專(zhuān)利名稱(chēng)：人源化單克隆抗體hPAM4的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單價(jià)和多價(jià)單特異性抗體以及多價(jià)多特異性抗體。準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及命名為PAM4的MUC1抗原特異性抗體。本發(fā)明還涉及人源化PAM4抗體和人PAM4抗體及其片段以及所述抗體及其片段在診斷和治療中的用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有一個(gè)或多個(gè)相同的結(jié)合部位，其中每個(gè)結(jié)合部位對(duì)靶抗原或靶抗原上的表位都具有親和性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合部位，所述結(jié)合部位對(duì)靶抗原上或者相同或不同靶抗原上的相同或不同表位具有親和性，或者至少一個(gè)結(jié)合部位對(duì)靶抗原具有親和性，至少一個(gè)結(jié)合部位對(duì)半抗原具有親和性。本發(fā)明也描述了可用于在宿主中表達(dá)本文所述抗體的重組載體。
背景技術(shù)：
胰腺產(chǎn)生胰島素和酶，胰島素幫助機(jī)體將葡萄糖轉(zhuǎn)化成能量，而酶幫助機(jī)體消化食物。胰腺癌是主要發(fā)生在胰腺管細(xì)胞的胰腺的惡性生長(zhǎng)。該疾病是排在第九位的最常見(jiàn)癌癥形式，還是分別排在第四位和第五位的男性和女性癌癥死亡的原因。胰腺癌幾乎總是致命的，5年存活率小于3％。
胰腺癌最常見(jiàn)的癥狀包括黃疸、腹痛和體重減輕，并伴有本質(zhì)上是非特異性的其它呈遞因子。因此，在腫瘤生長(zhǎng)的早期診斷出胰腺癌常常是困難的，需要經(jīng)過(guò)深思熟慮的懷疑和多方面的診斷檢查，時(shí)常包括探察手術(shù)。內(nèi)窺鏡超聲成像和計(jì)算機(jī)斷層成像是目前最好的可利用的非侵害性診斷胰腺癌的手段。然而，小腫瘤以及鑒別胰腺癌和局灶性胰腺炎的可靠檢測(cè)極其繁瑣。遺撼的是，目前，絕大多數(shù)患者當(dāng)處于晚期時(shí)才被診斷出來(lái)，此時(shí)腫瘤已經(jīng)從囊向外延伸，侵襲周?chē)鞴俸?或已經(jīng)向全身轉(zhuǎn)移。Gold等，Crit.Rev.Oncology/Hematology，39147-54(2001)。該病的晚期檢測(cè)是普通的，而“早期”胰腺癌診斷在臨床上是罕見(jiàn)的。
用于胰腺癌的當(dāng)前療法一直不能治愈，基本上也不能延長(zhǎng)存活時(shí)間。手術(shù)切除術(shù)一直是提供存活機(jī)會(huì)的唯一方式。然而，由于大腫瘤負(fù)擔(dān)，僅10％-25％的患者是“治療性切除術(shù)”的候選者。對(duì)于這些經(jīng)歷手術(shù)治療的患者，5年存活率仍不理想，平均僅約為10％。
胰腺癌的早期檢測(cè)和診斷以及對(duì)該疾病的適當(dāng)分期將會(huì)提供增加的存活優(yōu)勢(shì)。許多實(shí)驗(yàn)室都在進(jìn)行基于使腫瘤相關(guān)標(biāo)記釋放到血流中以及檢測(cè)活檢標(biāo)本中的標(biāo)記物來(lái)開(kāi)發(fā)診斷方法。對(duì)于胰腺癌，最好的腫瘤相關(guān)標(biāo)記一直是針對(duì)CA19.9的免疫測(cè)定。在70％的胰腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該唾液酸化Lea表位結(jié)構(gòu)的水平升高，但該表位結(jié)構(gòu)在任何所檢查的局灶性胰腺炎標(biāo)本中都沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。然而，發(fā)現(xiàn)CA19.9水平在許多其它惡性和良性病癥中也會(huì)升高，所以目前該測(cè)定不能用于診斷。然而，該測(cè)定可用于監(jiān)測(cè)，手術(shù)后CA19.9血清水平持續(xù)升高說(shuō)明預(yù)后差。據(jù)報(bào)道，許多其它的單克隆抗體(MAb)結(jié)合免疫測(cè)定可以在不同的發(fā)展期用于診斷。這些包括但不限于DUPAN2、SPAN1、B72.3、Ia3和各種抗CEA抗體。
人造抗體、特別是MAb和工程抗體或抗體片段已經(jīng)進(jìn)行了全面的測(cè)試，表明它們?cè)跈z測(cè)和治療胰腺癌以及包括癌癥、自身免疫病、感染性疾病、炎性疾病和心血管疾病在內(nèi)的其它各種人類(lèi)疾病中具有價(jià)值[Filpula和McGuire，Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9231-245]。抗體或抗體源性試劑的臨床應(yīng)用主要取決于其結(jié)合特殊疾病相關(guān)性特異性靶抗原的能力。選擇性對(duì)于在人類(lèi)疾病的檢測(cè)和治療階段期間將例如以下的診斷劑或治療劑傳遞到靶部位是有價(jià)值的同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、激素類(lèi)拮抗劑、酶、酶抑制劑、寡核苷酸、生長(zhǎng)因子、寡核苷酸、放射性核素、血管生成抑制劑或金屬，如果所述診斷劑或治療劑對(duì)機(jī)體正常組織有毒性的情況下特別重要。放射性標(biāo)記抗體在包括卵巢癌、結(jié)腸癌和淋巴瘤在內(nèi)的許多惡性腫瘤中的應(yīng)用已取得了一定的成功。該項(xiàng)技術(shù)也證明可用于胰腺癌。然而，除抗CEA抗體和B72.3的應(yīng)用之外，幾乎沒(méi)有其它的現(xiàn)有臨床資料。
該抗體系統(tǒng)的潛在限制在Goldenberg，The American Journal ofMedicine，94298-299(1993)中有討論。檢測(cè)和治療技術(shù)的重要參數(shù)是存在靶細(xì)胞的部位的具體位置的注射劑量以及攝取率即具體結(jié)合抗體的濃度與周?chē)＝M織內(nèi)存在的放射性濃度之比。當(dāng)將抗體注射到血流中時(shí)，它通過(guò)許多區(qū)室，進(jìn)行代謝和排泄。當(dāng)通過(guò)機(jī)體的其余部位時(shí)，所述抗體必須能夠定位并結(jié)合靶細(xì)胞抗原?？刂瓶乖邢虻囊蛩匕ㄎ恢?、大小、抗原密度、抗原可及性、病理組織的細(xì)胞組成和靶向抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。通過(guò)抗體具體影響腫瘤靶向的其它因素包括靶抗原的表達(dá)(腫瘤內(nèi)和其它組織內(nèi))和由于放射性標(biāo)記抗體的較慢血-清除率引起的骨髓毒性。中靶的腫瘤細(xì)胞所累積的靶向抗體量受血管形成的影響和抗體穿透腫瘤的屏障以及腫瘤內(nèi)壓力的影響。肝、腎或骨髓等非靶器官的非特異性攝取是該項(xiàng)技術(shù)、尤其是放射免疫療法的另一潛在的限制，其中骨髓的照射常常引起劑量-限制毒性。
用于將藥劑傳遞到靶部位的一個(gè)推薦方法，稱(chēng)之為直接靶向，是設(shè)計(jì)用攜帶診斷性或治療性放射性同位素的抗體靶向特異性抗原的技術(shù)。就腫瘤而論，直接靶向方法利用通過(guò)其抗原識(shí)別靶腫瘤的放射性標(biāo)記抗腫瘤單特異性抗體。該項(xiàng)技術(shù)包括將標(biāo)記單特異性抗體注射到患者體內(nèi)，讓所述抗體定位在靶腫瘤，從而獲得診斷或治療益處。未結(jié)合的抗體被機(jī)體清除。該方法可用于診斷或治療其它的哺乳動(dòng)物疾病。
另一推薦方法，稱(chēng)之為“親和力增強(qiáng)系統(tǒng)(Affnity EnhancementSystem)(AES)”，是一項(xiàng)特別設(shè)計(jì)用以克服攜帶診斷性或治療性放射性同位素的抗體靶向腫瘤的缺陷的技術(shù)[US-5,256,395(1993)，Barbet等，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 14153-166(1999)]。AES利用既識(shí)別靶腫瘤又識(shí)別放射性半抗原的放射性標(biāo)記二價(jià)半抗原和抗腫瘤/抗半抗原雙特異性抗體。具有較高價(jià)數(shù)的半抗原和具有較高特異性的抗體也可用于該方法中。該項(xiàng)技術(shù)包括將所述抗體注射到患者體內(nèi)，讓其定位在靶腫瘤。在未結(jié)合抗體從血流中清除足夠時(shí)間后，給予放射性標(biāo)記半抗原。半抗原與位于靶細(xì)胞部位的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合，從而獲得診斷或治療益處，同時(shí)未結(jié)合半抗原快速?gòu)臋C(jī)體內(nèi)清除。Barbet提及二價(jià)半抗原可與雙特異性抗體交聯(lián)的可能性(如果后者也結(jié)合到腫瘤表面的話)。結(jié)果，放射性標(biāo)記復(fù)合物更穩(wěn)定并且在腫瘤上停留時(shí)間更長(zhǎng)。該系統(tǒng)可用于診斷或治療哺乳動(dòng)物疾病。
本領(lǐng)域仍然需要產(chǎn)生可用于直接靶向系統(tǒng)的多價(jià)單特異性抗體以及產(chǎn)生可用于親和力增強(qiáng)系統(tǒng)的多價(jià)多特異性抗體。準(zhǔn)確地講，仍然需要作為胰腺癌的有效診斷工具并表現(xiàn)出增強(qiáng)攝取中靶抗原、血濃度降低以及保護(hù)正常組織和細(xì)胞抵抗毒性藥物的抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明考慮結(jié)合位于MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域的抗體、融合蛋白及其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體、融合蛋白或其片段是PAM4抗體。本發(fā)明的PAM4抗體、融合蛋白或其片段是通過(guò)用粘蛋白免疫和/或選擇而獲得的，并且最好對(duì)胰腺癌粘蛋白有反應(yīng)性。因此，本發(fā)明的PAM4抗體、融合蛋白及其片段最好結(jié)合胰腺癌細(xì)胞相關(guān)性抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PAM4抗體或其片段是人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體或其片段，或者所述PAM4融合蛋白包含人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體或其片段。還優(yōu)選所述PAM4抗體、融合蛋白及其片段可以與至少一種治療劑和/或診斷劑綴合。
本文中考慮的是人源化PAM4抗體或其片段，所述人源化PAM4抗體或其片段包含鼠PAM4單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)和人抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架(FR)區(qū)以及人抗體輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其中所述人源化PAM4單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4單克隆抗體重鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化PAM4抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的FR包含至少一個(gè)被鼠PAM4單克隆抗體的相應(yīng)FR取代的氨基酸。更優(yōu)選所述人源化PAM4抗體或其片段包含至少一個(gè)選自

圖1B中PAM4 VH氨基酸序列的鼠重鏈可變區(qū)氨基酸殘基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸。還優(yōu)選其中來(lái)自所述鼠單克隆抗體的所述氨基酸是至少一個(gè)選自圖1A中PAM4 Vκ序列的鼠輕鏈可變區(qū)氨基酸殘基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸的人源化PAM4抗體或其片段。最優(yōu)選所述人源化PAM4抗體或其片段包含圖1A中的PAM4 Vκ核苷酸序列和圖1B中的PAM4 VH核苷酸序列和/或包含圖4A中的hPAM4 VH氨基酸序列和圖4B中的hPAM4 Vκ氨基酸序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是靶向癌細(xì)胞的包含抗體組分的診斷用免疫綴合物，所述抗體組分包含本發(fā)明的抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的抗體或其片段，其中所述抗體、融合蛋白或其片段與至少一種診斷劑/檢測(cè)劑結(jié)合。
優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑選自放射性核素、造影劑和光敏診斷劑/檢測(cè)劑。更優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑是能量介于20keV和4000keV之間的放射性核素，或者是選自以下的放射性核素110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ發(fā)射體、β發(fā)射體或正電子發(fā)射體。還優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑是順磁離子例如包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(HI)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)在內(nèi)的金屬或不透射線物質(zhì)例如鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鹽、丙碘酮和氯化亞鉈。
還優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑是熒光標(biāo)記化合物，選自異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物，選自魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯；或生物發(fā)光化合物，選自螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷用免疫綴合物用于手術(shù)中、內(nèi)窺鏡檢查或血管內(nèi)腫瘤診斷。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是靶向癌細(xì)胞的包含抗體組分的治療用免疫綴合物，所述抗體組分包含本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的抗體或其片段，其中所述抗體、融合蛋白或其片段與至少一種治療劑結(jié)合。
優(yōu)選所述治療劑選自放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素類(lèi)拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、光敏治療劑、細(xì)胞毒性劑、血管生成抑制劑和它們的組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸例如抑制bcl-2表達(dá)的反義分子在U.S.5,734,033(Reed)中有描述，可以綴合或形成本發(fā)明的免疫綴合物或抗體融合蛋白的治療劑部分，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。或者，所述寡核苷酸可以與本發(fā)明裸PAM4抗體或綴合PAM4抗體或抗體片段同時(shí)給予或者序貫給予。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸最好是針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的癌基因或癌基因產(chǎn)物例如bcl-2。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑是細(xì)胞毒性劑例如藥物或毒素。還優(yōu)選所述藥物選自氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類(lèi)似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷類(lèi)、COX-2抑制劑、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、抗生素、酶、酶抑制劑、表鬼臼毒素、鉑配位絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素類(lèi)拮抗劑、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin)、紫杉醇、喜樹(shù)堿、SN-38、多柔比星及其類(lèi)似物、抗代謝藥、烷化劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥、細(xì)胞凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-11和它們的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑是寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可以是反義寡核苷酸，例如針對(duì)癌基因如bcl-2和p53的反義寡核苷酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑是毒素，選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素和它們的組合；免疫調(diào)節(jié)劑，選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素和它們的組合；放射性核素，選自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111A、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它們的組合；或光敏治療劑，選自色原和染料。
更優(yōu)選所述治療劑是選自以下的酶蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
本文中考慮的是多價(jià)多特異性抗體或其片段，其包含不止一個(gè)對(duì)PAM4靶抗原具有親和性的抗原結(jié)合部位以及一個(gè)或多個(gè)對(duì)半抗原分子具有親和性的半抗原結(jié)合部位。優(yōu)選所述抗體或其片段是人源化或全人抗體或其片段。還優(yōu)選所述多價(jià)多特異性抗體或其片段還包含診斷劑/檢測(cè)劑和/或治療劑。
本文中還描述的是能攜帶至少一種診斷劑和/或治療劑的雙特異性抗體或其片段，其包含至少一個(gè)對(duì)PAM4靶抗原具有親和性的結(jié)合部位以及對(duì)至少一個(gè)選自以下的靶向構(gòu)建體/綴合物具有親和性的結(jié)合部位DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 271)；DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 277)；DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 288)；DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 0281)；和DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 284)。其它適用于本發(fā)明的靶向構(gòu)建體在于2003年6月13日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)、題目為“D-氨基酸肽”(McBride)中公開(kāi)，代理檔案號(hào)018733/1206。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是包含至少兩種PAM4單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中所述單克隆抗體或片段包含本發(fā)明的抗體及其片段中任一個(gè)。還優(yōu)選所述抗體融合蛋白或其片段包含本發(fā)明的抗體及其片段中任一個(gè)的至少一種第一PAM4單克隆抗體或其片段和除本發(fā)明抗體及其片段的單克隆抗體或其片段之外的至少一種第二單克隆抗體或其片段。優(yōu)選所述第二單克隆抗體是癌相關(guān)抗體，優(yōu)選選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根據(jù)路易斯(Lewis)抗原Le(y)定義的抗體和針對(duì)以下的抗體CSAp、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、IL-6、MUC2、MUC3、MUC4、TAG-72、EGFR、CD40、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、血管生成因子(例如VEGF)、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。本發(fā)明的抗體融合蛋白或其片段還可以包含至少一種診斷劑和/或治療劑。
本文中還描述的是包含編碼選自以下的單克隆抗體或其片段的核酸的DNA序列(a)本發(fā)明中描述的抗體中任一個(gè)的PAM4抗體或其片段；(b)包含至少兩個(gè)(a)中描述的單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段；c)包含至少一種第一PAM4單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，所述第一PAM4單克隆抗體或其片段包含本發(fā)明的PAM4抗體或其片段的所述單克隆抗體或其片段，所述第二單克隆抗體或其片段不是本發(fā)明的抗體或其片段中任一個(gè)的單克隆抗體或其片段；和(d)包含至少一種第一單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，所述第一單克隆抗體或其片段包含本發(fā)明的抗體或其片段中任一個(gè)的所述單克隆抗體或其片段，所述第二單克隆抗體或其片段不是本發(fā)明抗體或其片段中任一個(gè)的所述單克隆抗體或其片段，其中所述第二單克隆抗體是癌相關(guān)抗體。優(yōu)選所述癌相關(guān)抗體選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根據(jù)路易斯抗原Le(y)定義的抗體和針對(duì)以下的抗體CD40、血管生成因子(例如VEGF)、癌基因產(chǎn)物、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子、腱生蛋白、IL-6和HER2/neu。
本發(fā)明中還描述的是包含本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的DNA序列的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種將診斷劑或治療劑或其組合傳遞到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含與至少一種診斷劑/檢測(cè)劑和/或治療劑綴合的PAM4抗體或其片段的組合物和(ii)給予有需要的患者本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的診斷用綴合物或治療用綴合物。優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑選自放射性核素、造影劑和光敏診斷劑/檢測(cè)劑，所述治療劑優(yōu)選選自藥物、毒素、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素類(lèi)拮抗劑、生長(zhǎng)因子、放射性核素、金屬。
本發(fā)明還考慮一種將診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合傳遞到靶的方法，所述方法包括(a)給予患者對(duì)PAM4抗原具有親和性并且包含一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合部位的本發(fā)明多價(jià)多特異性抗體或其片段中任一個(gè)的抗體或其片段；和(b)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以清除所述患者血流中的非抗體量；和(c)給予所述患者包含診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合并且與所述抗體的結(jié)合部位結(jié)合的載體分子。優(yōu)選所述載體分子與所述抗體的不止一個(gè)結(jié)合部位結(jié)合。更優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑或所述治療劑選自同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、寡核苷酸、激素、激素類(lèi)拮抗劑、酶、酶抑制劑、生長(zhǎng)因子、放射性核素和金屬。
在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸例如抑制bcl-2表達(dá)的反義分子描述于U.S.5,734,033(Reed)中，可以綴合或形成本發(fā)明免疫綴合物或抗體融合蛋白的治療劑部分，所述專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中?；蛘?，所述寡核苷酸以及本發(fā)明的裸PAM4抗體或綴合PAM4抗體或抗體片段可以同時(shí)或序貫給予。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是優(yōu)選針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的癌基因或癌基因產(chǎn)物例如bcl-2的反義寡核苷酸。
