小時，最優(yōu)選約1小時，約3小時或約24小時中的任意一個。允許實現(xiàn)治療而不用在醫(yī)院過夜的短的輸液時間是特別需要的。然而，如果需要，輸液可能是大約24小時或甚至更長。輸液可以用變化的模式在適合的間隔實現(xiàn)，比如一周一次，每周兩次，或每周更多次數(shù)，任選地以典型一周的間隙重復每周。
在優(yōu)選的應(yīng)用方法中，在多個周期中完成給藥。在每個周期的第一周，給病人靜脈輸注本發(fā)明化合物，允許病人在剩余的周期痊愈。每個周期的優(yōu)選持續(xù)時間是1、3或4周中的任意一個；作為需要可以給出多個周期。在備選的給藥實驗設(shè)計中，比方說本發(fā)明的化合物每3周連續(xù)5天施用約1小時。其它方案可以被設(shè)計為可變的。
根據(jù)被治療病人個體的耐受性，實施劑量延遲和/或劑量減少對治療方案的調(diào)整。
雖然在上文中給出了對劑量的指導，但是化合物的適當劑量可以根據(jù)特定的組成、用法、和特定的部位、被治療的宿主和腫瘤而變化。其它因素像年齡、體重、性別、日常飲食、給藥的時間、排泄率、宿主的狀態(tài)、聯(lián)合用藥、反應(yīng)靈敏度和疾病的嚴重性將被考慮。給藥可以在最大耐受劑量之內(nèi)連續(xù)地或周期性地實現(xiàn)。進一步的關(guān)于施用aplidine的指導在WO01/35974中給出，其全文引入此處作為參考。
在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，Aplidine和類似物可以與其它藥物一起使用，以提供聯(lián)合治療。其它藥物可能構(gòu)成相同組合物的一部分，或作為分離的組合物提供，在同一時間或不同時間施用。
實施例統(tǒng)計分析通過雙向方差分析的檢驗，然后通過Duncan post hoc檢驗，來檢測統(tǒng)計學上的顯著性。在全部分析中，考慮P＜0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
實施例1MTT比色法存活率測定使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT；Sigma Chemical，St Louis，MO)比色測定，如前所述檢測細胞存活率(Mitsiades C.S.等Blood。2001，98，795-804；Mitsiades N.等ProcNatl Acad Sci USA 2002，99，14374-14379；Mitsiades N.等Blood.2003，101，2377-2380)。簡要地，在2.5％胎牛血清(FBS)和在終濃度為0-100nM的Aplidine或DMSO運載體對照的存在下，將70％-80％融合度的細胞鋪于48孔培養(yǎng)板上。在各處理結(jié)束時，將細胞用1mg/mL MTT在37℃培養(yǎng)4小時；然后在有力的移液管沖洗下加入異丙醇和1N HCl的混合物(23∶2，vol/vol)以溶解甲結(jié)晶。用630nm作為對照波長，在570nm測量有活力的細胞的染色吸光度(A)。將細胞的成活力估算成占未處理對照的值的百分數(shù)。全部的實驗至少被重復3次，而且在各個實驗中，各試驗條件至少在三份孔中被重復。記錄的數(shù)據(jù)是代表性實驗的平均值±標準偏差。
耐受藥物的MM細胞系和原發(fā)性MM腫瘤細胞的小組我們評估了藥物敏感的人MM細胞系和藥物耐受的人MM細胞系的小組中aplidine的活性，包括下列細胞系地塞米松(Dex)-敏感的MM-IS和Dex-抵抗的MM-1R細胞系(作為學術(shù)禮物由DrSteven Rosen惠贈，Northwestern University，Chicago，IL)；化學敏感的RPMI-8226/S細胞系和它們的阿霉素-(Dox6，Dox40)、美法侖(LR5)-和鹽酸米托蒽醌(MR20)-抵抗的亞系(作為學術(shù)禮物由Dr William Dalton惠贈，Lee Moffitt Cancer Center，Tampa，F(xiàn)L)；Dr H.A.Messner的OCI-My-5細胞(Ontario Cancer Institute，ON，Canada)；Dr T.Kishimoto的S6B45細胞(Osaka University，Osaka，Japan)；ARD，ARK和ARP-1細胞(Dr Nikhil Munshi惠贈，Dana-Farber Cancer Institute，Boston，MA)；OPM-1，OPM-6，K620和LP-1細胞(作為學術(shù)禮物由Dr Leif Bergsagel惠贈，CornellUniversity，New York，NY)；與從美國典型菌種收藏所(Rockville，MD)獲得的U266和NCI-H929細胞一樣。
