一種藥物組合物及其在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其藥效成分由表達(dá)SDF-1/HOXB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與CD34+造血干細(xì)胞（HSCs）組成。本發(fā)明構(gòu)建了腺病毒表達(dá)載體，分別表達(dá)SDF-1、HOXB4及其融合蛋白SDF-1/HOXB4，觀察表達(dá)SDF-1/HOXB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合臍血CD34+干細(xì)胞共移植對(duì)輻射損傷小鼠的影響，結(jié)果表明表達(dá)SDF-1/HOXB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）聯(lián)合臍血CD34+造血干細(xì)胞（HSCs）共移植能促進(jìn)造血重建及植入，提高移植成功率。
【專利說(shuō)明】一種藥物組合物及其在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物組合物，特別是一種治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells, HSCs)移植是治療血液病、惡性實(shí)體瘤放化療引起的骨髓造血功能障礙以及多種缺血性貧血的有效方法之一(Borhane G;MickieB.Transplantation of human hematopoietic repopulating cells:mechanismsof regeneration and differentiation using human—mouse xenografts.CurrentOpinion in Organ Transplantation.2008; 13 (I): 44-52.)。但移植后 HSCs 歸巢率低，且自我增殖能力有限，成為制約骨髓造血重建的瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)，隨著人們對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展，很多研究證實(shí)MSCs與HSCs聯(lián)合移植能促進(jìn)造血干細(xì)胞的植入和造血重建(Fliednei* TM，PowlesR，Sirohi B，et al.Radiologic and nuclear events: the METREP0L severity ofeffect grading system.Blood.2008;111 (12):5757-8 ； Isern J，Martin-AntonioBjGhazanfari R，et al.Self-Renewing Human Bone Marrow MesenspheresPromote Hematopoietic Stem Cell Expansion.LID-S2211-1247 (13)00165-4[pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041 [doi].Cell Rep.2013 ;Isern J，Martin-AntonioBjGhazanfari R，et al.Self-Renewing Human Bone Marrow MesenspheresPromote Hematopoietic Stem Cell Expansion.LID-S2211-1247 (13)00165-4 [pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041 [doi].Cell Rep.2013 ;賈新濤，穆媛媛，賈瀟瀟等.人臍血⑶34+細(xì)胞在N0D/SCID小鼠上有效重建造血系統(tǒng)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(11) ; 1136-1140.)。MSCs作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分能選擇性粘附并支持 HSCs 增殖和遷移(Le Blanc K，Samuelsson H，Gustafsson B，et al.Transplantationof mesenchymal stem celIs to enhanc`e engraftment of hematopoietic stemcells.Leukemia.2007; 21 (8): 1733-8)，在這個(gè)過(guò)程中趨化因子 SDF-1 及其受體 CXCR4對(duì)HSCs的歸巢和植入起到了重要的調(diào)節(jié)的作用，MSCs高表達(dá)的SDF-1能介導(dǎo)HSCs增殖和遷移，吸引其向骨髓回歸定植(Broxmeyer HE，Hangoc Gj Cooper S，et al.AMD3100and CD26 modulate mobilization, engraftment，and survival of hematopoieticstem and progenitor cells mediated by the SDF-1/CXCL12-CXCR4 axis.Ann N YAcad Sc1.2007; 1106:1-19.)。轉(zhuǎn)錄因子H0XB4對(duì)于調(diào)節(jié)HSCs自我更新與分化間的平衡起著重要作用，能夠有效地增強(qiáng)HSCs自我更新能力(Lu SJj Feng Qj Ivanova Y，etal.Recombinant HoxB4 Fusion Proteins Enhance Hematopoietic Differentiation ofHuman Embryonic Stem Cells.Stem Cells Dev.2007;16(4):547-60 ；Bonde Sj DowdenAM，Chan KMj et al.H0XB4 but not BMP4 confers self-renewal properties toES-derived hematopoietic progenitor cells.Transplantation.2008;86(12):1803—9 ;Tang Y，Chen J，Young NS.Expansion of haematopoietic stem cells fromnormal donors and bone marrow failure patients by recombinant hoxb4.Br JHaematol.2009; 144(4):603-12.)?，F(xiàn)有的研究結(jié)果提示通過(guò)轉(zhuǎn)入融合基因的MSCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，可以更加有效地在體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞，(張佩，陳婷婷，葉楓等.表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增及干性維持的作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2013.35 (7).589-594.)。但是H0XB4作為轉(zhuǎn)錄因子過(guò)高表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞其他生物學(xué)方面造成影響，提高H0XB4的表達(dá)水平可增強(qiáng)⑶34+細(xì)胞的增殖和自我更新，與此同時(shí)也減弱了細(xì)胞的短期分化能力(鐘波，葉楓，王濤等.不同活性的survivin基因啟動(dòng)子片段的克隆及鑒定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(11):1115-1118 ；BellΕ.Transplantation:Making space for HSCs.Nature Biotechnology.2008;8(I):4-5)。所以融合基因是否會(huì)對(duì)造血細(xì)胞自身特性或者分化能力造成影響，是否在體內(nèi)還能發(fā)揮同樣功能還需進(jìn)一步探討和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明兼顧了造血微環(huán)境重建過(guò)程中“趨化識(shí)別”和“自我更新”，將配體受體結(jié)合的特異性同干細(xì)胞移植治療促進(jìn)輻射后造血重建進(jìn)行組合，構(gòu)建了腺病毒表達(dá)載體，分別表達(dá)SDF-1、H0XB4及其融合蛋白SDF-1/H0XB4，觀察表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合臍血CD34+干細(xì)胞共移植對(duì)輻射損傷小鼠的影響，結(jié)果表明表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)聯(lián)合臍血⑶34+造血干細(xì)胞(HSCs)共移植能促進(jìn)造血重建及植入，提高移植成功率。