本發(fā)明描述一種用于診斷或治療癌癥的方法，所述方法包括(a)給予有需要的患者對(duì)PAM4抗原具有親和性并且包含一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合部位的本發(fā)明多價(jià)多特異性抗體或其片段中任一個(gè)的抗體或其片段；(b)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以清除所述患者血流中的未結(jié)合抗體量；和(c)給予所述患者包含診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合并且與所述抗體的結(jié)合部位結(jié)合的載體分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌。還優(yōu)選所述方法可用于手術(shù)中鑒定患病組織、經(jīng)內(nèi)窺鏡檢查鑒定患病組織或血管內(nèi)鑒定患病組織。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種治療患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予所述患者治療有效量的包含本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段的抗體或其片段，其中所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段與至少一種治療劑綴合；和(b)將所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。優(yōu)選所述方法還包括不在本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)中的第二單克隆抗體或其片段。更優(yōu)選所述第二單克隆抗體或其片段是裸單克隆抗體或其片段。還優(yōu)選所述第二單克隆抗體或其片段選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、ND2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根據(jù)路易斯抗原Le(y)定義的抗體和針對(duì)以下的抗體CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、CD40、血管生成因子(例如VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
本文中考慮的是一種診斷患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予所述患者診斷有效量的包含本發(fā)明抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段的診斷用綴合物，其中所述PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段與至少一種診斷劑/檢測(cè)劑綴合；和(b)任選將所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種治療患者的癌細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)給予所述患者治療有效量的包含本發(fā)明裸抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的裸PAM4單克隆抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物；(ii)將所述裸PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。優(yōu)選所述方法還包括不是本發(fā)明裸抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的第二裸抗體或其片段。例如，所述第二抗體或其片段可以選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根據(jù)路易斯抗原Le(y)定義的抗體和針對(duì)以下的抗體CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、CD40、血管生成因子(例如VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
本發(fā)明也描述一種診斷患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(i)用包含本發(fā)明裸抗體、融合蛋白或其片段中任一個(gè)的裸PAM4單克隆抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物對(duì)來(lái)自所述患者的標(biāo)本進(jìn)行體外診斷分析。優(yōu)選所述惡性腫瘤是癌癥。更優(yōu)選所述癌癥是胰腺癌。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種手術(shù)中鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和
本文還描述一種經(jīng)內(nèi)窺鏡檢查鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和 本文中考慮一種血管內(nèi)鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和 另一個(gè)實(shí)施方案是一種在內(nèi)窺鏡檢查、血管內(nèi)導(dǎo)管或外科手術(shù)中檢測(cè)損害的方法，其中所述方法包括(a)給準(zhǔn)備進(jìn)行所述手術(shù)的患者注射雙特異性抗體F(ab)2或其F(ab′)2片段、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)或四功能抗體(tetrabody)，其中所述雙特異性抗體或其片段、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體具有與PAM4抗原特異性結(jié)合的第一抗體結(jié)合部位，并且具有與半抗原特異性結(jié)合的第二抗體結(jié)合部位，允許所述抗體片段附加在靶部位；(b)任選用半乳糖基化抗獨(dú)特型清除劑清除非靶向抗體片段，如果在注射約24小時(shí)內(nèi)所述雙特異性片段大部分沒(méi)有從循環(huán)中清除的話，然后注射二價(jià)標(biāo)記半抗原，所述半抗原很快地集中在靶部位并通過(guò)腎臟清除；(c)在初次注射48小時(shí)內(nèi)，通過(guò)使用檢測(cè)手段近距離檢測(cè)靶部位升高的附加標(biāo)記水平來(lái)檢測(cè)存在的所述半抗原，然后進(jìn)行所述手術(shù)，其中所述檢測(cè)在不使用造影劑或扣除劑的情況下進(jìn)行。
本發(fā)明也考慮一種在手術(shù)中、血管內(nèi)手術(shù)中或內(nèi)窺鏡手術(shù)中近距離損害檢測(cè)的方法，其中所述方法包括(a)給準(zhǔn)備進(jìn)行所述手術(shù)的患者胃腸外注射有效量的hPAM4免疫綴合物或其片段，(b)在注射48小時(shí)內(nèi)實(shí)施所述手術(shù)；(c)用檢測(cè)所述標(biāo)記抗體或其片段的存在的檢測(cè)手段，對(duì)患者的內(nèi)部可及部位進(jìn)行近距離掃描；和(d)根據(jù)在所述部位用所述檢測(cè)手段檢測(cè)到所述標(biāo)記抗體或其片段水平升高，對(duì)所述標(biāo)記抗體或其片段的附加部位進(jìn)行定位。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示鼠PAM4的克隆化V基因和導(dǎo)出的氨基酸序列。圖1A顯示PAM4 Vκ的DNA序列和氨基酸序列。圖1B顯示PAM4 VH的DNA序列和氨基酸序列。由相應(yīng)DNA序列編碼的氨基酸序列以在核苷酸序列之下的單字母密碼子給出。核苷酸序列的編號(hào)位居右側(cè)。CDR區(qū)中的氨基酸殘基用粗體加下劃線表示。如以上氨基酸殘基編號(hào)所示，用Kabat Ig分子編號(hào)對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。用單字母編號(hào)的氨基酸殘基是根據(jù)Kabat編號(hào)方案定義的插入殘基。插入殘基具有與前面的殘基之前的數(shù)字相同的數(shù)字。例如，圖1B中殘基82、82A、82B和82C分別表示為82、A、B和C。
圖2顯示在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的嵌合PAM4(cPAM4)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。圖2A顯示cPAM4Vκ的氨基酸序列。圖2B顯示cPAM4VH的氨基酸序列。所述序列以單字母密碼子給出。CDR區(qū)中的氨基酸殘基用粗體加下劃線表示。氨基酸的編號(hào)同圖1。
圖3顯示人抗體、PAM4和hPAM4的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。圖3A顯示人抗體Walker與PAM4和hPAM4的Vκ氨基酸序列比對(duì)，圖3B顯示人抗體Wil2(FR1-3)和NEWM(FR4)與PAM4和hPAM4的VH氨基酸序列比對(duì)。圓點(diǎn)表示PAM4的殘基與人抗體的相應(yīng)殘基相同的殘基。方框內(nèi)的區(qū)表示CDR區(qū)。hPAM4的N端和C端殘基(加下劃線)用所用的分期載體定位。用Kabat Ig分子編號(hào)方案對(duì)圖1中的殘基進(jìn)行編號(hào)。
圖4顯示在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的人源化PAM4(hPAM4)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列和氨基酸序列。圖4A顯示hPAM4 Vκ的DNA序列和氨基酸序列，圖4B顯示hPAM4VH的DNA序列和氨基酸序列。核苷酸序列的編號(hào)位居右側(cè)。由相應(yīng)DNA序列編碼的氨基酸序列以單字母密碼子給出。CDR區(qū)中的氨基酸殘基用粗體加下劃線表示。同圖1A和圖1B中一樣，用Kabat Ig分子編號(hào)方案對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。
圖5顯示人源化PAM4抗體、hPAM4與嵌合PAM4、cPAM4相比的結(jié)合活性。hPAM4用菱形表示，cPAM4用實(shí)心圓表示。結(jié)果表明hPAM4抗體和cPAM4當(dāng)與125I-cPAM4競(jìng)爭(zhēng)與CaPan1 Ag結(jié)合時(shí)的可比結(jié)合活性。嵌合抗體是其所含有的抗體分子可變區(qū)來(lái)源于一種物種的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)而所含有的抗體分子恒定區(qū)來(lái)源于人抗體恒定區(qū)的重組蛋白。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述概述本文所述的術(shù)語(yǔ)“PAM4抗體”包括鼠PAM4抗體、人PAM4抗體和人源化PAM4抗體。
本發(fā)明涉及可用于胰腺癌診斷、檢測(cè)、分期和治療的單克隆抗體PAM4。優(yōu)選本發(fā)明的PAM4抗體及其片段是人源化或全人的。所述鼠PAM4(mPAM4)抗體是用作為免疫原的來(lái)源于異種移植物RIP-1人胰腺癌的胰腺癌粘蛋白產(chǎn)生的MUC1抗體。Gold等，Int.J.Cancer，57204-210(1994)。所述mPAM4抗體識(shí)別靶胰腺癌抗原上的獨(dú)特的新表位。免疫組織化學(xué)染色研究，例如實(shí)施例1中所描述的那些研究，已經(jīng)表明PAM4 MAb結(jié)合位于由乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和其它的癌細(xì)胞表達(dá)的MUC1抗原的的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域，并限制與正常人組織結(jié)合。本發(fā)明的PAM4抗體對(duì)胰腺癌具有相對(duì)特異性，因此其優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PAM4抗體及其片段是人源化的。所述PAM4抗體與可以迅速內(nèi)化的靶表位起反應(yīng)。該表位主要由胰腺癌相關(guān)而與局灶性胰腺炎無(wú)關(guān)的抗原表達(dá)。在動(dòng)物模型中，采用放射性標(biāo)記PAM4 MAb進(jìn)行的定位和治療研究已經(jīng)證明有腫瘤靶向和治療功效。
本發(fā)明的PAM4抗體結(jié)合PAM4抗原，PAM4抗原是位于由許多器官和腫瘤類(lèi)型產(chǎn)生的抗原MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的優(yōu)選PAM4抗體優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。用PAM4 MAb例如實(shí)施例2中的PAM4單克隆抗體進(jìn)行的研究表明，所述抗體具有一些重要的特性，使其成為用于臨床診斷和治療應(yīng)用的候選物。由于所述PAM4抗原提供用于診斷和治療的有效靶，理想的是獲得識(shí)別不同于早期研究中描述的由非PAM4抗體(CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、aLea和路易斯抗原)識(shí)別的表位的胰腺癌抗原的表位的單克隆抗體。
適合用于聯(lián)合或結(jié)合本發(fā)明的PAM4抗體使用的抗體包括例如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea和根據(jù)路易斯抗原Le(y)定義的抗體或針對(duì)以下的抗體癌胚抗原(CEA)、結(jié)腸-特異性抗原-p(CSAp)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子和IL-6以及癌基因產(chǎn)物以及針對(duì)以下的抗體腫瘤壞死因子例如Epstein等的專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071491、6,017,514、5,019,368和5,882,626)中所描述的。所述抗體可用于補(bǔ)充當(dāng)前的PAM4抗體免疫檢測(cè)和免疫療法。在治療應(yīng)用中，參與抵抗腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞功能的免疫調(diào)節(jié)劑的激動(dòng)或拮抗性抗體也可以與單獨(dú)的PAM4抗體聯(lián)用或者與其它的腫瘤相關(guān)抗體聯(lián)用，一個(gè)實(shí)例是抗CD40的抗體。Todryk等，J Immunol Methods，248139-147(2001)；Turner等，J Immunol，16689-94(2001)。也可使用抗標(biāo)記或癌基因產(chǎn)物的抗體或者抗血管生成因子例如VEGF的抗體。VEGF抗體描述于Thorpe等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,342,221、5,965,132和6,004,554，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
此外，其它的PAM4樣抗體的利用度對(duì)于開(kāi)發(fā)雙測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是必需的，ELISA可用于檢測(cè)臨床樣品中的PAM4抗原。ELISA實(shí)驗(yàn)描述于實(shí)施例4和實(shí)施例7。
本發(fā)明描述結(jié)合位于MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域并且可用于診斷方法和治療方法中的人源化抗體和全人抗體及其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PAM4抗體是人源化的。還優(yōu)選本發(fā)明的PAM4抗體優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。因?yàn)榉侨祟?lèi)單克隆抗體可以被人宿主識(shí)別為外源蛋白，并且重復(fù)注射可以導(dǎo)致有害的過(guò)敏反應(yīng)，所以鼠PAM4序列的人源化可以減少患者可能經(jīng)歷的不良免疫應(yīng)答。對(duì)于基于鼠的單克隆抗體，常常將其稱(chēng)為人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。優(yōu)選人源化PAM4抗體或其片段的構(gòu)架區(qū)中的某些人殘基被其鼠對(duì)應(yīng)物所取代。還優(yōu)選來(lái)自?xún)煞N不同人抗體的構(gòu)架序列的組合用于VH。所述抗體分子的恒定區(qū)來(lái)源于人抗體的恒定區(qū)。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是人PAM4抗體。人抗體是例如從已“工程改造”以產(chǎn)生響應(yīng)抗原攻擊的特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體。在該項(xiàng)技術(shù)中，將人重鏈基因座和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入來(lái)源于含有內(nèi)源重鏈基因座和輕鏈基因座的中靶破壞的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中。所述轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成對(duì)人抗原有特異性的人抗體，并且所述小鼠可以用來(lái)產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法描述于Green等，Nature Genet.713(1994)；Lonberg等，Nature 368856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6579(1994)。全人抗體也可以通過(guò)基因轉(zhuǎn)染法或染色體轉(zhuǎn)染法以及噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建，所有所述技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如McCafferty等，Nature 348552-553(1990)，該文獻(xiàn)描述了人抗體及其片段以及從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)基因庫(kù)(repertoire)的體外產(chǎn)生。在該項(xiàng)技術(shù)中，將抗體可變區(qū)基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體的大外殼蛋白基因或小外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒表面。因?yàn)樗鼋z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以根據(jù)抗體的功能特性進(jìn)行選擇也導(dǎo)致對(duì)編碼表現(xiàn)出所述特異的基因進(jìn)行選擇。由此可見(jiàn)，所述噬菌體模擬B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可以以各種各樣的形式進(jìn)行，有關(guān)噬菌體展示的綜述，參見(jiàn)例如Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 35564-571(1993)。
本發(fā)明的抗體及其片段優(yōu)選針對(duì)來(lái)自人胰腺腫瘤的粗制粘蛋白制劑產(chǎn)生。在一個(gè)相關(guān)方面中，所述PAM4抗體可以使用基本純的PAM4抗原制劑來(lái)獲得?；炯兊牡鞍资腔旧喜缓廴炯?xì)胞組分的蛋白，所述污染細(xì)胞組分性質(zhì)上與所述蛋白相關(guān)。
定義在下面的說(shuō)明書(shū)中，使用了許多術(shù)語(yǔ)，為了便于理解本發(fā)明，提供以下定義。
本文所述的抗體是指全長(zhǎng)(即天然存在的或通過(guò)正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特異性結(jié)合)部分如抗體片段。
抗體片段是抗體的一部分例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等等。無(wú)論何種結(jié)構(gòu)，抗體片段都與被全長(zhǎng)抗體識(shí)別的同一抗原結(jié)合。例如，抗CD20單克隆抗體片段與CD20的表位結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”也包括同特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合物的抗體起同樣作用的任何合成或基因工程蛋白。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離的片段，例如由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段、其中輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過(guò)肽接頭連接在一起的重組單鏈多肽分子(“ScFv蛋白”)和由模擬超變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位。
裸抗體通常是不與治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑綴合的抗體。然而，它也可以是不與診斷劑/檢測(cè)劑或治療劑綴合的抗體片段。這是因?yàn)榭贵w分子的Fc部分提供效應(yīng)子功能，例如補(bǔ)體結(jié)合和ADCC(抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性)，該機(jī)制發(fā)揮作用，可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解。然而，可能Fc部分開(kāi)始起作用并不需要同其它機(jī)制例如細(xì)胞凋亡一樣的治療功能。裸抗體既包括多克隆抗體和單克隆抗體，又包括融合蛋白和某些重組抗體例如嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
嵌合抗體是含有包括來(lái)自一種物種(優(yōu)選嚙齒動(dòng)物抗體)的抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的可變區(qū)的重組蛋白，而所述抗體分子的恒定區(qū)來(lái)源于人抗體。對(duì)于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用，嵌合抗體的恒定區(qū)可以來(lái)源于其它物種，例如貓或狗。
人源化抗體是其中來(lái)自一種物種的抗體(例如嚙齒動(dòng)物抗體)的CDR從嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移到人重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的重組蛋白。所述抗體分子的恒定區(qū)來(lái)源于人抗體的恒定區(qū)。
人抗體是從已“工程改造”以產(chǎn)生響應(yīng)抗原攻擊的特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體。在該項(xiàng)技術(shù)中，將人重鏈基因座和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入來(lái)源于含有內(nèi)源重鏈基因座和輕鏈基因座的中靶破壞的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中。所述轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成對(duì)人抗原有特異性的人抗體，并且所述小鼠可以用來(lái)產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法描述于Green等，NatureGenet.713(1994)；Lonberg等，Nature 368856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6579(1994)。全人抗體也可以通過(guò)染色體轉(zhuǎn)染法以及噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建，所有所述技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如McCafferty等，Nature 348552-553(1990)，該文獻(xiàn)描述了人抗體及其片段以及從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)基因庫(kù)的體外產(chǎn)生。在該項(xiàng)技術(shù)中，將抗體可變區(qū)基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體的大外殼蛋白基因或小外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒表面。因?yàn)樗鼋z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以根據(jù)抗體的功能特性進(jìn)行選擇也導(dǎo)致對(duì)編碼表現(xiàn)出所述特異性基因進(jìn)行選擇。由此可見(jiàn)，所述噬菌體模擬B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可以以各種各樣的形式進(jìn)行，有關(guān)噬菌體展示的綜述，參見(jiàn)例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in StructuralBiology 35564-571(1993)。