從10名病人的骨髓(BM)抽吸物中分離原發(fā)性MM腫瘤細胞，上述病人對常規(guī)治療(以類固醇-和細胞毒素化學療法-為基礎(chǔ)的)和更多最近發(fā)展的抗MM試劑(例如沙利度胺或蛋白酶體抑制劑)有抵抗力。通過Ficoll密度離心開始處理BM抽吸物，通過CD138+選擇純化(通過流式細胞儀活化細胞分選(FACS)，或通過CD138+正向選擇使用免疫磁性分離)，采用如前所述的實驗設(shè)計(Mitsiades C.S.等Blood。2001，98，795-804)。在CD38+CD138+或CD38+CD45RA-細胞中，所有分選的腫瘤細胞樣品具有＞90％的純度。就在Aplidine治療之前，通過錐蟲藍排除法測定，所有原發(fā)腫瘤樣品被證實具有超過95％的成活力。將所有MM細胞系和病人MM細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco Laboratories，GrandIsland，NY)，培養(yǎng)基中添加了10％活性炭葡聚糖處理過的胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT)以及L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素(Gibco Laboratories)。
結(jié)果Aplidine抵抗藥物耐受性MM細胞系和原發(fā)腫瘤樣品的活性我們試驗了一大組人MM細胞系的體外活性，該MM細胞系包括對常規(guī)(例如地塞米松、烷化劑、蒽環(huán)類抗生素)或新型(例如沙利度胺、調(diào)節(jié)免疫的沙利度胺衍生物、Apo2L/TRAIL)抗MM試劑敏感或耐受的MM細胞。MTT比色法存活率測定(圖1)顯示，Aplidine普遍地有效對抗我們小組的細胞系，IC50用量(對于絕大多數(shù)這些MM細胞系)在10nM或更少的范圍(它對應(yīng)于臨床上可達到的aplidine的濃度，基于這種藥劑的I期試驗經(jīng)驗)。重要地，aplidine的這種體外活性比得上它在大多數(shù)aplidine敏感的實體瘤模型中的體外活性。使用分級簇分析和關(guān)聯(lián)性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)算法(relevance networkalgorithms)，我們比較了MM細胞對aplidine的敏感度與其它抗癌藥的比較的圖像，發(fā)現(xiàn)aplidine的劑量-反應(yīng)關(guān)系的圖像是清楚地與那些其它藥物不同的。
這個發(fā)現(xiàn)不但進一步支持通過與那些其它藥物不同的分子機制介導aplidine抗MM性質(zhì)的理念，而且提示APL甚至可以有效抵抗這種疾病的不同分子的亞型。
結(jié)果Aplidine的抵抗藥物耐受的原發(fā)MM腫瘤細胞的活性為了進一步證實APL的體外抗MM活性不只限于細胞系模型，我們也測試了APL對從耐沙利度胺或它的類似物和/或蛋白酶體抑制劑的病人新分離的原發(fā)MM腫瘤細胞的影響。在對來自MM病人的10個原發(fā)腫瘤樣品的初步試驗中(對于CD138+CD38+MM腫瘤細胞，純度＞90％)，我們獲得的Aplidine的體外抗MM活性與從我們的細胞系小組的試驗獲得的結(jié)果一致(圖2)。
總的來說，對aplidine抵抗原發(fā)MM腫瘤樣品和MM細胞系體外研究的結(jié)果表明，這種試劑可以有效地抗廣譜的MM細胞，包括那些新形成的或?qū)ΤＲ?guī)治療或其它具有有效抗MM活性的研究藥物獲得抗性的MM細胞。
實施例2對Bcl-2和組成型活化的Akt的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用編碼十四烷?；?組成型活化的)Akt或Bcl-2(UpstateBiotechnologies，Lake Placid，NY)的質(zhì)粒載體或用空(neo)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染MM-1S細胞，然后使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)操作，接著如前所述(Mitsiades C.S.等Oncogene。2002，21，5673-5683；Mitsiades N.等ProcNatlAcad Sci USA.2002，99，14374-14379)在包含G418的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