[0004]一種藥物組合物，其藥效成分由表達(dá)SDF-1 /H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與CD34+造血干細(xì)胞 (HSCs)組成。
[0005]所述表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與臍血⑶34+造血干細(xì)胞(HSCs)的細(xì)胞用量比為8:1。
[0006]所述⑶34+造血干細(xì)胞來(lái)源于臍血。
[0007]上述藥物組合物在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0008]所述骨髓造血功能障礙疾病由輻射引起。
[0009]本發(fā)明將表達(dá)SDF-1、H0XB4和SDF-1/H0XB4基因的3個(gè)腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染正常人骨髓MSCs，將其聯(lián)合臍血CD34+細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植到輻射損傷的N0D/SCID小鼠體內(nèi)(MSCs 8 X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只，CD34+1 X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)，分別為 SDF_l/MSCs+CD34+ 組(SDF-1組)、H0XB4/MSCs+CD34+ 組(H0XB4 組)、SDFl_H0XB4/MSCs+CD34+ 組(S-H 組)，另外 3 組為未轉(zhuǎn)染MSCs+CD34+組(MSC-HSC組)、單純CD34+組(HSC組)、單純輻照組(IR組)。檢測(cè)移植后各組小鼠存活率、外周血象恢復(fù)、骨髓病理變化及人源⑶45+細(xì)胞植入率。結(jié)果表明SDF-1組、H0XB4組、S-H組造血受抑較IR組輕，恢復(fù)快，存活率較IR組高(P〈0.05)。以S-H組促造血恢復(fù)作用顯著加強(qiáng)，且在移植后6周⑶45+細(xì)胞植入率(47.43±8.89%)較其余組高。這說(shuō)明表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)聯(lián)合臍血⑶34+造血干細(xì)胞(HSCs)共移植能促進(jìn)造血重建及植入，提高移植成功率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0010]圖1各組小鼠移植后不同時(shí)間骨髓組織病理學(xué)觀察
[0011]其中:A-F分別為IR組、HSC組、MSC-HSC組、SDF-1組、H0XB4組、S-H組移植后第14天(X400) ；G-K分別為HSC組、MSC-HSC組、SDF-1組、H0XB4組、S-H組移植后第21天(X400)
[0012]圖2.各組小鼠骨髓⑶45+細(xì)胞比例【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0014]材料與方法
[0015]I載體及試劑
[0016]分別表達(dá)SDF-1、H0XB4 及其融合蛋白 SDF-1/H0XB4 的 pAD-SDF-1-1RES-EGFP、pAD-H0XB4-1RES-EGFP、pAD-SDF-l-(GlySer) 3-H0XB4-1RES-EGFP 腺病毒載體由 申請(qǐng)人:構(gòu)建，可以對(duì)外發(fā)放。構(gòu)建方法見(jiàn)“張佩，陳婷婷，葉楓等.表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增及干性維持的作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2013.35
(7).589-594.”
[0017]培養(yǎng)基DMEM+10%胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，MACS磁性分離試劑盒購(gòu)自Miltenyi公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD45及對(duì)照IgG2b、IgGl購(gòu)自BD公司，淋巴細(xì)胞分離液TBD公司。
[0018]L 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本來(lái)源
[0019]N0D/SCID雌性小鼠118只，8~10周，體重約為18~22g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人臍血取自本院婦產(chǎn)科健康孕婦足月順產(chǎn)嬰兒臍帶，每人采集量60~90ml。骨髓取自本院血液科門診骨髓檢查無(wú)異?；颊?，每人采集2~4ml。所有標(biāo)本采集均獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人及家屬同意。
[0020]1.3細(xì)胞分離和培養(yǎng)
[0021 ] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按密度梯度離心法分離，方法見(jiàn)(.TunR S，PanchalinRamKM.Rosenberg L.et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells indefined serum-free media [J].Stem Cells International.Volume 2012 (2012),do1:10.1155/2012/123030.鐘波，葉楓，王濤等.不同活性的survivin基因啟動(dòng)子片段的克隆及鑒定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33 (11):1115-1118.培養(yǎng)至第3代，0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)備用。將人臍血標(biāo)本按照骨髓密度梯度離心法進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離，利用MASC磁珠系統(tǒng)進(jìn)行CD34+細(xì)胞純化，細(xì)胞過(guò)柱2次備用。(上述細(xì)胞分離和培養(yǎng)的詳細(xì)方法見(jiàn)“張佩，陳婷婷，葉楓等.表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增及干性維持的作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2013.35 (7).589-594.”)