人抗體也可以通過(guò)體外活化B細(xì)胞產(chǎn)生。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,567,610號(hào)和第5,229,275號(hào)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
治療劑是與抗體部分獨(dú)立、同時(shí)或序貫給予或者與抗體部分即抗體或抗體片段或亞片段綴合的并且可用于治療疾病的分子或原子。治療劑的實(shí)例包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物、光敏劑或染料和放射性同位素。
診斷劑/檢測(cè)劑是與抗體部分即抗體或抗體片段或亞片段綴合給予并且可用于通過(guò)定位含有所述抗原的細(xì)胞來(lái)診斷疾病的分子或原子。有用的診斷劑/檢測(cè)劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子和磁共振成像(MRI)用增強(qiáng)劑(例如順磁離子)。美國(guó)專(zhuān)利第6,331,175號(hào)描述了MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體的制備方法，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑選自放射性同位素、供磁共振成像用的增強(qiáng)劑和熒光化合物。為了用放射性金屬或順磁離子加載抗體組分，可能必需使其與具有連接多個(gè)螫合基團(tuán)以結(jié)合離子的長(zhǎng)尾的試劑反應(yīng)。這樣的尾可以是具有可以結(jié)合螫合基團(tuán)的側(cè)基的聚合物，例如多聚賴(lài)氨酸、多糖或其它的衍生化鏈或可衍生鏈，所述螫合基團(tuán)例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的基團(tuán)。采用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，使螯合物與抗體偶聯(lián)。螯合物通常通過(guò)能與免疫反應(yīng)性最小損失，最小聚集和/或內(nèi)部交聯(lián)的分子形成化學(xué)鍵的基團(tuán)與抗體連接。螯合物與抗體綴合的其它更與眾不同的方法和試劑公開(kāi)于1989年4月25日授予Hawthorne的美國(guó)專(zhuān)利4,824,659，題目為“抗體綴合物”，所述專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-芐基-DTPA及其一甲基類(lèi)似物和環(huán)己基類(lèi)似物，它們與以下總能量范圍為60-4,000keV的診斷用同位素聯(lián)用例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br，供放射成像用。相同的螯合物當(dāng)與非放射性金屬例如錳、鐵和釓絡(luò)合時(shí)，可與本發(fā)明抗體一起用于MRI。大環(huán)螯合物例如NOTA、DOTA和TETA可分別與各種各樣的金屬和放射性金屬、最特別是與鎵、釔和銅的放射性核素聯(lián)用。這樣的金屬-螯合物絡(luò)合物可以根據(jù)目標(biāo)金屬的環(huán)大小定制，因而是非常穩(wěn)定的。本發(fā)明包括其它的環(huán)型螯合物例如大環(huán)聚醚，它們對(duì)于用于RAIT的穩(wěn)定結(jié)合核素例如223Ra有價(jià)值。
免疫綴合物是與至少一種治療劑和/或診斷劑/檢測(cè)劑綴合的抗體、融合蛋白或其片段。所述診斷劑/檢測(cè)劑可以包括放射性核素或非放射性核素、造影劑(例如用于磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層成像或超聲成像)，所述放射性核素可以是γ發(fā)射同位素、β發(fā)射同位素、α發(fā)射同位素、俄歇電子發(fā)射同位素或正電子發(fā)射同位素。
表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通常，基因表達(dá)處于某些調(diào)節(jié)元件的控制之下，所述調(diào)節(jié)元件包括組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子。這樣的基因被認(rèn)為是與調(diào)節(jié)元件“有效連接”的。
重組宿主可以是含有克隆載體或表達(dá)載體的任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括已經(jīng)進(jìn)行基因工程改造以在宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的細(xì)胞的染色體或基因組中含有克隆化基因的那些原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括骨髓瘤細(xì)胞，例如SP2/0細(xì)胞和NS0細(xì)胞以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞系及其它可用于表達(dá)抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。另外，用于表達(dá)mAb及其它融合蛋白的特別有用的宿主細(xì)胞是人細(xì)胞系PER.C6，其公開(kāi)于WO0063403 A2，產(chǎn)生比常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如CHO、COS、Vero、Hela、BHK和SP2-細(xì)胞系高2-200倍的重組蛋白。具有經(jīng)修飾的免疫系統(tǒng)的特殊轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)于制備全人抗體特別有用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同的天然抗體、單鏈抗體或抗體片段區(qū)段連接在一起。融合蛋白的價(jià)數(shù)表示結(jié)合臂或部位的總數(shù)，所述融合蛋白必定是抗原或表位；即單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)?？贵w融合蛋白的多價(jià)是指它可以在與抗原結(jié)合時(shí)具有多種相互作用優(yōu)勢(shì)，因而增加與抗原結(jié)合的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能結(jié)合多少種抗原或表位；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義時(shí)，天然抗體例如IgG是二價(jià)的，因?yàn)樗哂袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但卻是單特異性的，因?yàn)樗Y(jié)合一種抗原。單特異性多價(jià)融合蛋白對(duì)于一個(gè)表位具有不止一個(gè)結(jié)合部位，但僅與同一抗原上的相同或不同表位結(jié)合，例如具有兩個(gè)結(jié)合部位的并與同一抗原起反應(yīng)的雙功能抗體。所述融合蛋白可以包含不同抗體組分或多拷貝的相同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合。所述融合蛋白還可包含治療劑。適合所述融合蛋白的治療劑的實(shí)例包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白”)和毒素(“抗體-毒素融合蛋白”)。一種優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選重組RNA酶。
多特異性抗體是可以同時(shí)結(jié)合至少兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的靶例如兩種不同的抗原、同一抗原上的兩個(gè)不同的表位、或半抗原和/或抗原或表位的抗體。一種特異性將會(huì)是針對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位。另一種特異性可以是針對(duì)同一細(xì)胞類(lèi)型上的不同抗原，例如B細(xì)胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74和CD22。多特異性多價(jià)抗體是具有不止一個(gè)結(jié)合部位的構(gòu)建體，并且所述結(jié)合部位具有不同的特異性。例如，雙功能抗體，其一個(gè)結(jié)合部位與一種抗原反應(yīng)，而另一個(gè)結(jié)合部位與另一種抗原反應(yīng)。
雙特異性抗體是可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的靶的抗體。雙特異性抗體(bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)具有至少一個(gè)特異性結(jié)合例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合攜帶治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑的靶向綴合物的臂?？梢杂梅肿庸こ碳夹g(shù)產(chǎn)生各種各樣的雙特異性融合蛋白。在一種形式中，所述雙特異性融合蛋白是由例如對(duì)一種抗原具有一個(gè)結(jié)合部位的scFv和對(duì)第二種抗原具有一個(gè)結(jié)合部位的Fab片段組成的單價(jià)雙特異性融合蛋白。在另一種形式中，所述雙特異性融合蛋白是由例如對(duì)一種抗原具有一個(gè)結(jié)合部位的IgG和對(duì)第二種抗原具有兩個(gè)結(jié)合部位的兩個(gè)scFv組成的二價(jià)雙特異性融合蛋白。
人源化PAM4抗體和人PAM4抗體的制備通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以獲得特定抗原的單克隆抗體。參見(jiàn)例如Kohler和Milstein，Nature 256495(1975)和Coligan等(編著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷、第2.5.1-2.6.7頁(yè)(John Wiley & Sons 1991)(在下文稱(chēng)為“Coligan”)。簡(jiǎn)而言之，可以通過(guò)如下方法獲得PAM4 MAb給小鼠注射包含PAM4抗原的組合物，取出血清樣品確定抗體產(chǎn)生的存在，取出脾臟獲取B淋巴細(xì)胞，將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤，克隆所述雜交瘤，選擇產(chǎn)生抗PAM4抗原的抗體的陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生抗PAM4抗原的抗體的克隆，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離出PAM4抗體。本發(fā)明的PAM4抗體結(jié)合PAM4抗原即位于MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的PAM4抗體優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。
在開(kāi)始產(chǎn)生抗免疫原的抗體之后，可以對(duì)所得抗體進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備。鼠抗體和抗體片段的人源化是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，通過(guò)將來(lái)自小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變區(qū)中，然后取代鼠對(duì)應(yīng)物構(gòu)架區(qū)中的人殘基，產(chǎn)生人源化單克隆抗體。來(lái)源于人源化單克隆抗體的抗體組分的應(yīng)用避免了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問(wèn)題。
本發(fā)明的全人抗體即人PAM4可以得自轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物。參見(jiàn)例如Mendez等，Nature Genetics，15146-156(1997)；美國(guó)專(zhuān)利第5,633,425號(hào)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。例如，可以從具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收人抗體。通過(guò)使內(nèi)源免疫球蛋白基因失活并導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座中，將小鼠體液免疫系統(tǒng)人源化。人免疫球蛋白基因座極其復(fù)雜并且包含許多總體幾乎占人類(lèi)基因組的0.2％的不同區(qū)段。為了確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w組分，必須將人重鏈基因座和輕鏈基因座的大部分導(dǎo)入小鼠基因組中。從在種系構(gòu)型中含有人重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的酵母人工染色體(YAC)的形成開(kāi)始，分步做到這一點(diǎn)。由于每個(gè)插入片段的大小約為1Mb，因此YAC構(gòu)建需要免疫球蛋白基因座的重疊片段的同源重組。通過(guò)含YAC酵母球芽與小鼠胚胎干細(xì)胞的融合，將兩個(gè)YAC(其中一個(gè)含有重鏈基因座，另一個(gè)含有輕鏈基因座)獨(dú)立地導(dǎo)入小鼠中。然后將胚胎干細(xì)胞克隆微注射到小鼠胚泡中。所得嵌合雄鼠根據(jù)其YAC通過(guò)其種系遺傳的能力進(jìn)行選擇，并讓其與鼠抗體產(chǎn)生缺陷型小鼠配種。繁育這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系(其中一個(gè)含有人重鏈基因座，而另一個(gè)含有人輕鏈基因座)，產(chǎn)生當(dāng)免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生人抗體的后代。
克隆鼠免疫球蛋白可變區(qū)的通用技術(shù)在例如以下出版物中有描述Orlandi等，Proc.Nat′l Acad Sci.USA 863833(1989)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)中有描述Carter等，Proc.Nat′l Acad Sci.USA 894285(1992)；Singer等，J.Immun.1502844(1992)；Mountain等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.101(1992)和Coligan，第10.19.1-10.19.11頁(yè)，每個(gè)所述文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
一般而言，通過(guò)各種分子克隆方法，例如RT-PCR、5′-RACE和cDNA文庫(kù)篩選，可以獲得PAM4抗體的Vκ(輕鏈可變區(qū))序列和VH(重鏈可變區(qū))序列。具體地說(shuō)，分別通過(guò)RT-PCR和5′RACE，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆來(lái)自雜交瘤細(xì)胞的MAb PAM4的VH基因和Vκ基因，然后它們的序列通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行測(cè)定。為了證實(shí)其真實(shí)性，按照Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，863833(1989))所描述的方法，讓克隆化VL基因和VH基因在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)為抗體，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。然后，按照Leung等(Mol.Immunol.，321413(1995))所描述的方法，可以基于V基因序列設(shè)計(jì)和構(gòu)建人源化PAM4抗體，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？梢杂猛ㄓ梅肿涌寺〖夹g(shù)(Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第二版(1989))，從任何產(chǎn)生鼠PAM4抗體或人源化PAM4抗體的已知雜交瘤系或轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，制備cDNA。實(shí)施例7描述了hPAM4 MAb所使用的人源化過(guò)程。
抗體一般可以從如下的細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出來(lái)。轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物適于無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于人源化抗體生產(chǎn)，使用HSFM，讓細(xì)胞在滾瓶?jī)?nèi)的500ml培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。將培養(yǎng)物離心，上清液通過(guò)0.2μm膜過(guò)濾。將過(guò)濾的培養(yǎng)基以1ml/min的流速通過(guò)A蛋白柱(1×3cm)。樹(shù)脂柱然后用約10倍柱體積的PBS洗滌，用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸緩沖液(pH 3.5)從柱子上洗出A蛋白結(jié)合抗體。將1.0ml流分收集到裝有10μl 3M Tris(pH 8.6)的試管中，用280/260nm處的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將峰流分合并，對(duì)PBS透析，例如用Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)濃縮抗體。如上所述，用ELISA測(cè)定抗體濃度，抗體濃度用PBS調(diào)至約1mg/ml。向樣品中方便地加入0.01％(w/v)疊氮化鈉(作為防腐劑)。
制備PAM4抗體所使用的引物的核苷酸序列在下面的實(shí)施例7中有討論。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化PAM4抗體或抗體片段包含鼠PAM4單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)和人抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架(FR)區(qū)和人抗體輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其中所述人源化PAM4的輕鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。還優(yōu)選所述人源化抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的FR包含至少一個(gè)被鼠PAM4單克隆抗體的所述相應(yīng)FR取代的氨基酸。
PAM4 MAb可以通過(guò)各種公認(rèn)的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化。這樣的分離技術(shù)包括用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。參見(jiàn)例如Coligan，第2.7.1-2.7.12頁(yè)和第2.9.1-2.9.3頁(yè)。另見(jiàn)Baines等，“免疫球蛋白G(IgG)的純化”，載于METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104頁(yè)(The Humana Press，Inc.1992)。
PAM4 MAb可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)進(jìn)行表征。例如，使用間接酶免疫測(cè)定、流式細(xì)胞儀分析或蛋白質(zhì)印跡分析，可以證實(shí)PAM4 MAb與PAM4抗原結(jié)合的能力。
PAM4抗體片段的產(chǎn)生本發(fā)明考慮了PAM4抗體片段的應(yīng)用?？梢杂靡阎募夹g(shù)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。所述抗體片段是抗體的抗原結(jié)合部分例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等等。例如可以用胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生F(ab′)2片段，可以將F(ab′)2片段的二硫鍵還原產(chǎn)生Fab′。這些方法描述于例如Goldenberg的美國(guó)專(zhuān)利第4,036,945號(hào)和第4,331,647號(hào)和其中所包括的參考文獻(xiàn)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。另見(jiàn)Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89230(1960)；Porter，Biochem.J.73119(1959)；Edelman等，載于METHODS INENZYMOLOGY，第1卷，第422頁(yè)(Academic Press 1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10頁(yè)和第2.10.-2.10.4頁(yè)。另一方面，可以構(gòu)建Fab′表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989，Science，2461274-1281)，以便快速容易地鑒定出具有所需特異性的單克隆Fab′片段。本發(fā)明包括抗體和抗體片段。
單鏈Fv分子(scFv)包含VL區(qū)和VH區(qū)。VL區(qū)和VH區(qū)結(jié)合形成靶結(jié)合部位。這兩個(gè)區(qū)通過(guò)肽接頭(L)進(jìn)一步共價(jià)連接。scFv分子表示VL-L-VH(如果VL區(qū)是scFv分子的N端部分的話)，或者表示VH-L-VL(VH區(qū)是scFv分子的N端部分的話)。制備scFv分子和設(shè)計(jì)合適肽接頭的方法描述于美國(guó)專(zhuān)利第4,704,692號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào)，R.Raag和M.Whitlow，″Single Chain Fvs.″FASEB第9卷73-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker，″Single Chain Antibody VariableRegions，″TIBTECH，第9卷132-137(1991)。這些參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
可以通過(guò)蛋白酶水解全長(zhǎng)抗體或者通過(guò)在大腸桿菌(E.coli)或其它宿主中表達(dá)編碼所述片段的DNA，可以制備抗體片段。采用常規(guī)方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全長(zhǎng)抗體，可以獲得抗體片段。例如，用胃蛋白酶酶解抗體，可以產(chǎn)生抗體片段，提供約100Kd片段，稱(chēng)為F(ab′)2。該片段可以用硫醇還原劑和任選避免二硫鍵斷裂的巰基保護(hù)基進(jìn)一步裂解，產(chǎn)生約50Kd Fab′單價(jià)片段?；蛘撸媚竟系鞍酌该附?，直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。這些方法例如描述于Goldenberg的美國(guó)專(zhuān)利第4,036,945號(hào)和第4,331,647號(hào)和其中所包括的參考文獻(xiàn)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。另見(jiàn)Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89230(1960)；Porter，Biochem.J.73119(1959)；Edelman等，載于METHODS INENZYMOLOGY，第1卷，第422頁(yè)(Academic Press 1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10頁(yè)和第2.10.-2.10.4頁(yè)。
抗體片段的另一形式是編碼一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是在結(jié)構(gòu)上與抗體結(jié)合的表位互補(bǔ)的但比可變區(qū)的其余部分更多變化的抗體可變區(qū)的區(qū)段。因此，CDR有時(shí)也被稱(chēng)為超變區(qū)。一個(gè)可變區(qū)包含三個(gè)CDR。CDR肽可以通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體的CDR的基因來(lái)獲得。例如通過(guò)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從抗體生產(chǎn)細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，制備所述基因。參見(jiàn)例如Larrick等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology 2106(1991)；Courtenay-Luck、″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″載于MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCION，ENGINEERING ANDCLINICAL APPLICATION，Ritter等(編著)，第166-179頁(yè)(CambridgeUniversity Press 1995)；和Ward等，″Genetic Manipulation andExpression of Antibodies，″載于MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(編著)，第137-185頁(yè)(Wiley-Liss，Inc.1995)。