結(jié)果Aplidine克服Bcl-2或組成型活化的Akt抗細胞凋亡的影響因為Bcl-2和PI-3K/Akt級連反應(yīng)在MM和其它的瘤形成中藥物造成的細胞凋亡的調(diào)節(jié)中的作用，我們還表征了aplidine在用Bcl-2或十四烷?；腁kt構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MM-IS人MM細胞中的活性，與空載體轉(zhuǎn)染對照MM-1S細胞進行比較。我們觀察到Bcl-2-或myrAkt-轉(zhuǎn)染的細胞對aplidine的靈敏度低于空載體轉(zhuǎn)染的細胞(圖1)，提示Bcl-2的過度表達或Akt和它的下游效應(yīng)基因的組成型活化不足以克服aplidine的抗MM作用。
實施例3MM細胞與骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)的共培養(yǎng)測定在粘附到BMSCs的時候，MM細胞具有減少的對傳統(tǒng)的抗MM治療，例如地塞米松或細胞毒素化學療法(Chauhan D.等Blood.1996，87，1104-1112)的敏感性。這種形式的耐藥性被認為是在MM病人接受基于施用糖皮質(zhì)激素類和/或細胞毒素化學療法治療的時候，最后復發(fā)的主要原因。相比之下，在最近發(fā)展的MM的療法中，在化學抵抗型或激素抵抗型MM的病例中的抗腫瘤活性已經(jīng)藉由幾類藥品達到，例如蛋白酶體抑制劑(HideshimaT.等Cancer Res.2001，61，3071-3076)，其可以克服BMSCs對MM細胞的保護作用。所以我們研究了是否aplidine也可以克服BMSCs與MM細胞相互作用的分子的后遺癥，并且達到本文上下文中的抗MM活性。因此我們用如前所述的BMSCs進行了MM細胞的體外共培養(yǎng)測定將BMSCs在24孔培養(yǎng)板上生長融合。隨后用無血清培養(yǎng)基洗滌，將從3名MM病人分離的原發(fā)腫瘤細胞(在CD138+細胞中＞95％純度)加入到涂鋪了BMSCs的孔或如前所述的對照孔(Uchiyama H.等Blood.1993，82，3712-3720；Mitsiades N.等Blood。2003，101，4055-4062)，然后在存在或不存在aplidine的環(huán)境下培養(yǎng)48小時。進行流式細胞檢測分析以檢測有活力的MM細胞的CD138+群體并且將aplidine對MM細胞成活力的影響表示成存活的細胞數(shù)相對于各自的經(jīng)運載體處理的培養(yǎng)物的百分比表示。
結(jié)果Aplidine克服骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)對MM細胞的保護效應(yīng)來自我們的小組和其它研究者的先前的研究已經(jīng)顯示，細胞因子-或細胞粘附介導的局部骨髓(BM)微環(huán)境(例如BM基質(zhì)細胞)的相互作用可以保護MM細胞免受常規(guī)治療(例如地塞米松或細胞毒素化學療法)的影響(Chauhan D.等Blood。1996，87，1104-1112)。我們因此評價了Aplidine在MM細胞與BMSCs共培養(yǎng)的環(huán)境中的抗MM作用，而且使用流式細胞儀測定在MM細胞區(qū)域中的細胞死亡(圖3)，觀察到MM-BMSCs相互作用不顯著減弱aplidine的體外抗MM活性(aplidine劑量不顯著地影響B(tài)MSCs的存活率)。
實施例4VEGF分泌的定量BMSCs粘附到MM細胞誘導增強血管原細胞活素，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌，該事件被認為對于在BM環(huán)境中在MM細胞的位置上的新血管的補充具有重大意義。因此我們使用如前所述的MM細胞與BMSCs的體外共培養(yǎng)測定將BMSCs在24孔培養(yǎng)板上生長到鋪滿評價了是否aplidine可以通過MM和/或BMSCs來阻止VEGF的分泌。在用無血清培養(yǎng)基洗滌后，將從3名MM病人分離的原發(fā)腫瘤細胞(在CD138+細胞中＞95％純度)加入到涂鋪了BMSCs的孔或如前所述的對照孔(Uchiyama H.等Blood.1993，82，3712-3720；Mitsiades N.等Blood.2003，101，4055-4062)，然后在存在或不存在Aplidine的環(huán)境下培養(yǎng)12小時。收集上清液，然后使用商業(yè)上可得到的試劑盒(VEGF ELISA kit；R&D Systems)，依照制造廠商的技術(shù)說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定VEGF的濃度。