[0022]1.4實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)
`[0023]所有小鼠接受60Co Y射線3.5Gy全身輻照，將小鼠按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)每組各12只分為:①SDF-l/MSCs+CD34+組(SDF-1組):福照后12小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈分別輸入SDF-1/MSCs (8 X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)、CD34+ 細(xì)胞(I X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)H0XB4/MSCs+CD34+ 組(H0XB4組):H0XB4/MSCs (8 X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)、CD34+ 細(xì)胞(I X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)；? SDF1-H0XB4/MSCs+CD34+ 組(S-H 組):SDFl_H0XB4/MSCs (8 X IO5 個(gè)細(xì)胞 / 只)、CD34+ 細(xì)胞(I X IO5 個(gè)細(xì)胞/只);④普通MSCs+CD34+組(MSC-HSC組):未轉(zhuǎn)染MSCs (8 X IO5個(gè)細(xì)胞/只)、CD34+細(xì)胞(IX IO5個(gè)細(xì)胞/只);⑤單純CD34.組(HSC組):CD34+細(xì)胞(IX IO5個(gè)細(xì)胞/只);⑥單純輻照組(IR組)，0.3ml生理鹽水。
[0024]1.5動(dòng)態(tài)觀察小鼠一般狀況及血象、骨髓組織恢復(fù)情況
[0025]每日觀察各組小鼠(n=12)外表、活動(dòng)力、飲食、排糞等情況并測(cè)量體質(zhì)量，記錄各組存活率。于移植后第7、14、21、28天各組小鼠行斷尾采血，測(cè)定白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板水平。第14、28天各組分別脫頸處死小鼠2只，行瑞氏染色觀察骨髓細(xì)胞學(xué)學(xué)變化。
[0026]1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠人源⑶45+細(xì)胞植入率
[0027]于移植后第6周脫頸處死一只小鼠，生理鹽水沖出小鼠脛骨、股骨骨髓。制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，用鼠抗人FITC標(biāo)記的⑶45抗體與細(xì)胞懸液避光孵育，PBS洗滌后流式檢測(cè)。
[0028]1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0029]計(jì)量資料以f:t S表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各時(shí)間點(diǎn)血液指標(biāo)比較采用單因素方差分析，方差齊性事后檢驗(yàn)采用SNK方法分析，方差不齊事后檢驗(yàn)采用Games-Howell方法分析。各組存活率比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平P〈0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0030]2 結(jié)果
[0031]I 一般狀況觀 察及小鼠存活率
[0032]各組小鼠在照射后24h均出現(xiàn)被毛凌亂、活動(dòng)減少、拒食，以后體重逐漸下降。至照后21d時(shí)，IR組小鼠全部死亡。移植各組小鼠在移植后7~10d，活動(dòng)、進(jìn)食及飲水量逐漸增加，體質(zhì)量開(kāi)始恢復(fù)。至第14天，各組小鼠存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05，表1)。其中，S-H組(100%)、SDF-1組(83%)、H0XB4組(75%)與IR組(25% )小鼠存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且S-H組與HSC組、MSC-HSC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05，表2)。至第28天，各組小鼠死亡率差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05，表1)，其中S-H組、SDF-1組、H0XB4組分別與IR組、HSC組小鼠存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且S-H組與MSC-HSC組小鼠存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05，表2)。
[0033]表1各組小鼠存活率比較
【權(quán)利要求】
1.一種藥物組合物，其藥效成分由表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與⑶34+造血干細(xì)胞(HSCs )組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述表達(dá)SDF-1/H0XB4融合基因的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與臍血CD34+造血干細(xì)胞(HSCs)的細(xì)胞用量比為8:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述⑶34+造血干細(xì)胞來(lái)源于臍血。
4.權(quán)利要求1至3任一所述的藥物組合物在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述·的應(yīng)用，所述骨髓造血功能障礙疾病由輻射引起。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103585179SQ201310474067
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】張勇, 張佩, 陳婷婷, 范文霞, 錢峰華, 裴莉, 徐雙年, 鄒仲敏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院