也可以使用裂解抗體的其它方法例如分離重鏈形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段后進(jìn)一步裂解片段或其它酶、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要片段結(jié)合完整抗體所識(shí)別的抗原即可。
人源化PAM4抗體和人PAM4抗體融合蛋白的產(chǎn)生本發(fā)明的抗體融合蛋白可以用各種各樣的常規(guī)方法來(lái)制備，范圍從戊二醛鍵至官能團(tuán)間的更多特定鍵。包括本文描述的融合蛋白的抗體和/或抗體片段最好直接或通過(guò)接頭部分、通過(guò)抗體或片段上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)例如氨基、羧基、苯基、巰基或羥基彼此共價(jià)結(jié)合在一起。除戊二醛之外，還可以使用各種常規(guī)接頭，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、馬來(lái)酰亞胺羥基琥珀酰亞胺酯等等。
用于產(chǎn)生人源化和人PAM4融合蛋白的一個(gè)簡(jiǎn)單方法是將抗體或片段在戊二醛存在下混合在一起。例如通過(guò)氫硼化物還原成仲胺，可以使初始席夫(Schiff)堿鍵穩(wěn)定?？梢杂枚惲蚯杷狨セ蛱级啺反嫖於┳鳛榉俏稽c(diǎn)特異性接頭。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體融合蛋白包含一種人源化或人PAM4單克隆抗體或其片段，其中所述MAb與MUC1抗原的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域結(jié)合。該融合蛋白及其片段優(yōu)先結(jié)合胰腺癌細(xì)胞。該單價(jià)單特異性MAb可用于直接靶向抗原，其中所述MAb與治療劑、診斷劑/檢測(cè)劑或其組合連接，并且將所述蛋白直接給予有需要的患者。
本發(fā)明的PAM4抗體融合蛋白及其片段還可以包含至少兩種人源化或人PAM4單克隆抗體或其片段，其中至少兩個(gè)單克隆抗體或其片段結(jié)合PAM4抗原的不同表位。例如，MAb可以產(chǎn)生抗原特異性雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體，它們對(duì)于PAM4抗原是多價(jià)但卻是單特異性的。兩個(gè)或更多個(gè)scFv分子的非共價(jià)締合可以形成功能性雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。單特異性雙功能抗體是相同scFv的同型二聚體，其中每個(gè)scFv都包含來(lái)自通過(guò)短接頭與同一抗體的VL區(qū)連接的所選抗體的VH區(qū)。雙功能抗體是通過(guò)兩個(gè)scFv的非共價(jià)締合形成的二價(jià)二聚體，產(chǎn)生兩個(gè)Fv結(jié)合部位。三功能抗體是由三個(gè)scFv形成的三價(jià)三聚體，產(chǎn)生三個(gè)結(jié)合部位，而四功能抗體是四個(gè)scFv的四價(jià)四聚體，產(chǎn)生四個(gè)結(jié)合部位。用含有包含VH1-接頭-VL1的重組基因構(gòu)建體的表達(dá)載體，已經(jīng)制備出一些單特異性雙功能抗體。參見(jiàn)Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)；Atwell等，Molecular Immunology 331301-1302(1996)；Holliger等，Nature Biotechnology 15632-631(1997)；Helfrich等，Int.J.Cancer 76232-239(1998)；Kipriyanov等，Int.J.Cancer 77763-772(1998)；Holiger等，Cancer Research 592909-2916(1999))。scFv的構(gòu)建方法公開(kāi)于US-4,946,778(1990)和US-5,132,405(1992)。基于scFv產(chǎn)生多價(jià)單特異性抗體的方法公開(kāi)于US-5,837,242(1998)、US-5,844,094(1998)和WO-98/44001(1998)。所述多價(jià)單特異性抗體融合蛋白結(jié)合可以位于同一抗原或不同抗原上的兩個(gè)或更多個(gè)相同類(lèi)型的表位。增加的價(jià)數(shù)允許額外的相互作用、增加的親和性和更長(zhǎng)的滯留期。這些抗體融合蛋白可以用于直接靶向系統(tǒng)，其中所述抗體融合蛋白與治療劑、診斷劑/檢測(cè)劑或其組合綴合，并且將其直接給予有需要的患者。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是包含不止一個(gè)對(duì)PAM4靶表位具有親和性的抗原結(jié)合部位和一個(gè)或多個(gè)與胰腺癌抗原相關(guān)的額外表位的多價(jià)多特異性抗體或其片段。該融合蛋白是多特異性，因?yàn)槠浣Y(jié)合至少兩個(gè)不同的表位，該表位可以位于相同或不同的抗原上。例如，所述融合蛋白可以包含不止一個(gè)抗原結(jié)合部位，第一個(gè)對(duì)于一個(gè)PAM4抗原表位具有親和性，第二個(gè)對(duì)于另一靶抗原例如TAG-72或CEA具有親和性。另一實(shí)例是可以包含CA19.9 MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)的雙特異性PAM4抗體融合蛋白。這樣的融合蛋白將會(huì)對(duì)CA19.9以及位于MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域具有親和性。本發(fā)明還考慮包含不止一個(gè)對(duì)至少兩個(gè)不同PAM4抗原表位具有親和性的抗原結(jié)合部位的融合蛋白。
本發(fā)明的抗體融合蛋白及其片段可以用于直接靶向系統(tǒng)，其中所述抗體融合蛋白與治療劑、診斷劑/檢測(cè)劑或其組合綴合，并且將其直接給予有需要的患者。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是包含不止一個(gè)對(duì)PAM4靶表位具有親和性的抗原結(jié)合部位和至少一個(gè)對(duì)半抗原分子具有親和性的半抗原結(jié)合部位的多價(jià)多特異性抗體及其片段。例如，雙特異性PAM4抗體融合蛋白可以包含679MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)。單克隆抗體679以高親和力與含有三肽部分即組胺琥珀酰甘氨酰(HSG)的分子結(jié)合。如上所述，這樣的雙特異性PAM4抗體融合蛋白可以例如通過(guò)獲得來(lái)自679的F(ab′)2片段來(lái)制備。679 F(ab′)2片段的鏈間二硫橋被胱氨酸溫和還原，需小心避免輕鏈-重鏈鍵，形成Fab′-SH片段。該SH基團(tuán)被過(guò)量的雙馬來(lái)酰亞胺接頭(1，1′-(亞甲基二-4，1-亞苯基)雙-馬來(lái)酰亞胺)活化。將PAM4 MAb轉(zhuǎn)變成Fab′-SH，然后與活化MR23 Fab′-SH片段反應(yīng)，獲得雙特異性PAM4抗體融合蛋白。雙特異性抗體融合蛋白例如此種蛋白可以用于親和力增強(qiáng)系統(tǒng)，其中靶抗原用所述融合蛋白進(jìn)行預(yù)先靶向，隨后用與由預(yù)靶向形成的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合的診斷劑或治療劑靶向。
雙特異性抗體可以通過(guò)各種各樣的常規(guī)方法和基因工程方法制備，所述常規(guī)方法例如完整IgG或優(yōu)選F(ab′)2片段的混合物的二硫鍵裂解和重新形成，不止一個(gè)雜交瘤融合形成產(chǎn)生具有不止一種特異性的抗體的多雜交瘤(polyoma)。通過(guò)氧化性裂解Fab′片段，導(dǎo)致不同抗體的還原性裂解，制備雙特異性抗體融合蛋白。最好如下進(jìn)行這一步將通過(guò)用胃蛋白酶消化兩種不同的抗體產(chǎn)生的兩種不同的F(ab′)2片段混合，還原性裂解形成Fab′片段的混合物，接著氧化性重新形成二硫鍵，產(chǎn)生包括含對(duì)每個(gè)原始表位Fab′potion特異性的雙特異性抗體融合蛋白的F(ab′)2片段混合物。抗體融合蛋白制備的通用技術(shù)可以見(jiàn)于例如Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.93470(1961)；H_mmerling等，J.Exp.Med.1281461(1968)和美國(guó)專(zhuān)利第4,331,647號(hào)。本發(fā)明考慮包含至少一種第一PAM4單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，所述第二單克隆抗體或其片段不是本發(fā)明的PAM4單克隆抗體或其片段。
通過(guò)使用異雙官能接頭例如馬來(lái)酰亞胺羥基琥珀酰亞胺酯，可以實(shí)現(xiàn)更多選擇的連接。酯與抗體或片段的反應(yīng)會(huì)將抗體或片段上的氨基衍生化，然后所得衍生物可以與例如具有游離巰基的抗體Fab片段(或具有附在其上的巰基的較大片段或完整片段，通過(guò)例如Traut試劑)反應(yīng)。這樣的接頭很少與同一抗體中的基團(tuán)交聯(lián)，從而改進(jìn)了對(duì)鍵的選擇性。
最好將抗體或片段在遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位的位點(diǎn)進(jìn)行連接。通過(guò)例如如上所述經(jīng)裂解的鏈間巰基的鍵，可以完成這一步。另一種方法包括使具有氧化糖部分的抗體與另一具有至少一個(gè)游離氨基官能的抗體反應(yīng)。這產(chǎn)生初始席夫堿(mime)連接，最好通過(guò)還原成仲胺而穩(wěn)定，例如通過(guò)氫硼化物還原，形成最終的復(fù)合物。這樣的位點(diǎn)特異性連接公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第4,671,958號(hào)(對(duì)于小分子)和美國(guó)專(zhuān)利第4,699,784號(hào)(對(duì)于較大附加物)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
通過(guò)將PAM4抗原結(jié)合部分加入到雙特異性人源化或人PAM4抗體融合蛋白中，可以獲得多特異性PAM4抗體融合蛋白。例如，采用上述的雙馬來(lái)酰亞胺活化方法，可以使雙特異性抗體融合蛋白與2-亞氨基噻烷反應(yīng)，引入一個(gè)或多個(gè)用于使所述雙特異性融合蛋白與第三PAM4單克隆抗體或片段偶聯(lián)的巰基。這些用于產(chǎn)生抗體融合蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第4,925,648號(hào)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
具有長(zhǎng)度大于12個(gè)氨基酸殘基的接頭(例如15個(gè)殘基接頭或18個(gè)殘基接頭)的scFv允許同一鏈上的VH區(qū)和VL區(qū)之間的相互作用，一般形成單體、二聚體(稱(chēng)為雙功能抗體)和少量更高質(zhì)量的多聚體的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.(1994)221151-157)。然而，具有5個(gè)或更少氨基酸殘基的接頭的scFv阻止同一鏈上VH區(qū)和VL區(qū)的分子內(nèi)配對(duì)，迫使與不同鏈上的VH區(qū)和VL區(qū)配對(duì)。介于3個(gè)殘基和12個(gè)殘基之間的接頭主要形成二聚體(Atwell等，Protein Engineering(1999)12597-604)。用介于0殘基和2個(gè)殘基之間的接頭，形成scFv的三聚體(稱(chēng)為三功能抗體)、四聚體(稱(chēng)為四功能抗體)或較高寡聚體結(jié)構(gòu)；然而，除接頭長(zhǎng)度之外，寡聚化的準(zhǔn)確模式似乎還取決于V區(qū)的組成和取向。例如，抗神經(jīng)氨酸苷酶抗體NC10的scFv主要形成具有0殘基接頭的三聚體(VH至VL取向)或四聚體(VL至VH取向)(Dolezal等，Protein Engineering(2000)13565-574)。對(duì)于用具有1個(gè)殘基和2個(gè)殘基接頭的NC10構(gòu)建的scFv，VH至VL取向主要形成雙功能抗體(Atwell等，Protein Engineering(1999)12597-604)；相反，VL至VH取向形成四聚體、三聚體、二聚體和較高質(zhì)量多聚體的混合物(Dolezal等，Protein Engineering(2000)13565-574)。對(duì)于用抗CD19抗體HD37以VH至VL取向構(gòu)建的scFv，0殘基接頭只形成三聚體，1個(gè)殘基接頭只形成四聚體(Le Gall等，F(xiàn)EBS Letters(1999)453164-168)。
表達(dá)載體和宿主細(xì)胞表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通常，基因表達(dá)處于某些調(diào)節(jié)元件的控制之下，所述調(diào)節(jié)元件包括組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子。這樣的基因被認(rèn)為是與調(diào)節(jié)元件“有效連接”的。啟動(dòng)子是指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。結(jié)構(gòu)基因是轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)后翻譯成以具體多肽為特征的氨基酸序列的DNA序列。通常，啟動(dòng)子位于基因的5′區(qū)，靠著結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率應(yīng)隨誘導(dǎo)劑而增加。相反，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑的調(diào)節(jié)。增強(qiáng)子是可以增加轉(zhuǎn)錄效率的DNA調(diào)節(jié)元件，并且與增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向無(wú)關(guān)。
分離的DNA分子是沒(méi)有整合在生物體基因組DNA中的DNA片段。例如，克隆化PAM4抗原基因是已從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組DNA分離出來(lái)的DNA片段。分離的DNA分子的另一個(gè)實(shí)例是沒(méi)有整合在生物體基因組DNA中的化學(xué)合成的DNA分子?；パa(bǔ)DNA(cDNA)是以mRNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶形成的單鏈DNA分子。通常，用與mRNA的一部分互補(bǔ)的短的合成寡核苷酸作為起始逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生第一鏈DNA的引物。本領(lǐng)域技術(shù)人員也用術(shù)語(yǔ)“cDNA”表示由這樣的單鏈DNA分子及其互補(bǔ)DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。
克隆載體是在宿主細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的DNA分子例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w?？寺≥d體通常含有一個(gè)或少量限制內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)以及標(biāo)記基因，其中在所述限制內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)將外源DNA序列以確定的方式插入而不會(huì)喪失載體的必需生物學(xué)功能，所述標(biāo)記基因適合用于對(duì)用克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定和選擇。標(biāo)記基因通常包括提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。重組宿主可以是任何含有克隆載體或表達(dá)載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括那些經(jīng)基因工程改造以在宿主細(xì)胞的染色體或基因組中含有克隆化基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)表達(dá)是指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，就結(jié)構(gòu)基因而言，表達(dá)包括結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后mRNA翻譯成一個(gè)或多個(gè)多肽。
合適的宿主細(xì)胞包括微生物或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主是人細(xì)胞系PER.C6，其已開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生MAb及其它的融合蛋白。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是包含編碼PAM4 MAb、綴合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主細(xì)胞。用含有處于人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子控制之下的Ad血清型5(Ad5)E1A編碼序列和E1B編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞，產(chǎn)生PER.C6細(xì)胞(WO 97/00326)。E1A和E1B分別是腺病毒早期基因激活蛋白1A和1B。所述方法和組合物尤其可用于產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的翻譯后修飾(例如糖基化)的目標(biāo)人重組蛋白。一些特征使PER.C6尤其可用作重組蛋白生產(chǎn)的宿主，例如，PER.C6是充分表征的人細(xì)胞系，其開(kāi)發(fā)遵從藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(goodlaboratory practices)。此外，PER.C6可以在不含任何人或動(dòng)物源性蛋白的已知成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成為懸浮培養(yǎng)物，并且其生長(zhǎng)與滾瓶、搖瓶、旋轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器兼容，倍增時(shí)間約為35小時(shí)。最后，存在的E1A引起處于CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制之下的基因表達(dá)上調(diào)，而存在的E1B阻止可能通過(guò)重組轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)增加的p53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生比常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系多2-200倍的重組蛋白和/或蛋白質(zhì)性物質(zhì)。
供治療和診斷用的人源化PAM4抗體和人PAM4抗體本發(fā)明考慮一種診斷或治療患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的包含PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段的治療用綴合物，其中所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段與至少一種診斷劑和/或治療劑結(jié)合，然后將其配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。還優(yōu)選一種用于診斷或治療癌癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者包含一個(gè)或多個(gè)PAM4抗原的抗原結(jié)合部位以及一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合部位的多價(jià)多特異性抗體或其片段，等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以清除所述患者血流中的非抗體量；然后給予所述患者結(jié)合所述多價(jià)多特異性抗體或其片段的結(jié)合部位、包含以下組分的載體分子診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是多價(jià)單特異性抗體或其片段。
單克隆抗體在體外診斷中的應(yīng)用是眾所周知的。參見(jiàn)例如Carlsson等，Bio/Technology 7(6)567(1989)。例如，單克隆抗體可用于檢測(cè)來(lái)自活檢樣品的組織中存在的腫瘤相關(guān)抗原。采用放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和熒光免疫測(cè)定等技術(shù)，單克隆抗體也可以用于測(cè)定臨床體液樣品中腫瘤相關(guān)抗原的含量。
靶向腫瘤的單克隆抗體和毒素的綴合物可用于在體內(nèi)選擇性殺死癌細(xì)胞(Spalding，Bio/Technology 9(8)701(1991)；Goldenberg，Scientific American Science & Medicine 1(1)64(1994))。例如，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中進(jìn)行的治療研究已經(jīng)證明攜帶細(xì)胞毒放射性核素的抗體的抗腫瘤活性。有關(guān)對(duì)動(dòng)物模型和治療研究的討論，參見(jiàn)實(shí)施例3和實(shí)施例5。(Goldenberg等，Cancer Res.414354(1981)，Cheung等，J.Nat′l Cancer Inst.77739(1986)和Senekowitsch等，J.Nucl.Med.30531(1989))。
人源化抗體和全人抗體及其片段適用于治療方法和診斷方法。因此，本發(fā)明考慮一種將診斷劑或治療劑或其組合傳遞到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含與至少一種診斷劑和/或治療劑綴合的PAM4抗體或其片段的組合物和(ii)給予有需要的患者所述診斷用抗體綴合物或治療用抗體綴合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PAM4抗體及其片段是人源化或全人的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化PAM4抗體和全人PAM4抗體及其片段用于治療惡性腫瘤的方法中。
本文還描述靶向癌細(xì)胞、包括含本發(fā)明的抗體中任一個(gè)的PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段的抗體組分的診斷用綴合物或治療用綴合物，其中所述抗體組分與至少一種診斷劑或至少一種治療劑結(jié)合。優(yōu)選所述診斷用綴合物是光敏診斷劑/檢測(cè)劑、超聲檢測(cè)劑或MRI造影劑。更優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑是其能量介于20keV和4000keV之間的放射性核素。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種用于診斷或治療惡性腫瘤的方法，所述方法包括給予治療或診斷有效量的至少一種裸PAM4抗體或其片段和/或PAM4融合蛋白或其片段，任選將所述PAM4抗體、融合蛋白或其片段與藥用賦形劑一起配制。
治療用組合物含有至少一種單獨(dú)和未綴合的、或者綴合或未綴合的并且與其它抗體或其片段例如其它人源化抗體或嵌合抗體、人抗體、治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑組合的人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體或其片段。抗相同或不同表位或抗原的裸抗體或綴合抗體也可以與本發(fā)明的一種或多種PAM4抗體或其片段組合。