結(jié)果Aplidine減少MM/BMSCs分泌VEGF
已經(jīng)提出將VEGF作為在BM微環(huán)境中MM細胞增殖反應(yīng)推定的介質(zhì)。VEGF也是在腫瘤細胞生長的區(qū)域中腫瘤誘導的新血管補充的關(guān)鍵介質(zhì)。因為在先的報告提出對急性白血病細胞的aplidine治療導致VEGF分泌受到抑制，我們研究了是否Aplidine也可以通過MM細胞和/或通過BMSCs阻止VEGF的分泌。確實，使用aplidine(20nM)治療12小時能夠通過MM細胞阻止VEGF的分泌，以及抵消在MM細胞與BMSCs共培養(yǎng)時發(fā)生的VEGF分泌的增加(圖4A和4B)。
實施例5結(jié)果Aplidine使MM細胞對細胞毒素化學療法敏感使用MTT比色法存活率測定，我們發(fā)現(xiàn)當這個治療與Aplidine聯(lián)合的時候，MM細胞增強了對阿霉素的反應(yīng)性。圖5顯示通過用aplidine(2nM)進行治療，原發(fā)MM腫瘤樣品對阿霉素(10ng/mL)敏感的例子。
實施例6測試了Aplidine對抗在培養(yǎng)中建立的不同的細胞。
所使用的細胞是-多發(fā)性骨髓瘤細胞(MM1.S)-抗地塞米松的多發(fā)性骨髓瘤系(MM1.R)-過度表達Bcl-2的多發(fā)性骨髓瘤系對于已建立的細胞系，將細胞鋪于96孔培養(yǎng)板中而且允許在生長前24小時加入藥品。將細胞與藥物一起培養(yǎng)指定的時間，然后通過XTT或MTS試驗，使用自動平板讀數(shù)器測定細胞成活力。
這些研究的結(jié)果表示在圖6-7中。
權(quán)利要求
1.aplidine和aplidine類似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的aplidine或aplidine類似物的用途，其中所述的aplidine或aplidine類似物是aplidine。
3.根據(jù)前面任何權(quán)利要求的aplidine或aplidine類似物的用途，其中將aplidine或aplidine類似物與其它的藥或藥品或治療組合使用以提供聯(lián)合治療。
4.用于治療任何受多發(fā)性骨髓瘤侵襲的哺乳動物，特別是人類的方法，其包括對受侵襲的哺乳動物施用治療上有效量的aplidine或aplidine類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的aplidine或aplidine類似物是aplidine。
6.根據(jù)前面任何權(quán)利要求的方法，其中將aplidine或aplidine類似物與其它的藥或藥品或治療組合使用以提供聯(lián)合治療。
7.被用于治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物組合物，它包含aplidine或aplidine類似物和藥學上可接受的載體、運載體或稀釋劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述的aplidine或aplidine類似物是aplidine。
9.用于施用a plidine或aplidine類似物以治療多發(fā)性骨髓瘤的醫(yī)療試劑盒，其包括在分離的容器中包含aplidine或aplidine類似物的藥物組合物和重建劑。
全文摘要
Aplidine和aplidine類似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1761480SQ200480006724
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者J·R·伯蒂諾, D·梅蒂納, G·T·費爾克洛思, C·S·米特斯亞德斯, K·安德森, N·米特斯亞德斯 申請人:達納-法伯癌癥協(xié)會有限公司, 法馬馬有限公司