因此，本發(fā)明考慮給予作為裸抗體或抗體片段、單獨(dú)的PAM4抗體及其片段(包括PAM4融合蛋白及其片段)，或者作為多模式療法給予。所述抗體最好是人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體或其片段。本發(fā)明的多模式療法還包括補(bǔ)充給予其它抗體的裸PAM4抗體的免疫療法，所述其它抗體為裸抗體、融合蛋白的形式或者作為免疫綴合物。例如，一種人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體可以與另一種裸人源化PAM4或其它抗體、或者與同位素、一種或多種化療藥、細(xì)胞因子、毒素或其組合綴合的人源化PAM4或其它抗體組合。例如，本發(fā)明考慮在用其它的胰腺腫瘤相關(guān)抗體治療之前、同時(shí)或之后用裸PAM4抗體或綴合PAM4抗體或其片段治療，所述胰腺腫瘤相關(guān)抗體例如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、la3、aLea抗體及其它的路易斯抗原(例如Le(y))的抗體以及抗以下的抗體癌胚抗原(CEA)、結(jié)腸-特異性抗原-p(CSAp)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子和IL-6以及癌基因產(chǎn)物和抗腫瘤壞死因子的抗體。這些實(shí)體瘤抗體尤其可以是裸或綴合的藥物、毒素、同位素、外部輻射或免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明中也可以使用人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體和毒素的融合蛋白。許多不同的抗體組合與治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑一起可以構(gòu)建成裸抗體或者構(gòu)建成部分裸和部分綴合的抗體?；蛘撸煌穆憧贵w可用于與其它治療劑例如細(xì)胞毒性藥物或輻射連續(xù)、同時(shí)或序貫聯(lián)合用藥。
本文中描述的與診斷劑或治療劑連接的單特異性抗體直接靶向PAM4陽(yáng)性腫瘤。所述單特異性分子選擇性結(jié)合靶向抗原，并且由于分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目增加，對(duì)靶細(xì)胞的親和性也增加，因此在所需部位觀察到較長(zhǎng)的保留時(shí)間。此外，沒(méi)有結(jié)合抗原的分子被機(jī)體快速清除，從而使正常組織的暴露減至最小。多特異性抗體的應(yīng)用是在AES系統(tǒng)中，其中PAM4預(yù)先靶向陽(yáng)性腫瘤，隨后特異性傳遞診斷劑或治療劑。所述試劑由含組胺琥珀酰甘氨酰(HSG)的肽攜帶。命名為679(IgG1，K)的鼠單克隆抗體以高親和力與含有三肽部分HSG的分子結(jié)合(Morel等，Molecular Immunology，27，995-1000，1990)。679MAb可以與HSG和靶抗原結(jié)合的hPAM4形成雙特異性抗體。也可以使用替代的半抗原。這些抗體與靶向抗原選擇性結(jié)合，使得可以增加親和性并且在所需部位的保留時(shí)間更長(zhǎng)。此外，未結(jié)合抗原的雙功能抗體被機(jī)體快速清除，從而使正常組織的暴露減至最小。PAM4抗體及其片段和綴合物可以用來(lái)診斷和治療哺乳動(dòng)物疾病例如癌癥。
按照本發(fā)明將診斷劑或治療劑傳遞到靶供診斷或治療用包括提供帶有診斷劑或治療劑的PAM4抗體或其片段，并且將所述抗體給予有需要的患者。診斷還需要用已知技術(shù)檢測(cè)結(jié)合蛋白的步驟。
在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“診斷”或“檢測(cè)”可互換使用。鑒于診斷通常是指確定組織的具體組織學(xué)狀態(tài)，因此檢測(cè)可鑒別含有特定抗原的組織、損害或生物體并對(duì)其進(jìn)行定位。
將本發(fā)明含有診斷劑或治療劑的抗體及其片段給予哺乳動(dòng)物可以通過(guò)以下給藥途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)局部導(dǎo)管輸注或直接損害內(nèi)注射。當(dāng)采用注射給予所述抗體時(shí)，給藥可以是通過(guò)連續(xù)輸注或者通過(guò)單次或多次快速濃注。
帶有所述診斷劑或治療劑的抗體可以作為供人或哺乳動(dòng)物治療和診斷用的試劑盒提供，所述試劑盒包含藥學(xué)上可接受的注射用溶媒、最好是生理pH和濃度下的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。所述制劑最好是無(wú)菌的，特別是將其計(jì)劃供人用時(shí)。所述試劑盒的任選組分包括穩(wěn)定劑、緩沖劑、標(biāo)記試劑、放射性同位素、順磁化合物、用于提高清除率的第二抗體和常規(guī)注射器、柱、小瓶等。
裸抗體療法可以將治療有效量的裸人源化PAM4抗體和全人PAM4抗體或其片段或PAM4融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。裸人源化PAM4抗體和全人PAM4抗體及其片段的功效也可通過(guò)以下方法增強(qiáng)給這些裸抗體補(bǔ)充一種或多種其它的裸抗體、人源化PAM4抗體和全人PAM4抗體的一種或多種免疫綴合物、綴合一種或多種治療劑(包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、寡核苷酸、激素類(lèi)拮抗劑、酶、酶抑制劑、治療性放射性核素、血管生成抑制劑等)，按處方上的給藥方案與PAM4抗體或其片段同時(shí)或序貫用藥?？梢匝a(bǔ)充裸PAM4抗體及其片段的裸抗體可以針對(duì)同一腫瘤類(lèi)型或者針對(duì)可以被募集以增強(qiáng)所選裸抗體的抗腫瘤效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如CD40+細(xì)胞)。
PAM4免疫綴合物本發(fā)明也考慮與至少一種治療劑和/或診斷劑/檢測(cè)劑綴合的人源化PAM4抗體和人PAM4抗體及其片段在治療或診斷中的用途。對(duì)于免疫療法，目的是將細(xì)胞毒性劑量的放射性、毒素或藥物傳遞到靶細(xì)胞，同時(shí)使非靶組織的暴露減至最小。本發(fā)明的PAM4抗體可用來(lái)診斷和治療胰腺腫瘤。
可以將本發(fā)明的任何抗體、抗體融合蛋白及其片段與一種或多種治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑綴合。一般而言，一種治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑與每種抗體、融合蛋白或其片段連接，但不止一種治療劑和/或診斷劑/檢測(cè)劑可以與同一抗體或抗體片段連接。如果Fc區(qū)不存在(例如當(dāng)用作免疫綴合物的抗體組分的抗體是抗體片段時(shí))，有可能將糖部分引入全長(zhǎng)抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)中。參見(jiàn)例如Leung等，J.Immunol.1545919(1995)；Hansen等，美國(guó)專(zhuān)利第5,443,953號(hào)(1995)，Leung等，美國(guó)專(zhuān)利第6,254,868號(hào)，所有所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。工程糖部分可以用來(lái)連接治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑。
肽與抗體組分通過(guò)抗體糖部分綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn)例如Shih等，Int.J.Cancer 41832(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 461101(1990)；和Shih等，美國(guó)專(zhuān)利第5,057,313號(hào)，所有所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。通用方法包括使具有氧化糖部分的抗體組分與具有至少一個(gè)游離氨基官能并且加載許多肽的載體聚合物反應(yīng)。該反應(yīng)產(chǎn)生初始席夫堿(亞胺)鍵，該鍵可以由于還原成仲胺形成最終的綴合物而穩(wěn)定。
本發(fā)明的抗體融合蛋白及其片段包含兩種或更多種抗體或其片段，并且每種組成該融合蛋白的抗體都可以含有至少一種治療劑和/或診斷劑/檢測(cè)劑。例如，抗體融合蛋白可以包含一種抗體(兩個(gè)抗原結(jié)合部位)和一個(gè)抗體片段、兩個(gè)抗體片段或者兩種抗體。所述抗體融合蛋白則可以與至少一種診斷劑/檢測(cè)劑和/或治療劑綴合。
因此，所述抗體融合蛋白的一種或多種抗體或其片段可以具有不止一種所連接的治療劑和/或診斷劑/檢測(cè)劑。此外，所述治療劑并不需要是相同的，而可以是不同的治療劑，例如，可以將藥物和放射性同位素與同一融合蛋白連接。具體地說(shuō)，IgG可以是用131I放射性標(biāo)記并且與藥物連接。131I可以摻入到IgG的酪氨酸中，所述藥物連接到IgG賴(lài)氨酸的ε氨基上。治療劑和診斷劑/檢測(cè)劑也可以連接到還原的SH基團(tuán)上和連接到糖側(cè)鏈上。
各種各樣的診斷劑和治療劑可以同時(shí)或序貫給藥，或者最好與本發(fā)明的抗體綴合，所述診斷劑和治療劑例如藥物、毒素、寡核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素類(lèi)拮抗劑、酶、酶抑制劑、治療性放射性核素、血管生成抑制劑等。此處列舉的治療劑是那些也可用于與如上所述的裸抗體獨(dú)立給藥的藥物。治療劑包括例如化療藥，例如長(zhǎng)春花生物堿、蒽環(huán)霉素、吉西他濱、表鬼臼毒素、紫杉烷類(lèi)、抗代謝藥、烷化劑、抗生素、SN-38、COX-2抑制劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥和細(xì)胞凋亡劑、特別是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜樹(shù)堿(camptothecans)和其它來(lái)自這些及其它類(lèi)別的抗癌藥的藥物等等。供同時(shí)或序貫給藥用或供免疫綴合物和抗體融合蛋白制備用的其它有用的癌癥化療藥包括氮芥、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類(lèi)似物、COX-2抑制劑、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、鉑配位絡(luò)合物、激素等等。合適的化療藥描述于REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)以及這些出版物的修訂版本。其它合適的化療藥例如實(shí)驗(yàn)用藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化PAM4抗體及其片段與吉西他濱綴合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在給予本發(fā)明的裸人源化PAM4抗體或綴合人源化PAM4抗體或其片段之前、之后或同時(shí)給予吉西他濱。優(yōu)選所述綴合的人源化PAM4抗體或抗體片段與放射性核素綴合。
毒素可以來(lái)源于動(dòng)物、植物或微生物。毒素例如假單胞菌外毒素也可與本發(fā)明的PAM4和hPAM4抗體的免疫綴合物的治療劑部分復(fù)合，或者形成本發(fā)明的PAM4和hPAM4抗體的免疫綴合物的治療劑部分。其它適用于所述綴合物或其它融合蛋白制備的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。參見(jiàn)例如Pastan等，Cell 47641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians 4443(1994)。適用于本發(fā)明的其它毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利6,077,499中，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
免疫調(diào)節(jié)劑例如細(xì)胞因子也可以與PAM4和hPAM4免疫綴合物的治療劑部分綴合，或者形成PAM4和hPAM4免疫綴合物的治療劑部分，或者可以與本發(fā)明的人源化或人PAM4抗體或其片段或PAM4融合蛋白或其片段一起給予，但不與本發(fā)明的人源化或人PAM4抗體或其片段或PAM4融合蛋白或其片段綴合。所述PAM4融合蛋白或其片段可以包含與不同抗原結(jié)合的一種或多種抗體或其片段。例如，所述融合蛋白可以結(jié)合PAM4抗原以及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或因子?；蛘?，患者可以接受裸PAM4抗體、融合蛋白或其片段，獨(dú)立給予細(xì)胞因子，可以在給予所述裸PAM4抗體之前、同時(shí)或之后給予細(xì)胞因子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素例如腫瘤壞死因子(TNF)和造血因子例如白介素(例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18、IL-21)、集落刺激因子(例如粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β和干擾素-γ)、命名為“S1因子”的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素和血小板生成素。合適免疫調(diào)節(jié)劑部分的實(shí)例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α等等。
或者，本發(fā)明的抗體和片段可以通過(guò)將抗體與酶連接而被可檢測(cè)標(biāo)記。當(dāng)抗體-酶綴合物在合適底物存在下溫育時(shí)，酶部分與底物反應(yīng)，產(chǎn)生可被檢測(cè)的化學(xué)部分，例如通過(guò)分光光度計(jì)、熒光計(jì)或目測(cè)法。可用于可檢測(cè)標(biāo)記抗體的酶的實(shí)例包括蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑可以通過(guò)二硫鍵形成連接在還原抗體組分的絞鏈區(qū)。作為一個(gè)可供選擇的方法，可以使用異雙官能交聯(lián)劑例如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，將所述試劑與抗體組分連接。Yu等，Int.J.Cancer 56244(1994)。所述綴合的通用技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。參見(jiàn)例如Wong，CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibody by Chemical Methods，″載于MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(編著)，第187-230頁(yè)(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″載于MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(編著)，第60-84頁(yè)(Cambridge University Press 1995)?；蛘?，所述治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑可以通過(guò)抗體Fc區(qū)中的糖部分綴合。所述糖基團(tuán)可用于增加與巰基結(jié)合的同一試劑的載藥量，或者所述糖部分可以用于結(jié)合不同的肽。
在本發(fā)明的方法中，所述靶向構(gòu)建體可以包含一種或多種可用于檢測(cè)患病組織的放射性同位素。特別有用的診斷用放射性核素包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ發(fā)射體、β發(fā)射體或正電子發(fā)射體，其衰變能量?jī)?yōu)選在20-4,000keV的范圍之內(nèi)，更優(yōu)選在25-4,000keV的范圍之內(nèi)，甚至更優(yōu)選在25-1,000keV的范圍之內(nèi)，再更優(yōu)選在70-700keV的范圍之內(nèi)。有用正電子發(fā)射放射性核素的總衰變能量?jī)?yōu)選＜2,000keV，更優(yōu)選＜1,000keV，最優(yōu)選＜700keV。可用作利用γ射線檢測(cè)的診斷劑/檢測(cè)劑的放射性核素包括但不限于51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、111In、114mIn、123I、125I、131I、169Yb、197Hg和201Tl。有用的γ射線發(fā)射放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選為20-2000keV，更優(yōu)選為60-600keV，最優(yōu)選100-300keV。
在本發(fā)明的方法中，靶向構(gòu)建體可以包含一種或多種可用于治療患病組織的放射性同位素。特別有用的治療性放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。所述治療性放射性核素的衰變能量對(duì)于俄歇發(fā)射體，在20-6,000keV的范圍之內(nèi)，優(yōu)選在60-200keV的范圍之內(nèi)；對(duì)于β發(fā)射體，在100-2,500keV的范圍之內(nèi)；對(duì)于α發(fā)射體，在4,000-6,000keV的范圍之內(nèi)。有效的β粒子發(fā)射核素的最大衰變能量?jī)?yōu)選為20-5,000keV，更優(yōu)選為100-4,000keV，最優(yōu)選為500-2,500keV。還優(yōu)選基本上為俄歇發(fā)射粒子衰變的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有效β粒子發(fā)射核素的衰變能量?jī)?yōu)選＜1,000keV，更優(yōu)選＜100keV，最優(yōu)選＜70keV。還優(yōu)選基本上為產(chǎn)生α粒子衰變的放射性核素。這樣的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有效α粒子發(fā)射放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選為2,000-10,000keV，更優(yōu)選為3,000-8,000keV，最優(yōu)選為4,000-7,000keV。
例如，67Cu，由于其61.5小時(shí)半衰期和大量供給β粒子和γ射線而被認(rèn)為是更有希望的供放射免疫療法用的放射性同位素，可以使用螯合劑對(duì)溴乙酰氨基-芐基-四乙胺四乙酸(TETA)與PAM4抗體綴合。Chase，參見(jiàn)上文。或者，使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，可以使發(fā)射高能β粒子的90Y與PAM4抗體、融合蛋白或其片段偶聯(lián)。
其它潛在的放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，放射性致敏劑可以與本發(fā)明的裸PAM4抗體或綴合PAM4抗體或抗體片段聯(lián)用。例如，所述放射性致敏劑可以與放射性標(biāo)記PAM4抗體或抗體片段聯(lián)用。與單獨(dú)用放射性標(biāo)記抗體或抗體片段治療相比，加入放射性致敏劑可以產(chǎn)生增強(qiáng)的效力。放射性致敏劑描述于D.M.Goldenberg(編著)，CANCERTHERAPY WITH RADIOLABILED ANTIBODIES，CRC Press(1995)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
通常將會(huì)按相似的方式實(shí)現(xiàn)具有加載附加硼的載體、供熱中子激活療法用的本發(fā)明PAM4抗體或其片段或PAM4融合蛋白或其片段。然而，最好是等到非靶向PAM4免疫綴合物清除，然后進(jìn)行中子照射?？梢允褂媒Y(jié)合PAM4抗體的抗體，加速清除。有關(guān)該一般原理的描述，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,624,846號(hào)。例如，碳硼烷等硼附加物可以與PAM4抗體連接。用側(cè)接支鏈上的羧基官能可以制備碳硼烷，這是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢酝ㄟ^(guò)激活碳硼烷的羧基并與載體上的氨基縮合，完成碳硼烷與載體例如氨基葡聚糖的連接。然后中間綴合物與PAM4抗體綴合。給予PAM4抗體綴合物后，硼附加物被熱中子照射所激活，轉(zhuǎn)變成放射性原子，放射性原子通過(guò)α發(fā)射衰變，產(chǎn)生高毒性短程效應(yīng)。
此外，本發(fā)明包括診斷患者的癌癥的方法。通過(guò)給予與藥學(xué)上適合的賦形劑一起配制的診斷有效量的診斷用綴合物，然后檢測(cè)所述標(biāo)記，可以完成診斷。所述PAM4抗體、融合蛋白及其片段可以與診斷劑/檢測(cè)劑綴合，或者在給予所述診斷劑/檢測(cè)劑之前、同時(shí)或之后，給予未與診斷劑/檢測(cè)劑綴合的所述PAM4抗體、融合蛋白及其片段。上文已經(jīng)論述了可以用作診斷劑/檢測(cè)劑的放射性物質(zhì)。合適的非放射性診斷劑/檢測(cè)劑是適用于磁共振成像、X射線成像、計(jì)算機(jī)斷層成像或超聲成像的造影劑。當(dāng)與本發(fā)明抗體一起使用時(shí)，磁成像劑包括例如非放射性金屬例如錳、鐵和釓、與金屬-螯合物組合的絡(luò)合物，包括2-芐基-DTPA及其一甲基類(lèi)似物和環(huán)己基類(lèi)似物。參見(jiàn)于2001年10月10日申請(qǐng)的美國(guó)順序號(hào)09/921,290，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
本發(fā)明考慮的造影劑例如MRI造影劑包括例如釓離子、鑭離子、鏑離子、鐵離子、錳離子或其它的對(duì)比標(biāo)記、CT造影劑和超聲造影劑均適用于本發(fā)明。
適合本發(fā)明的順磁離子包括鉻(III)、錳(III)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)，其中特別優(yōu)選釓。
可用于其它方面例如X射線成像的離子包括但不限于鑭(III)、金(III)、鉛(II)、尤其是鉍(III)。熒光標(biāo)記包括羅丹明、熒光素和腎造影劑。羅丹明和熒光素常常通過(guò)異硫氰酸酯中間體連接。
金屬也可用于診斷劑/檢測(cè)劑，包括那些供磁共振成像技術(shù)用的金屬。這些金屬包括但不限于釓、錳、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥和釹。為了給抗體組分加載放射性金屬或順磁離子，有必要使其與具有連接多個(gè)螫合基團(tuán)以結(jié)合離子的長(zhǎng)尾的試劑反應(yīng)。這樣的尾可以是具有可以結(jié)合螫合基團(tuán)的側(cè)基的聚合物，例如多聚賴(lài)氨酸、多糖或其它的衍生化鏈或可衍生鏈等，所述螫合基團(tuán)例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的基團(tuán)。采用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，使螯合物與PAM4抗體、融合蛋白或其片段偶聯(lián)。螯合物通常通過(guò)能與免疫反應(yīng)性最小損失和最小聚集和/或內(nèi)部交聯(lián)的分子形成化學(xué)鍵的基團(tuán)與抗體連接。螯合物與抗體綴合的其它更與眾不同的方法和試劑公開(kāi)于1989年4月25日授予Hawthorne的美國(guó)專(zhuān)利4,824,659，題目為“抗體綴合物”，所述專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-芐基-DTPA及其一甲基類(lèi)似物和環(huán)己基類(lèi)似物，供與總能量范圍為20-2,000keV的診斷用同位素聯(lián)用。相同的螯合物當(dāng)與非放射性金屬例如錳、鐵和釓絡(luò)合時(shí)，當(dāng)與本發(fā)明抗體聯(lián)用時(shí)可用于MRI。大環(huán)螯合物例如NOTA、DOTA和TETA供與各種各樣的金屬和放射性金屬聯(lián)用，最特別是分別與鎵、釔和銅的放射性核素聯(lián)用。這樣的金屬-螯合物絡(luò)合物可以根據(jù)目標(biāo)金屬的環(huán)大小定制，因而是非常穩(wěn)定的。本發(fā)明包括其它的環(huán)型螯合物例如大環(huán)聚醚，它們對(duì)于用于RAIT的穩(wěn)定結(jié)合核素例如223Ra有價(jià)值。
不透射線材料和造影劑材料可用來(lái)增強(qiáng)X射線和計(jì)算機(jī)斷層成像，并且包括碘化合物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物等。特殊的化合物包括鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鹽、丙碘酮和氯化亞鉈。
本發(fā)明的抗體、融合蛋白及其片段也可被熒光化合物標(biāo)記。存在的熒光-標(biāo)記MAb可以通過(guò)使抗體暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光下，然后檢測(cè)所產(chǎn)生的熒光來(lái)確定。熒光標(biāo)記化合物包括異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。熒光標(biāo)記的抗體對(duì)于流式細(xì)胞儀分析特別有用。
或者，本發(fā)明的抗體、融合蛋白及其片段可以通過(guò)使抗體與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)被可檢測(cè)標(biāo)記。存在的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的MAb通過(guò)檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的發(fā)光的存在來(lái)確定。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例包括魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
同樣，生物發(fā)光化合物可用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體及其片段。生物發(fā)光是一種在生物系統(tǒng)中存在的化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白質(zhì)增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。存在的生物發(fā)光蛋白可以通過(guò)檢測(cè)存在的發(fā)光來(lái)確定。可用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物包括螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
因此，描述一種診斷患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括用包含裸PAM4單克隆抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物對(duì)來(lái)自所述患者的標(biāo)本(流體、組織或細(xì)胞)進(jìn)行體外診斷分析。免疫組織化學(xué)可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織中存在的PAM4。優(yōu)選進(jìn)行診斷的惡性腫瘤是癌癥。最優(yōu)選所述癌癥是胰腺癌。
另外，可以使螯合劑例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或合適肽與可檢測(cè)標(biāo)記例如熒光分子或細(xì)胞毒性劑例如重金屬或放射性核素綴合。例如，通過(guò)使光敏劑或染料與抗體融合蛋白綴合，可以獲得治療上有用的免疫綴合物。熒光組合物例如熒光染料及其它對(duì)可見(jiàn)光敏感的色原或染料例如卟啉已經(jīng)用來(lái)檢測(cè)并且通過(guò)將合適的光直接導(dǎo)向損害部位而治療所述損害。在治療中，這被稱(chēng)之為光輻射、光線療法或光動(dòng)力療法(Jori等(編著)，PHOTODYNAMICTHERAPY OF ATUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto1985)；van den Bergh，Chem.Britain 22430(1986))。此外，使單克隆抗體與光活化染料偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)光線療法。Mew等，J.Immunol.1301473(1983)；同上，Cancer Res.454380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.AcadSci.USA 838744(1986)；同上，Photochem Photobiol.4683(1987)；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288471(1989)；Tatsuta等，Lasers Surg.Med.9422(1989)；Pelegrin等，Cancer 672529(1991)。然而，這些早期研究并沒(méi)有包括內(nèi)窺鏡檢查治療的應(yīng)用，尤其是抗體片段或亞片段的應(yīng)用。因此，本發(fā)明考慮包含光敏劑或染料的免疫綴合物的治療用途。
對(duì)于治療目的，將本發(fā)明的PAM4抗體及其片段以治療有效量給予患者。如果給予的量在生理學(xué)上是顯著性的，則認(rèn)為抗體是以“治療有效量”給予的。如果某一物質(zhì)的存在導(dǎo)致接受的患者的生理機(jī)能發(fā)生可檢測(cè)變化，則該物質(zhì)在生理學(xué)上有顯著性。
診斷劑/檢測(cè)劑是可以給予的、與抗體部分即抗體或抗體片段或亞片段、融合蛋白及其片段綴合的并可用于通過(guò)對(duì)含有疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞進(jìn)行定位來(lái)診斷/檢測(cè)疾病的分子或原子。有效的診斷劑/檢測(cè)劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物)、不透射線物質(zhì)(例如碘、鋇、鎵和鉈化合物等)、造影劑、熒光化合物或分子和磁共振成像(MRI)用增強(qiáng)劑(例如順磁離子)。美國(guó)專(zhuān)利第6,331,175號(hào)描述了MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體的制備方法，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。優(yōu)選所述診斷劑/檢測(cè)劑選自供核成像、內(nèi)窺鏡檢查和血管內(nèi)檢查用的放射性同位素、供磁共振成像或超聲成像用的增強(qiáng)劑、供X射線和計(jì)算機(jī)斷層成像的不透射線物質(zhì)和造影劑以及供螢光鏡檢查(包括內(nèi)窺鏡檢查的螢光鏡檢查)用的熒光化合物。與抗體綴合的或用于雙特異性預(yù)先靶向方法的熒光劑和放射性物質(zhì)對(duì)于內(nèi)窺鏡檢查、手術(shù)中檢查或血管內(nèi)檢查與患病組織或細(xì)胞簇例如惡性腫瘤相關(guān)的靶向抗原特別有用，特別是γ發(fā)射體、β發(fā)射體和正電子發(fā)射體，參見(jiàn)以下公開(kāi)的文獻(xiàn)Goldenberg的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)第5,716,595、第6,096,289號(hào)和美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)09/348,818，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。內(nèi)窺鏡檢查應(yīng)用當(dāng)存在允許內(nèi)窺鏡檢查的結(jié)構(gòu)例如結(jié)腸時(shí)可以使用?？捎糜谡娮影l(fā)射型斷層成像的放射性核素包括但不限于F-18、Mn-51、Mn-52m、Fe-52、Co-55、Cu-62、Cu-64、Ga-68、As-72、Br-75、Br-76、Rb-82m、Sr-83、Y-86、Zr-89、Tc-94m、In-110、I-120和I-124。有用的正電子發(fā)射放射性核素的總衰變能量?jī)?yōu)選＜2,000keV，更優(yōu)選＜1,000keV，最優(yōu)選＜700keV?？捎米髟\斷劑/檢測(cè)劑并利用γ射線檢測(cè)的放射性核素包括但不限于Cr-51、Co-S7、Co-S8、Fe-59、Cu-67、Ga-67、Se-75、Ru-97、Tc-99m、In-111、In-114m、I-123、I-125、I-131、Yb-169、Hg-197和Tl-201。有用的γ射線發(fā)射放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選為20-2000keV，更優(yōu)選為60-600keV，最優(yōu)選為100-300KeV。
體外診斷本發(fā)明考慮包括PAM4融合蛋白及其片段在內(nèi)的PAM4抗體在體外篩選生物樣品中存在的PAM4抗原中的用途。如下所述，在這樣的免疫測(cè)定中，所述PAM4抗體、融合蛋白或其片段可用于液相或結(jié)合到固相載體上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PAM4抗體或其片段是人源化的。還優(yōu)選所述PAM4抗體或其片段是全人的。更優(yōu)選所述PAM4融合蛋白包含人源化PAM4抗體或全人PAM4抗體。
用于測(cè)定生物樣品是否含有PAM4抗原的篩選方法的一個(gè)實(shí)例是放射免疫測(cè)定(RIA)。例如，在一種形式的RIA中，將待測(cè)物質(zhì)在放射性標(biāo)記PAM4抗原存在下與PAM4抗原MAb混合。在該方法中，試驗(yàn)物質(zhì)的濃度與結(jié)合所述MAb的標(biāo)記PAM4抗原的量成反比，而與游離的標(biāo)記PAM4抗原成正比。其它的合適的篩選方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
或者，進(jìn)行體外測(cè)定，在該測(cè)定中，使PAM4抗體、融合蛋白或其片段與固相載體結(jié)合。例如，MAb可以與聚合物例如氨基葡聚糖連接，以便使所述MAb與不溶性支持物例如包埋聚合物的珠、板或管連接。
其它的合適的體外測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的?？蓹z測(cè)標(biāo)記PAM4抗體和PAM4抗原的具體濃度、溫育的溫度和時(shí)間以及其它測(cè)定條件可以根據(jù)包括樣品中的PAM4抗原濃度、樣品性質(zhì)等在內(nèi)的諸多因素而變化。PAM4抗體樣品的結(jié)合活性可以按照眾所周知的方法來(lái)測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定每一測(cè)定的操作和最佳測(cè)定條件。
其它諸如洗滌、攪拌、搖動(dòng)、過(guò)濾等的步驟可以添加到測(cè)定中，這是具體情況下常規(guī)或必需的。
采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，可以測(cè)定生物樣品中存在的PAM4抗原。在直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中，使純或半純的抗原制劑與對(duì)于在待測(cè)流體或細(xì)胞提取物中不溶的固相支持物結(jié)合，然后加入一定量的可檢測(cè)標(biāo)記的可溶性抗體，使得可以對(duì)固相抗原和標(biāo)記抗體二者間形成的二元復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。
相比之下，“雙決定簇(double-determinant)”ELISA，也稱(chēng)之為“雙位點(diǎn)(two-site)”ELISA或“夾層測(cè)定(sandwich assay)”，需要少量的抗原，并且該項(xiàng)測(cè)定并不需要非常純的抗原。因此，對(duì)于檢測(cè)臨床樣品中的抗原，雙決定簇ELISA優(yōu)于直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。參見(jiàn)例如雙決定簇ELISA在定量測(cè)定活檢標(biāo)本中的c-myc致癌蛋白中的應(yīng)用。Field等，Oncogene 41463(1989)；Spandidos等，AntiCancer Res.9821(1989)。
在雙決定簇ELISA中，使一定量的未標(biāo)記MAb或抗體片段(“捕獲抗體”)與固相支持物結(jié)合，導(dǎo)致試驗(yàn)樣品與捕獲抗體接觸，加入一定量的可檢測(cè)標(biāo)記的可溶性抗體(或抗體片段)，使得可以對(duì)捕獲抗體、抗原和標(biāo)記抗體三者間形成的三元復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量?？贵w片段是抗體的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等等。在本發(fā)明中，抗體片段是結(jié)合PAM4抗原的表位的PAM4單克隆抗體的一部分。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”也包括任何通過(guò)結(jié)合特定抗原形成復(fù)合物同抗體一樣起作用的合成蛋白或基因工程蛋白。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)組成的分離的片段、由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段和其中輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過(guò)肽接頭連接的重組單鏈多肽分子?？贵w融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的相同或不同的單鏈抗體或抗體片段的區(qū)段中的兩個(gè)或更多個(gè)連接在一起。所述融合蛋白可以包含一種抗體組分、不同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合、或同一抗體組分的多拷貝。所述融合蛋白可以另外包含與診斷劑/檢測(cè)劑和/或治療劑綴合的抗體或抗體片段。術(shù)語(yǔ)PAM4抗體包括人源化抗體、人抗體和鼠抗體、其抗體片段、免疫綴合物及其片段和抗體融合蛋白及其片段。
進(jìn)行雙決定簇ELISA的方法是眾所周知的。參見(jiàn)例如Field等，參見(jiàn)上文；Spandidos等，參見(jiàn)上文；和Moore等，″Twin-Site ELISAs forfos and myc oncoprotiens Using the AMPAK System，″載于METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第273-281頁(yè)(The HumanaPress，Inc.1992)。
在雙決定簇ELISA中，可溶性抗體或抗體片段必須結(jié)合不同于捕獲抗體所識(shí)別的表位的PAM4表位?？梢赃M(jìn)行雙決定簇ELISA，以確定活檢樣品中是否存在PAM4抗原?；蛘?，可以進(jìn)行所述測(cè)定，以定量測(cè)定臨床體液樣品中是否存在可檢測(cè)量的PAM4抗原?？梢赃M(jìn)行定量測(cè)定，并且包括對(duì)純化的PAM4抗原進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明的PAM4 MAb、融合蛋白及其片段也適合制備成測(cè)定試劑盒。這樣的試劑盒可以包括載體工具，即間隔化以在密閉區(qū)室中容納一個(gè)或多個(gè)容器裝置，例如小瓶、管等，每個(gè)所述容器裝置包括免疫測(cè)定的獨(dú)立元件。
例如，可以有一個(gè)裝有固定在固相支持物上的捕獲抗體的容器裝置，以及另一個(gè)裝有可檢測(cè)標(biāo)記抗體的溶液的容器裝置。其它的容器裝置可以裝有包含連續(xù)稀釋的PAM4抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液?？梢杂肞AM4抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生用橫坐標(biāo)為PAM4抗原濃度對(duì)縱坐標(biāo)為檢測(cè)信號(hào)所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此圖可以?xún)?nèi)推出從含有PAM4抗原的樣品所獲得的結(jié)果，從而得出生物樣品中的PAM4抗原濃度。
本發(fā)明的PAM4抗體、融合蛋白及其片段也可以用來(lái)檢測(cè)從組織學(xué)標(biāo)本制備的組織切片中存在的PAM4抗原。這樣的原位檢測(cè)可以用來(lái)確定所測(cè)組織中存在的PAM4抗原以及確定PAM4抗原的分布。通過(guò)將可檢測(cè)標(biāo)記的PAM4抗體用于冷凍組織切片中，可以完成原位檢測(cè)。研究表明，PAM4抗原保存在石蠟包埋的切片中。原位檢測(cè)的通用技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn)例如Ponder，″Cell Marking Techniques and Their Application，″載于MAMMALIANDEVELOPMENTA PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk(編著)(IRL Press 1987)和Coligan，第5.8.1-5.8.8頁(yè)。
PAM4抗體、融合蛋白及其片段可以用任何合適的標(biāo)記部分進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記，所述標(biāo)記部分例如放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、染料、色原、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記或順磁標(biāo)記。所述可檢測(cè)標(biāo)記的PAM4抗體的制備方法和檢測(cè)方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，并且在下文有更詳細(xì)的描述。
所述標(biāo)記部分可以是通過(guò)應(yīng)用諸如γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影等方法檢測(cè)的放射性同位素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述診斷用綴合物是γ發(fā)射同位素、β發(fā)射同位素或正電子發(fā)射同位素。本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)記部分是指在預(yù)定條件下將會(huì)產(chǎn)生信號(hào)的分子。標(biāo)記部分的實(shí)例包括放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和順磁標(biāo)記。本文所用的診斷劑或治療劑是與抗體部分綴合產(chǎn)生可用于診斷和治療的綴合物的分子或原子。診斷劑或治療劑的實(shí)例包括藥物、毒素、寡核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、激素、激素類(lèi)拮抗劑、酶、酶抑制劑、同位素，其它的抗體、螯合劑、染料、色原、硼化合物和標(biāo)記部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，U.S.5,734,033(Reed)描述了抑制bcl-2表達(dá)的反義分子等寡核苷酸，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中，所述寡核苷酸可以與本發(fā)明的免疫綴合物或抗體融合蛋白的治療劑部分綴合，或者形成本發(fā)明的免疫綴合物或抗體融合蛋白的治療劑部分。或者，所述寡核苷酸可以與本發(fā)明的裸PAM4抗體或綴合PAM4抗體或抗體片段同時(shí)或序貫給藥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸最好針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的癌基因或癌基因產(chǎn)物，例如bcl-2。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道其它可以按照本發(fā)明使用的合適標(biāo)記。采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以完成標(biāo)記部分與PAM4抗體的結(jié)合。該方面的常用方法描述于Kennedy等，Clin.Chim.Acta 701(1976)；Schurs等，Clin.Chim.Acta 811(1977)；Shih等，Int′l J.Cancer461101(1990)。
上述體外和原位檢測(cè)方法在病理病癥的診斷或分期中可以作為輔助方法。例如，這樣的方法可以用于檢測(cè)表達(dá)PAM4抗原的腫瘤例如胰腺癌。
體內(nèi)診斷本發(fā)明考慮了PAM4抗體在體內(nèi)診斷中的應(yīng)用。用放射性標(biāo)記MAb診斷的造影方法是眾所周知的。例如，在免疫閃爍照相技術(shù)中，抗體被γ發(fā)射放射性同位素標(biāo)記，然后將其引入患者體內(nèi)。用γ照相機(jī)來(lái)檢測(cè)γ發(fā)射放射性同位素的位置和分布。參見(jiàn)例如Srivastava(編著)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGINGAND THERAPY(Plenum Press 1988)，Chase，″Medical Applications ofRadioisotopes，″載于REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，Gennaro等(編著)，第624-652頁(yè)(Mack PublishingCo.，1990)和Brown，″Clinical Use of Monoclonal Antibodies，″載于BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto等(編著)(Chapman & Hall 1993)。
對(duì)于診斷性造影，放射性同位素可以直接與PAM4抗體結(jié)合或者通過(guò)中間官能團(tuán)與PAM4抗體間接結(jié)合。有用的中間官能團(tuán)包括螯合劑，例如乙二胺四乙酸和二亞乙基三胺五乙酸。例如參見(jiàn)Shih等，參見(jiàn)上文；美國(guó)專(zhuān)利第5,057,313號(hào)。
通過(guò)選擇機(jī)體內(nèi)的最小半衰期、最小殘留的最佳組合的同位素以及允許檢測(cè)并準(zhǔn)確測(cè)定的最低劑量的同位素，使傳遞到患者的輻射劑量保持在盡可能低的水平。可以結(jié)合PAM4抗體并且適用診斷性造影的放射性同位素的實(shí)例包括99mTc和111In。
對(duì)于體內(nèi)診斷目的，所述PAM4抗體、融合蛋白及其片段也可以用順磁離子以及各種各樣的放射性造影劑標(biāo)記。磁共振成像的特別有用造影劑包括釓、錳、鏑、鑭或鐵離子。另外的造影劑包括鉻、銅、鈷、鎳、錸、銪、鋱、鈥或釹。PAM4抗體及其片段也可以與超聲造影劑/增強(qiáng)劑綴合。例如，超聲造影劑是包含人源化PAM4 IgG或其片段的脂質(zhì)體。還優(yōu)選所述超聲造影劑是充氣的脂質(zhì)體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以與造影劑綴合。例如，所述雙特異性抗體可以包含不止一種供超聲成像用的影像增強(qiáng)劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述造影劑是脂質(zhì)體。優(yōu)選所述脂質(zhì)體包含與脂質(zhì)體外表面共價(jià)連接的二價(jià)DTPA-肽。更優(yōu)選所述脂質(zhì)體是充氣的。
藥學(xué)上適合的賦形劑在治療應(yīng)用中，可以用另外的制藥方法來(lái)控制PAM4抗體的起效持續(xù)時(shí)間。通過(guò)應(yīng)用復(fù)合或吸附PAM4抗體、融合蛋白及其片段的聚合物，可以制備控釋制劑。例如，生物相容性聚合物包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物骨架和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酸酐共聚物骨架。Sherwood等，Bio/Technology 101446(1992)。從所述骨架中釋放PAM4抗體、融合蛋白及其片段的速率取決于PAM4抗體、融合蛋白及其片段的分子量、骨架中的PAM4抗體含量和分散顆粒的大小。Saltzman等，Biophys.J 55163(1989)；Sherwood等，參見(jiàn)上文。其它固體劑型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEM，第5版(Lea & Febiger 1990)和Gennaro(編著)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修訂版本。
準(zhǔn)備給予患者的所述人源化PAM4抗體和人PAM4抗體及其片段可以由單獨(dú)的抗體、免疫綴合物、融合蛋白或其片段組成，或者可以包含一種或多種藥學(xué)上適合的賦形劑、一種或多種額外成分或它們的某種組合。
本發(fā)明的免疫綴合物、裸抗體及其片段可以按照制備有效藥用組合物的已知方法進(jìn)行配制，其中將所述免疫綴合物或裸抗體在含有藥學(xué)上適合的賦形劑的混合物中進(jìn)行混合。無(wú)菌的磷酸緩沖鹽水是藥學(xué)上適合的賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其它的合適的賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn)例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEM，第5版(Lea & Febiger1990)和Gennaro(編著)，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修訂版本。
可以將本發(fā)明的免疫綴合物或裸抗體配制成供通過(guò)例如快速濃注或連續(xù)輸注的靜脈內(nèi)給藥用。注射用制劑可以為單位劑型，例如安瓿和多劑量容器并且添加防腐劑。所述組合物可以采取油性或水性溶媒的混懸劑、溶液制劑或乳劑的形式，并且可以含有配方劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，所述活性成分可以為臨用前用合適溶媒例如無(wú)菌無(wú)熱原水重建的粉針劑。
所述免疫綴合物、裸抗體及其片段也可以通過(guò)皮下途徑或者甚至通過(guò)胃腸外途徑給予哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以每劑20-2000毫克蛋白的劑量給予所述PAM4抗體或其片段。此外，所述給藥可以通過(guò)連續(xù)輸注或通過(guò)單次或多次快速濃注。一般而言，所給予的免疫綴合物、融合蛋白或裸抗體的人用劑量將會(huì)根據(jù)諸如患者的年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)病癥或先前的用藥史等因素而變化。通常，最好為接受者提供在約1mg/kg-20mg/kg范圍內(nèi)的、作為一次靜脈內(nèi)輸注的免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸抗體的劑量，雖然也可以按需給予更低或更高的劑量。該劑量可以按需重復(fù)給予，例如，每周一次，給予4-10周，優(yōu)選每周一次，給予8周，更優(yōu)選每周一次，給予4周。也可以以更少的頻率，例如每隔一周一次，給予數(shù)月。所述劑量可以通過(guò)各種胃腸外途徑給予，并且可以適當(dāng)調(diào)節(jié)劑量和方案。
本發(fā)明的PAM4抗體、融合蛋白及其片段可以按照制備有效藥用組合物的已知方法進(jìn)行配制，其中將所述PAM4抗體、融合蛋白及其片段在含有藥學(xué)上適合的載體的混合物中進(jìn)行混合。組合物如果給藥可以被接受者患者耐受，則認(rèn)為它是“藥學(xué)上可接受的載體”。無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液是藥學(xué)上可接受的載體的一個(gè)實(shí)例。其它合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn)例如REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(1990)。
對(duì)于治療目的，將所述免疫綴合物或裸抗體以治療有效量給予哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的合適患者通常是人，雖然也考慮非人類(lèi)動(dòng)物患者。抗體制劑如果給予的量在生理學(xué)上是顯著性的，則認(rèn)為所述抗體制劑是以“治療有效量”給予的。如果某一物質(zhì)的存在導(dǎo)致接受的哺乳動(dòng)物的生理機(jī)能發(fā)生可檢測(cè)變化，則該物質(zhì)在生理學(xué)上有顯著性。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，決不是用來(lái)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下面的實(shí)施例討論了用PAM4 MAb和CaPan1人胰腺癌進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究。CaPan1人胰腺癌在皮下部位和同位中作為異種移植物。所述MAb和藥物可以導(dǎo)致存活時(shí)間顯著改進(jìn)。表明高濃度的PAM4單克隆抗體靶向人腫瘤異種移植模型，靶向患者體內(nèi)原始部位的大多數(shù)胰腺腫瘤。用體外免疫測(cè)定定量測(cè)定患者血液中的PAM4反應(yīng)性抗原，似乎在其鑒別胰腺癌和胰腺炎以及其它的疾病和正常組織的能力方面是有希望的。
用PAM4 MAb進(jìn)行的臨床研究已表明，靶向患者體內(nèi)的大多數(shù)損害，沒(méi)有證據(jù)表明正常組織的攝取。劑量測(cè)定法表明，可以將10-20cGy/mCi傳遞到腫瘤，其中腫瘤與紅骨髓劑量之比為3∶1至10∶1。這些數(shù)據(jù)提示，PAM4可用于開(kāi)發(fā)用于治療胰腺癌的I期試驗(yàn)。
實(shí)施例1-免疫組織化學(xué)染色研究對(duì)正常成體組織的免疫組織化學(xué)顯示，PAM4反應(yīng)性表位局限于胃腸道，在此染色弱，但仍定義為陽(yáng)性(表1)。包括胰腺管、胰腺小管、胰腺腺泡和胰島細(xì)胞在內(nèi)的正常胰腺組織染色呈陰性。用組織勻漿物作為抗體，基于PAM4的酶免疫測(cè)定總的來(lái)講支持該免疫組織學(xué)數(shù)據(jù)(表2)。PAM4表位在正常胰腺及其它非胃腸組織中不存在。在非瘤性組織中，PAM4與25個(gè)胰腺癌中的21個(gè)(85％)有反應(yīng)性(表3)。似乎PAM4反應(yīng)性與腫瘤分化階段相關(guān)。例如，21個(gè)孔中有20個(gè)孔和中等分化的胰腺腫瘤呈陽(yáng)性，而4個(gè)分化差的腫瘤中僅有1個(gè)呈陽(yáng)性。一般而言，分化差的腫瘤占所有胰腺癌的10％以下。
這些研究表明，PAM4反應(yīng)性和組織分布(正常和癌癥)與所報(bào)道的CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3和路易斯抗原的不同。結(jié)合用這些MAb中的某些進(jìn)行的交叉阻斷研究，所得數(shù)據(jù)提示，PAM4 MAb識(shí)別一個(gè)獨(dú)特的新表位。當(dāng)與CA19.9、DUPAN2和aLea進(jìn)行比較時(shí)，似乎PAM4在其組織分布上更加受到限制，并且它與較高百分比的胰腺腫瘤有反應(yīng)性。此外，等量濃度下，得到總體反應(yīng)強(qiáng)度更高，并且與較高百分比的腫瘤內(nèi)的細(xì)胞有反應(yīng)性。最后，發(fā)現(xiàn)PAM4僅與12個(gè)慢性胰腺炎標(biāo)本中的3個(gè)有弱反應(yīng)性，而CA19.9和DUPAN2與所有12個(gè)標(biāo)本有強(qiáng)反應(yīng)性。雖然認(rèn)識(shí)到特異性依賴(lài)于所用的測(cè)定類(lèi)型和所檢查組織的范圍和數(shù)目，但是PAM4有鑒別正常胰腺組織和瘤性胰腺組織的能力、其能與大百分比的癌癥標(biāo)本有反應(yīng)性以及高反應(yīng)強(qiáng)度，對(duì)于繼續(xù)從事臨床應(yīng)用的開(kāi)發(fā)研究是重要的理論基礎(chǔ)。
表1-MAb PAM4對(duì)正常成體組織的免疫過(guò)氧化物酶染色
a-()所檢查的個(gè)體標(biāo)本數(shù)。
表2-經(jīng)EIA測(cè)定單克隆抗體PAM4與正常成體組織勻漿的反應(yīng)性
a-數(shù)值是來(lái)自?xún)蓚€(gè)尸檢標(biāo)本的平均值表3-一些單克隆抗體與胰腺腫瘤的免疫組織化學(xué)反應(yīng)性
-陰性；+5-20％的組織被染色；++21-50％的組織被染色；+++＞50％的組織被染色；W、M、P良好分化、中等分化或差分化；*轉(zhuǎn)移組織；ND未進(jìn)行表4-瘤性組織與MAb PAM4的免疫過(guò)氧化物酶染色
實(shí)施例2-放射性標(biāo)記PAM4的體內(nèi)生物分布和腫瘤靶向用一系列4個(gè)不同的異種移植的人胰腺腫瘤，涵蓋預(yù)期分化的范圍，進(jìn)行PAM4初始生物分布研究。所用的四個(gè)腫瘤系即AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1中的每個(gè)都在腫瘤內(nèi)顯示有131I-PAM4(第3天，濃度范圍21％-48％ ID/g)，與同時(shí)給予的非特異性同種型匹配的Ag8抗體(第3天，濃度范圍3.6％-9.3％ ID/g)相比，顯著升高(p＜0.01-0.001)。用所得生物分布數(shù)據(jù)估計(jì)對(duì)腫瘤的潛在輻射劑量，對(duì)于AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1，輻射劑量分別為12,230cGy/mCi、10,684cGy/mCi、6,835cGy/mCi和15,843cGy/mCi。鑒于實(shí)際最大耐受劑量(MTD)為0.7mCi，PAM4可以為每個(gè)異種移植腫瘤模型提供相當(dāng)大的拉德劑量。在每種腫瘤系中，放射性標(biāo)記的PAM4的血液水平都有顯著性(p＜0.01-0.001)，低于非特異性Ag8。來(lái)自PAM4的血液的潛在輻射劑量比來(lái)自Ag8的血液的潛在輻射劑量低1.4-4.4倍。當(dāng)將來(lái)自PAM4的腫瘤的輻射劑量歸一化至來(lái)自PAM4的血液劑量時(shí)，腫瘤接受的劑量分別為2.2、3.3、3.4；其比血液高13.1倍。重要的是，對(duì)于非腫瘤組織的潛在輻射劑量最小。
采用CaPan1腫瘤模型，將PAM4的生物分布與抗CEA抗體MN14進(jìn)行比較。腫瘤內(nèi)的PAM4濃度比MN14濃度高得多(早期時(shí)間點(diǎn))，在第3天，腫瘤濃度與血液濃度之比對(duì)于PAM4為12.7±2.3，相比之下，對(duì)于MN14為2.7±1.9。雖然在早期時(shí)間點(diǎn)，腫瘤內(nèi)PAM4攝取顯著比MN14高(第1天-P＜0.001；第3天-P＜0.01)，劑量測(cè)定分析表明，在14天的研究期間，來(lái)自PAM4的腫瘤的劑量?jī)H比MN14高3.2倍。這是由于PAM4從腫瘤中快速清除，致使稍后的時(shí)間點(diǎn)，在腫瘤內(nèi)出現(xiàn)這兩種抗體的相似濃度。在BxPc3和Hs766T中，也觀察到PAM4從腫瘤中快速清除，但在AsPc1腫瘤模型中沒(méi)有觀察到這一現(xiàn)象。這些觀察結(jié)果與報(bào)道的其它抗粘蛋白抗體不一致，例如與結(jié)腸直腸癌中的G9和B72.3不一致，其中每種抗體都表現(xiàn)出比MN14抗體長(zhǎng)的保留時(shí)間。對(duì)PAM4代謝研究的結(jié)查表明，在與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生結(jié)合后，快速釋放出抗體，抗原抗體復(fù)合物可能被分解或者脫落。這一點(diǎn)對(duì)于所述抗體在患者中的應(yīng)用是非常不利的，只是例外的是血液清除也非常快速。這些數(shù)據(jù)提示，對(duì)于治療應(yīng)用，131I可能是不適合選擇的同位素?？梢越o予的短壽同位素例如90Y或188Re通常證明是更有效的試劑。
PAM4顯示沒(méi)有靶向正常組織的證據(jù)，只是在CaPan1腫瘤模型中，其中觀察到少量但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的脾臟攝取(在第3天，范圍3.1-7.5％ ID/g)。在抗粘蛋白抗體B72.3和CC49的臨床應(yīng)用中，觀察到該類(lèi)型的脾臟靶向。重要的是，這些研究也報(bào)道，脾臟靶向并不影響抗體的腫瘤攝取，也不干擾對(duì)核掃描的解釋。這些研究提示，脾臟靶向既不是由于脾臟中的交叉反應(yīng)性抗原所致，也不是通過(guò)Fc受體結(jié)合所致，而是下面的一種或多種可能性所致直接靶向在脾臟中捕獲的抗原或者間接攝取在血液中形成的或從腫瘤部位釋放的抗原抗體復(fù)合物。后者將會(huì)需要在血液中存在免疫復(fù)合物；然而，當(dāng)通過(guò)凝膠過(guò)濾(HPLC，GF-250柱)放射性標(biāo)記抗體作為天然物質(zhì)被洗出，檢查早至5分鐘且遲至7天的標(biāo)本時(shí)并未觀察到這一現(xiàn)象。前者的解釋似乎更有可能是鑒于CaPan1腫瘤產(chǎn)生大量的PAM4反應(yīng)性抗原比所檢查的其它腫瘤細(xì)胞系高100-1000倍的事實(shí)。在這些其它腫瘤系中PAM4缺乏脾臟靶向提示，該現(xiàn)象與過(guò)量的抗原產(chǎn)生相關(guān)。在任何情況下，可以通過(guò)將蛋白質(zhì)劑量從原始的2μg劑量增至10μg劑量來(lái)克服脾臟靶向。更大量的脾臟捕獲的抗原推測(cè)與未標(biāo)記的PAM4復(fù)合而不與放射性標(biāo)記抗體復(fù)合。在PAM4靶向腫瘤或非腫瘤組織時(shí)，增加蛋白質(zhì)劑量確實(shí)沒(méi)有負(fù)面效應(yīng)。事實(shí)上，蛋白質(zhì)劑量增加至100μg是CaPan1腫瘤內(nèi)放射性標(biāo)記PAM4濃度的兩倍。
實(shí)施例3-無(wú)胸腺裸鼠中同位胰腺腫瘤模型的開(kāi)發(fā)為了更接近模擬胰腺癌在動(dòng)物模型中的臨床表現(xiàn)，本發(fā)明申請(qǐng)人通過(guò)將腫瘤細(xì)胞直接注射到胰腺頭而開(kāi)發(fā)出一種同位模型。同位CaPan1腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)而沒(méi)有明顯癥狀，直到產(chǎn)生腹水，在10-14周死亡。截止到植入后3-4周，動(dòng)物發(fā)生可觸知的腫瘤，腫瘤重約為0.2g。在生長(zhǎng)的8周內(nèi)，觀察到約1.2g的原發(fā)性腫瘤隨轉(zhuǎn)移瘤一起轉(zhuǎn)移到肝臟和脾臟(1-3個(gè)轉(zhuǎn)移瘤/動(dòng)物；每個(gè)腫瘤＜0.1g)。在10-14周，產(chǎn)生腹水的隔膜接種是顯而易見(jiàn)的。腹水形成和偶發(fā)性黃疸通常是腫瘤生長(zhǎng)第一個(gè)最明顯的指征。腹水是腹腔內(nèi)體液的累積，而黃疸是由于血液中膽色素過(guò)多而使皮膚和眼發(fā)黃。此時(shí)，腫瘤會(huì)相當(dāng)大，有1-2g重，大多數(shù)情況下動(dòng)物會(huì)在3-4周后死亡。
將放射性標(biāo)記131I-PAM4給予帶有4周齡同位腫瘤(約0.2g)的動(dòng)物，顯示特異性靶向原發(fā)性腫瘤，局部化指數(shù)第1天為7.9±3.0，在第14天增加至22.8±15.3。沒(méi)有觀察到特異性靶向其它組織的證據(jù)。在一種觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移到肝臟和脾臟的情況下，這兩種轉(zhuǎn)移瘤均被靶向并且具有高濃度的放射性標(biāo)記抗體。另外，大約一半的動(dòng)物在切口部位發(fā)生皮下腫瘤。在同一動(dòng)物中，在靶向同位腫瘤和皮下腫瘤時(shí)，沒(méi)有觀察到顯著性差異，并且在靶向同位腫瘤時(shí)，無(wú)論動(dòng)物是否帶有另外的皮下腫瘤都沒(méi)有觀察到顯著性差異。PAM4的估計(jì)輻射劑量對(duì)于原發(fā)性腫瘤和血液分別為6,704cGy/mCi和1,655cGy/mCi。
實(shí)施例4-用于定量循環(huán)腫瘤抗原的酶免疫測(cè)定的開(kāi)發(fā)我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種用PAM4作為捕獲試劑的酶免疫測(cè)定，并且使用來(lái)自兔多克隆抗胰腺粘蛋白的未標(biāo)記純化IgG，接著通過(guò)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG作為檢測(cè)試劑。通過(guò)使用該項(xiàng)測(cè)定獲得了下面的結(jié)果。
在所述測(cè)定檢測(cè)的抗原范圍內(nèi)，獲得的變異系數(shù)值小于10％。檢查了25位健康個(gè)體的血清，顯示平均值±S.D.為4.0±3.1單位。然后將陽(yáng)性反應(yīng)的截止值設(shè)定為平均值+2S.D.＝10.2單位。在總共37位胰腺癌患者中，32位或86％在該項(xiàng)測(cè)定中呈陽(yáng)性，而13位胰腺炎患者中僅有3位呈陽(yáng)性。PAM4抗原在55％(18/33)的結(jié)腸直腸癌癥患者中升高，通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定，大致接近40％的結(jié)腸直腸癌癥標(biāo)本與PAM4有反應(yīng)性。在其它癌癥中，PAM4抗原在16位卵巢癌患者中有4位呈陽(yáng)，在20位乳腺癌患者中有5位呈陽(yáng)性，在所有患有廣泛性疾病(extensive disease)患者中全都呈陽(yáng)性。另外，正如可以從下表5中所見(jiàn)到的，胰腺癌的中位值(84.5單位)是所有其它癌癥組的10倍以上(膽囊癌除外)，盡管這些病例中的絕大多數(shù)是晚期、帶有大腫瘤。
表5-PAM4與血清的反應(yīng)性
a截止值10.2單位/ml(平均值+2 S.D.)除了這些發(fā)現(xiàn)之外，在同位模型中進(jìn)行了初步研究，以檢查該P(yáng)AM4測(cè)定在使用中的潛在用途。在同位CaPan1腫瘤植入后2周(估計(jì)腫瘤重量為0.15g)，在動(dòng)物血液中沒(méi)有可檢測(cè)抗原。在4周(估計(jì)腫瘤重量為0.2g)，5只動(dòng)物中有1只動(dòng)物具有可檢測(cè)水平的抗原(72單位)，而在6周(估計(jì)腫瘤重量為0.4g)，5只動(dòng)物中有4只動(dòng)物具有可定量的抗原(范圍98-6080單位)。鑒于測(cè)定可檢測(cè)血清源性抗原的最早時(shí)間點(diǎn)的嚴(yán)重限制因素為可獲得的有限量的血，致使可以進(jìn)行重復(fù)放血。因此，測(cè)定前血清以1∶10進(jìn)行稀釋。
實(shí)施例5-胰腺癌的實(shí)驗(yàn)性放射免疫療法用CaPan1腫瘤對(duì)將131I-PAM4用于治療進(jìn)行初始研究，讓CaPan1腫瘤在無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)作為皮下異種移植物生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)中，帶有0.25g腫瘤的動(dòng)物給予350μCi131I-PAM4，也將其與相似劑量的非特異性Ag8的治療效應(yīng)進(jìn)行比較。將131I-PAM4給予帶有1cm3腫瘤的動(dòng)物的MTD為700μCi。截止到5周和6周，經(jīng)PAM4治療的動(dòng)物顯示腫瘤顯著消退，甚至在27周，8只動(dòng)物中有5只仍保持無(wú)瘤。未治療動(dòng)物以及經(jīng)Ag8治療的動(dòng)物顯示腫瘤生長(zhǎng)的快速進(jìn)行，雖然在這兩個(gè)對(duì)照組之間也觀察到顯著性差異。在7周，未治療組的腫瘤比開(kāi)始時(shí)間點(diǎn)的腫瘤生長(zhǎng)20.0±14.6倍，而經(jīng)131I-Ag8治療的腫瘤僅生長(zhǎng)4.9±1.8倍。在該時(shí)間點(diǎn)，PAM4腫瘤一直消退至其原始大小的0.1±0.1倍，未治療動(dòng)物(p＜0.001)和經(jīng)非特異性Ag8治療的動(dòng)物(p＜0.01)均有顯著性差異。
雖然CaPan1腫瘤對(duì)用131I-PAM4治療敏感，結(jié)果也就是說(shuō)，腫瘤的消退或發(fā)展依賴(lài)于包括原始腫瘤大小在內(nèi)的諸多因素。因此，帶有CaPan1腫瘤負(fù)擔(dān)為0.25g、0.5g、1.0g或2.0g的動(dòng)物組用一劑350μCi131I-PAM4進(jìn)行治療。大多數(shù)帶有原始大小為0.25g和0.5g腫瘤的動(dòng)物(每組10只動(dòng)物中有9只動(dòng)物)顯示治療后腫瘤消退或生長(zhǎng)抑制長(zhǎng)達(dá)至少16周。在1.0g腫瘤組，7只動(dòng)物中有5只顯示沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)達(dá)16周，而在2.0g腫瘤組，9只動(dòng)物中有6只顯示沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)達(dá)6周，隨后腫瘤開(kāi)始生長(zhǎng)。雖然一劑350μCi對(duì)于較大腫瘤是無(wú)效的，一劑可能并不是非常好的合適方案；但是毒性研究表明，放射免疫療法能循環(huán)給予多次。帶有平均1.0g的CaPan1腫瘤的動(dòng)物或者給予一劑350μCi131I-PAM4，或者在時(shí)間為0和4周時(shí)給予兩劑，或者不治療。未治療組的平均存活時(shí)間為3.7+/-1.0周(存活時(shí)間定義為腫瘤達(dá)到5cm3的時(shí)間)。早在3周就有動(dòng)物死亡，沒(méi)有動(dòng)物活過(guò)6周。一劑350μCi131I-PAM4在存活時(shí)間方面產(chǎn)生顯著性增加，存活時(shí)間增加至18.8+/-4.2周(p＜0.0001)。動(dòng)物死亡范圍從13周延長(zhǎng)至25周。在26周的研究期結(jié)束時(shí)，沒(méi)有動(dòng)物活著。
與一劑組相比，觀察到兩劑組的存活時(shí)間顯著性增加。在26周時(shí)間點(diǎn)，有半數(shù)動(dòng)物活著，腫瘤大小為1.0-2.8cm3，而自原始腫瘤大小的平均腫瘤生長(zhǎng)速率為1.6+/-0.7倍。對(duì)于這些在26周沒(méi)有存活者的動(dòng)物，平均存活時(shí)間(17.7+/-5.3周)與一劑組相似。
用PAM4的治療研究也用于同位腫瘤模型。帶有4周齡同位腫瘤的動(dòng)物組(估計(jì)腫瘤重量為0.25g)或者不治療或者用一劑350μCi131I-PAM4治療或者用一劑350μCi131I非特異性Ag8治療。截止到10周，未治療動(dòng)物的死亡率為50％，而在第15周，沒(méi)有動(dòng)物活著。在腫瘤生長(zhǎng)的4周內(nèi)給予非特異性131I-Ag8的動(dòng)物的死亡率在7周時(shí)為50％，而在14周，沒(méi)有動(dòng)物活著。雖然在這兩組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(logrank分析)，可能會(huì)在約一半的Ag8治療的動(dòng)物中出現(xiàn)輻射毒性。然而，與未治療動(dòng)物或經(jīng)Ag8治療的動(dòng)物相比，放射性標(biāo)記PAM4提供顯著存活優(yōu)勢(shì)(p＜0.001)，16周即實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的存活率為70％。此時(shí)，處死存活的動(dòng)物，測(cè)定腫瘤大小。所有動(dòng)物的腫瘤平均重量為1.2g，以及在7只動(dòng)物中有4只動(dòng)物明顯存在一個(gè)或兩個(gè)小(＜0.1g)轉(zhuǎn)移瘤。生長(zhǎng)16周時(shí)，這些腫瘤比8周齡腫瘤更有代表性。
實(shí)施例6-吉西他濱化療藥和131I-PAM4放射免疫療法的聯(lián)合用藥對(duì)131I-PAM4放射免疫療法與吉西他濱(gemzar)聯(lián)用進(jìn)行初始研究，作為棋盤(pán)陣列；一劑吉西他濱(0mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg)對(duì)一劑131I-PAM4([MTD＝700μCi]100％、75％、50％、0％MTD)。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合MTD是500mg/kg吉西他濱加上350μCi131I-PAM4(50％ MTD)。根據(jù)體重減輕的測(cè)量，毒性達(dá)到所認(rèn)為無(wú)毒的最大值；即體重減輕了20％。雖然，聯(lián)合治療方案比單獨(dú)的吉西他濱顯著更有效，但是該治療沒(méi)有單獨(dú)的放射免疫療法有效。對(duì)低劑量的吉西他濱和放射免疫療法進(jìn)行下一步研究，以檢查是否觀察到真正的協(xié)同療效。帶有約1cm3腫瘤(約占體重的5％)的動(dòng)物在第0天、第3天、第6天、第9天和第12天給予100mg/kg吉西他濱，在第0天給予100μCI131I-PAM4。觀察到與單獨(dú)的吉西他濱相比，腫瘤的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.0001)消退(5個(gè)腫瘤中有2個(gè)小于0.1cm3)和/或生長(zhǎng)抑制的療效。另外還注意到，根據(jù)體重，沒(méi)有觀察到毒性。必要時(shí)，聯(lián)合治療方案可以在多個(gè)循環(huán)中給予，其中第2個(gè)治療循環(huán)始于第4周，如上述單獨(dú)的放射免疫療法的研究做法一樣。
實(shí)施例7-人源化PAM4 Mab本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案使用單克隆抗體即MAb hPAM4，MAb hPAM4是一種針對(duì)胰腺癌粘蛋白產(chǎn)生的鼠PAM4的人源化IgG。鼠PAM4序列的人源化用來(lái)降低患者經(jīng)歷的人抗小鼠抗體應(yīng)答。為了產(chǎn)生人源化PAM4，將鼠互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)從小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變(V)區(qū)轉(zhuǎn)移到人V區(qū)，然后用其小鼠對(duì)應(yīng)物取代構(gòu)架區(qū)中的某些人殘基。按照本發(fā)明的人源化單克隆抗體適合用于體外和體內(nèi)診斷方法和治療方法。
將鼠PAM4單克隆抗體的可變(V)區(qū)構(gòu)架(FR)序列(圖1A和圖1B)與在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的人抗體進(jìn)行比較，表明PAM4 Vκ和VH的FR表現(xiàn)出分別與人抗體Walker Vκ和Wil2 VH有最高程度的序列同源性。因此，選擇Walker Vκ和Wil2 VH FR分別作為移植到鼠PAM4 Vκ和VH的CDR中的人構(gòu)架(圖3)。然而，用人抗體FR4序列NEWM取代Wil2 FR4序列，供PAM4重鏈的人源化用(圖3B)。鄰接推定的CDR的PAM4 FR中的幾個(gè)氨基酸殘基保留在hPAM4中，考慮到這些殘基對(duì)Ag結(jié)合的影響要比其它FR殘基大些。這些殘基是Vκ的21M、47W、59P、60A、85S、87F和100G以及VH的27Y、30P、38K、48I、66K、67A和69L。hPAM4 Vκ和VH的DNA序列和氨基酸序列分別示于圖3A和圖3B。
使用圖4中說(shuō)明的長(zhǎng)寡核苷酸合成和PCR的組合，用根據(jù)Leung等(Leung等，1994))描述的策略的改進(jìn)策略構(gòu)建設(shè)計(jì)的hPAM4的Vκ和VH基因。為了構(gòu)建hPAM4 VH區(qū)，在自動(dòng)化DNA合成儀(AppliedBiosystem)上合成hPAM4VHA(173-mer)和hPAM4VHB(173-mer)。
hPAM4VHA表示hPAM4 VH區(qū)的核苷酸17-189。
5’-AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAAGGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACACATT CCCTAGCTAT GTTTTGCACTGGGTGAAGCA GGCCCCTGGA CAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATG ATGGTACTCA GTACAATGAG AAG-3’hPAM4VHB表示與核苷酸169-341互補(bǔ)的hPAM4 VH區(qū)的負(fù)鏈。
5’-AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCG TAGCTACCACCGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCG TGTCGTCAGA TCTCAGCCTGCTCAGCTCCA TGTAGGCTGT GTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGCCTTGCCTTTG AACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC-3’hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′末端序列(21個(gè)核苷酸殘基)彼此互補(bǔ)。在指定的PCR條件下，使hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′端退火形成鄰接長(zhǎng)寡核苷酸其余部分的短雙鏈DNA。每一退火末端用作單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，產(chǎn)生由hPAM4 VH的核苷酸17-341組成的雙鏈DNA。該DNA在這兩種短寡核苷酸hPAM4VHBACK和hPAM4VHFOR存在下進(jìn)一步擴(kuò)增，形成全長(zhǎng)hPAM4 VH。下劃線部分是亞克隆的限制位點(diǎn)(如圖4B所示)。
hPAM4VHBACK 5’-CAG GTG CAGCTGCAG CAGTCT GGG GCT GAG GTG A-3’hPAM4VHFOR 5’-TGA GGA GACGGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA-3’在10μL 10x PCR緩沖液(500mM KCl、100mM Tris、HCl緩沖液pH 8.3、15mM MgCl2)、2μmol hPAM4VHBACK和hPAM4VKFOR和2.5單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)存在下，擴(kuò)增少量的hPAM4VHA和hPAM4VHB(憑經(jīng)驗(yàn)確定)。該反應(yīng)混合物進(jìn)行3個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的組成如下94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃聚合1.5分鐘。該方法后接27個(gè)由以下組成的PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃聚合1.5分鐘。hPAM4 VH的雙鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，PstI和BstEII限制位點(diǎn)進(jìn)行限制性消化，然后克隆到重鏈分期載體VHpBS2的互補(bǔ)PstI/BstEII的限制位點(diǎn)中，其中VH序列用編碼翻譯起始密碼子的DNA序列完全裝配，然后將分泌信號(hào)肽符合讀框地連接在5′端，而將內(nèi)含子序列符合讀框地連接在3′端。VHpBS2是VHpBS的一種修飾的分期載體(Leung等，Hybridoma，13469(1994))，其中在翻譯起始密碼子上游16個(gè)堿基處導(dǎo)入了一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)，以便于下一步的亞克隆步驟。將裝配的VH基因作為XhoI-BamHI限制片段亞克隆到表達(dá)載體pdHL2中，該表達(dá)載體含有處于IgH增強(qiáng)子和MT1啟動(dòng)子控制之下的人IgG重鏈和輕鏈的表達(dá)盒，以及小鼠dhfr基因作為選擇和擴(kuò)增標(biāo)記(圖4B)。由于pdHL2的重鏈區(qū)缺乏BamHI限制位點(diǎn)，因此該連接需要應(yīng)用接頭，以在可變鏈的BamHI位點(diǎn)和pdHL2載體中存在的HindIII位點(diǎn)之間提供一個(gè)橋。所得表達(dá)載體命名為hPAM4VHpdHL2。
為了構(gòu)建人源化Vκ序列的全長(zhǎng)DNA，如上所述合成hPAM4VKA(157-mer)和hPAM4VKB(156-MER)。用如上所述的兩種短寡核苷酸hPAM4VKBACK和hPAM4VKFOR擴(kuò)增hPAM4VKA和hPAM4VKB。
hPAM4VKA表示hPAM4 Vκ區(qū)的核苷酸16-172。
5’-CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTA GGAGACAGAGTCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTG TAAGTTCCAG CTACTTGTACTGGTACCAAC AGAAACCAGG GAAAGCCCCC AAACTCTGGA TTTATAGCACATCCAACCTG GCTTCTG-3’hPAM4VKB表示與核苷酸153-308互補(bǔ)的hPAM4 Vκ區(qū)的負(fù)鏈。
5’-GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTA TTCCACTGATGGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTT GCAGACTGCT GATGGTGAGAGTGAAGTCTG TCCCAGATCC ACTGCCACTG AAGCGAGCAG GGACTCCAGAAGCCAGGTTG GATGTG-3’hPAM4VKA和hPAM4VKB的3′末端序列(20個(gè)核苷酸殘基)彼此互補(bǔ)。在指定的PCR條件下，使hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′端退火形成鄰接長(zhǎng)寡核苷酸其余部分的短雙鏈DNA。每一退火末端用作單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，產(chǎn)生由hPAM4 Vκ的核苷酸16-308組成的雙鏈DNA。該DNA在這兩種短寡核苷酸hPAM4VHBACK和hPAM4VHFOR存在下進(jìn)一步擴(kuò)增，形成全長(zhǎng)hPAM4 Vκ。下劃線部分是亞克隆的限制位點(diǎn)(如下所述)。
hPAM4VKBACK 5’-GAC ATCCAG CTGACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG-3’hPAM4VKFOR 5’-TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCC GAA CGT-3’hPAM4 Vκ的凝膠純化PCR產(chǎn)物用PvuII和BglII進(jìn)行限制性消化，然后將其克隆到輕鏈分期載體VKpBR2的互補(bǔ)PvuII/BclI位點(diǎn)中。VKpBR2是VKpBR的一種修飾的分期載體(Leung等，Hybridoma，13469(1994))，其中在翻譯起始密碼子上游16個(gè)堿基處導(dǎo)入了一個(gè)XbaI限制位點(diǎn)。將裝配的Vκ基因作為XbaI-BamHI限制片段亞克隆到含有VH序列的表達(dá)載體hPAM4VHpdHL2中。所得表達(dá)載體命名為hPAM4pdHL2。
約30μg的hPAM4pdHL2通過(guò)用SalI消化而線性化，然后將其通過(guò)電穿孔(450V和25μF)轉(zhuǎn)移到Sp2/0-Ag14細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到96孔板中，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，然后根據(jù)MTX抗性進(jìn)行選擇。在2-3周開(kāi)始選出存活的菌落，通過(guò)ELISA測(cè)定篩選人抗體分泌。簡(jiǎn)而言之，向用山羊抗人IgG F(ab′)2片段特異性抗體預(yù)包被的ELISA微量培養(yǎng)板的各孔中加入活菌落的上清液(～100μl)。將板在室溫下溫育1小時(shí)。通過(guò)用洗滌緩沖液(含有0.05％吐溫-20的PBS)洗滌三次，去除未結(jié)合的蛋白。向各孔中加入辣根過(guò)氧化物酶-綴合的山羊抗人IgG Fc片段特異性抗體。然后培養(yǎng)1小時(shí)，洗滌后，向各孔中加入含有4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)和0.04％ H2O2的PBS的底物溶液(100μL/孔)。避光顯色30分鐘，通過(guò)加入50μL 4NH2SO4溶液終止反應(yīng)。通過(guò)在ELISA讀板器上，讀出490nm的吸光度，測(cè)定結(jié)合的人IgG。擴(kuò)充陽(yáng)性細(xì)胞克隆，通過(guò)在A蛋白柱上進(jìn)行親和層析，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化出hPAM4。
在用胰腺癌細(xì)胞提取物包被的微量滴定板中，通過(guò)ELISA測(cè)定，證實(shí)hPAM4的抗原結(jié)合活性。采用PAM4-抗原包被的板，開(kāi)發(fā)ELISA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，以評(píng)價(jià)hPAM4的抗原結(jié)合親和性，并且將其與由鼠V區(qū)和人C區(qū)組成的嵌合PAM4的抗原結(jié)合親和性進(jìn)行比較。向包被孔中加入與不同濃度的cPAM4或hPAM4混合的恒定量的HRP-綴合的cPAM4，在室溫下孵育1-2小時(shí)。加入含有4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽和0.04％ H2O2的底物溶液之后，通過(guò)讀出490nm的吸光度，揭示出HRP-綴合的cPAM4與CaPan1 Ag結(jié)合的量。如圖4競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定所示，hPAM4抗體和cPAM4抗體均表現(xiàn)出相似的結(jié)合活性。
合適的宿主細(xì)胞包括微生物或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主是人細(xì)胞系PER.C6，其已開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生MAb及其它的融合蛋白。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是包含編碼PAM4 MAb、綴合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主細(xì)胞。用含有處于人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子控制之下的Ad血清型5(Ad5)E1A編碼序列和E1B編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞，產(chǎn)生PER.C6細(xì)胞(WO 97/00326)。E1A和E1B分別是腺病毒早期基因激活蛋白1A和1B。所述方法和組合物尤其可用于產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的翻譯后修飾(例如糖基化)的目標(biāo)人重組蛋白。一些特征使PER.C6尤其可用作重組蛋白生產(chǎn)的宿主，例如，PER.C6是充分表征的人細(xì)胞系，其開(kāi)發(fā)遵從藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。此外，PER.C6可以在不含任何人或動(dòng)物源性蛋白的已知成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成為懸浮培養(yǎng)物，并且其生長(zhǎng)與滾瓶、搖瓶、旋轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器兼容，倍增時(shí)間約為35小時(shí)。最后，存在的E1A引起處于CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制之下的基因表達(dá)上調(diào)，而存在的E1B阻止可能通過(guò)重組轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)增加的p53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生比常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系多2-200倍的重組蛋白和/或蛋白質(zhì)性物質(zhì)。
實(shí)施例8-對(duì)患有不宜手術(shù)的胰腺癌的患者的治療56歲男性，患有胰腺的廣泛的不宜手術(shù)的腺癌，伴有嚴(yán)重體重減輕(體重30磅或以上)，嗜眠和乏力，在2小時(shí)內(nèi)，靜脈內(nèi)給予一劑30mCi 90-Y和50mg抗體蛋白的90Y-PAM4放射性標(biāo)記人源化抗體。5天后，再給予該患者吉西他濱化療的標(biāo)準(zhǔn)療程。幾個(gè)月后，如果沒(méi)有來(lái)自治療副作用的證據(jù)，則重復(fù)該治療方案。在跟蹤檢測(cè)幾周后，預(yù)測(cè)該患者將會(huì)更有力氣，體重減輕減慢。預(yù)期對(duì)胰臟的CT掃描提示疾病得以穩(wěn)定或腫瘤塊略微縮小。幾個(gè)月后重復(fù)檢查應(yīng)該顯示，通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層成像，腫瘤塊顯著縮小，因此，該患者可考慮進(jìn)行胰腺腫瘤塊的切除手術(shù)。
實(shí)施例9-用雙特異性PAM4 x 734和99mTc標(biāo)記肽半抗原或111In標(biāo)記肽半抗原的預(yù)靶向?qū)τ诓捎妙A(yù)靶向方法進(jìn)行的胰腺癌造影，我們制備由嵌合PAM4(cPAM4)Fab′和鼠734(m734)Fab′組成的雙特異性F(ab′)2抗體(bsMAb)。m734抗體識(shí)別In-DTPA復(fù)合物。該bsMAb用125I標(biāo)記，然后注射到帶有人胰腺癌異種移植物(CaPan1)的無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)(7μCi；15μg)。由嵌合rituximab(抗CD20單克隆抗體)和m734制備的非靶向F(ab′)2bsMAb用131I標(biāo)記，并共同注射，作為對(duì)照。在不同的時(shí)間點(diǎn)(注射后4小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí))，對(duì)小鼠實(shí)施尸體剖檢，取出組織，進(jìn)行計(jì)數(shù)，以測(cè)定每克注射劑量百分率(％ ID/g)。與對(duì)照bsRituximab相比，在各時(shí)間點(diǎn)，bsPAM4的腫瘤攝取顯著更大(p＜0.032或更小)。對(duì)于該類(lèi)型的預(yù)靶向系統(tǒng)，我們過(guò)去的經(jīng)驗(yàn)提示，小于1％ ID/g的血液水平對(duì)于獲得良好的腫瘤∶非腫瘤比率是必需的。在給予bsPAM4后36小時(shí)，在血液中為1.10±0.40％ ID/g，注射后48小時(shí)降至0.56±0.08％ ID/g。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤攝取分別為6.43±1.50％ ID/g和5.37±2.38％ ID/g。這些數(shù)值顯著比對(duì)照bsRituximab更高，對(duì)照bsRituximab在腫瘤內(nèi)在36小時(shí)和48小時(shí)分別為0.65±0.33％ ID/g和0.47±0.19％ ID/g(p＜0.018和p＜0.0098)。然而，血清除率卻十分相似，沒(méi)有顯著性差異。
基于這些數(shù)據(jù)，在帶有CaPan1腫瘤的小鼠中進(jìn)行預(yù)靶向?qū)嶒?yàn)，其中給予bsMAb后40小時(shí)注射放射性標(biāo)記肽-半抗原。使用IMP-192和IMP-156兩種肽，每種含有被734 MAb所識(shí)別的二價(jià)DTPA，但一種具有額外穩(wěn)定結(jié)合99mTc(IMP-192)的特異性基團(tuán)。給予帶瘤小鼠(腫瘤體積約為0.30cm3)125I-bsPAM4(6μCi；15μg)，接著40小時(shí)后給予放射性標(biāo)記肽-半抗原(34.5μCi；1.5×10-11mole；bsMAb∶肽＝10∶1)。一組小鼠接受99mTc標(biāo)記的IMP192，而第二組小鼠接受111In標(biāo)記的IMP156。非特異性靶向?qū)φ瞻▋山M接受125I-bsRituximab后給予放射性標(biāo)記肽的小鼠，以及另外兩組接受單獨(dú)的111In標(biāo)記肽或單獨(dú)的99mTc標(biāo)記肽的小鼠。
給予肽后3小時(shí)和24小時(shí)處死小鼠，測(cè)定腫瘤和各種組織的％ID/g。同我們先前的發(fā)現(xiàn)相符，腫瘤內(nèi)的bsPAM4與非靶向?qū)φ誦sRituximab相比顯著更高，分別為8.2±3.4％和0.3±0.08％ ID/g(p＜0.0001)。進(jìn)行換算，腫瘤攝取111In-IMP156顯著更高(20.2±5.5％ID/g vs.0.9±0.1％ ID/g，p＜0.0001)。在用bsPAM4預(yù)靶向的小鼠中，與在用bsRituximab預(yù)靶向的小鼠中相比，腫瘤攝取99mTc-IMP192顯著更高(16.8±4.8％ ID/g vs.1.1±0.2％ ID/g，p＜0.0005)。每種肽的腫瘤攝取，當(dāng)單獨(dú)給予時(shí)，顯著低于接受bsPAM4的小鼠的腫瘤攝取(對(duì)于99mTc-IMP192和111In-IMP156分別是0.2±0.05％ ID/g和0.1±0.03％ ID/g；p＜0.0004和p＜0.0001)。
對(duì)于3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，在注射肽后24小時(shí)時(shí)(bsMAb給予后64小時(shí))腫瘤內(nèi)的bsPAM4比bsRituximab顯著更高(分別是6.4±2.2％ ID/gvs.0.2±0.09％ ID/g；p＜0.0001)。在該時(shí)間點(diǎn)，在用bsPAM4預(yù)靶向的小鼠中，對(duì)于111In-IMP156為11.1±3.5％ ID/g，而對(duì)于99mTc-IMP192為12.9±4.2％ ID/g；相比之下，在bsRIT預(yù)靶向的腫瘤中分別為0.5±0.2％ ID/g和0.4±0.03％ ID/g(分別是p＜0.0008和p＜0.0002)。與接受bsPAM4預(yù)靶向的肽的小鼠相比，在單獨(dú)接受肽的小鼠中，在腫瘤內(nèi)的99mTc-IMP192(0.06±0.02％ ID/g，p＜0.0007)和111In-IMP156(0.09±0.02％ ID/g，p＜0.0002)顯著更低。
上表顯示這些組的不同組織的腫瘤∶非腫瘤比率(T∶NT)，每個(gè)都在給予放射性標(biāo)記制品后的早期時(shí)間點(diǎn)。重要的是注意到，給予bsPAM4 x m734 F(ab′)2后4小時(shí)，腫瘤∶血液比率小于2∶1。然而，對(duì)于所有所檢查的組織，在給藥后3小時(shí)，預(yù)靶向的111In-IMP156和99mTc-IMP192的腫瘤∶非腫瘤比率顯著更高，特別是腫瘤∶血液比率等于36∶1和9∶1(分別是p＜0.001和p＜0.011)。當(dāng)我們檢查24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤∶血液比率時(shí)，預(yù)靶向的111In-IMP156和99mTc-IMP192的值顯著更高，分別為274∶1和80∶1；相比之下，單獨(dú)的125I-bsPAM4為4∶1(p＜0.0002)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地提示，能夠利用該預(yù)靶向bsPAM4方法，將高輻射劑量的短半衰期高能放射性同位素傳遞到腫瘤內(nèi)，而對(duì)非腫瘤組織具有最小輻射劑量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)本發(fā)明的制品、組合物、方法和過(guò)程進(jìn)行各種修改和變化。因此，本發(fā)明包括這樣的修改和變化，只要所述修改和變化在所附權(quán)利要求及其等同實(shí)施方案的范圍之內(nèi)即可。
以上引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中，其程度如同每個(gè)出版物或?qū)＠墨I(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中一樣。
權(quán)利要求
1.一種人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合位于MUC1的氨基末端和重復(fù)結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)之間的結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體通過(guò)用粘蛋白免疫和/或選擇而獲得。
2.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是針對(duì)胰腺癌粘蛋白產(chǎn)生或選擇的。
3.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是PAM4抗體或其片段。
4.權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是人源化抗體或其片段。
5.權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是全人抗體或其片段。
6.一種人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段包含鼠PAM4單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)和人抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架(FR)區(qū)以及人抗體輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其中所述人源化PAM4單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4單克隆抗體重鏈可變區(qū)的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的FR包含至少一個(gè)被鼠PAM4單克隆抗體的相應(yīng)FR取代的氨基酸。
8.權(quán)利要求7的人源化抗體或其片段，其中來(lái)自所述鼠PAM4單克隆抗體的所述取代氨基酸是至少一個(gè)選自圖1B中PAM4 VH氨基酸序列的鼠重鏈可變區(qū)氨基酸殘基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸。
9.權(quán)利要求7的人源化抗體或其片段，其中來(lái)自所述鼠單克隆抗體的所述氨基酸是至少一個(gè)選自圖1A中PAM4 Vκ序列的鼠輕鏈可變區(qū)氨基酸殘基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸。
10.權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含圖1A的PAM4 Vκ核苷酸序列和圖1B的PAM4 VH核苷酸序列中的至少一個(gè)。
11.權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含圖4A的hPAM4 VH氨基酸序列和圖4B的hPAM4 Vκ氨基酸序列。
12.一種靶向癌細(xì)胞的包含抗體組分的診斷用綴合物或治療用綴合物，所述抗體組分包含權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的抗體或其片段，其中所述抗體組分結(jié)合至少一種診斷劑和/或治療劑。
13.權(quán)利要求12的診斷用綴合物，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑選自放射性核素、造影劑和光敏診斷劑/檢測(cè)劑。
14.權(quán)利要求13的診斷用綴合物，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是放射性核素。
15.權(quán)利要求14的診斷用綴合物，其中所述放射性核素的能量介于20keV和4000keV之間。
16.權(quán)利要求14的診斷用綴合物，其中所述放射性核素是γ發(fā)射同位素、β發(fā)射同位素或正電子發(fā)射同位素。
17.權(quán)利要求16的診斷用綴合物，其中所述放射性核素選自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ發(fā)射體、β發(fā)射體或正電子發(fā)射體。
18.權(quán)利要求13的診斷用綴合物，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是放射性造影劑。
19.權(quán)利要求18的診斷用綴合物，其中所述造影劑是順磁離子。
20.權(quán)利要求19的診斷用綴合物，其中所述順磁離子是包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)在內(nèi)的金屬。
21.權(quán)利要求18的診斷用綴合物，其中所述造影劑是包括鑭(III)、金(III)、鉛(II)、尤其是鉍(III)在內(nèi)的金屬。
22.權(quán)利要求18的診斷用綴合物，其中所述造影劑是超聲增強(qiáng)劑。
23.權(quán)利要求22的診斷用綴合物，其中所述超聲增強(qiáng)劑是脂質(zhì)體。
24.權(quán)利要求23的診斷用綴合物，其中所述脂質(zhì)體是充氣的。
25.權(quán)利要求18的診斷用綴合物，其中所述造影劑是選自碘化合物、鋇化合物、鎵化合物和鉈化合物的不透射線物質(zhì)。
26.權(quán)利要求25的診斷用綴合物，其中所述不透射線物質(zhì)選自鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鹽、丙碘酮和氯化亞鉈。
27.權(quán)利要求13的診斷用綴合物，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是光敏診斷劑/檢測(cè)劑。
28.權(quán)利要求27的診斷用綴合物，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自以下的熒光標(biāo)記化合物異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
29.權(quán)利要求27的診斷用綴合物，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自以下的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
30.權(quán)利要求27的診斷用綴合物，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白的生物發(fā)光化合物。
31.權(quán)利要求13的診斷用綴合物，其中所述綴合物用于手術(shù)中、內(nèi)窺鏡檢查或血管內(nèi)腫瘤診斷。
32.權(quán)利要求12的治療用綴合物，其中所述治療劑選自放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素類(lèi)拮抗劑、寡核苷酸、酶、酶抑制劑、光敏治療劑、細(xì)胞毒性劑、血管生成抑制劑和它們的組合。
33.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述寡核苷酸是反義寡核苷酸。
34.權(quán)利要求33的治療用綴合物，其中所述寡核苷酸是針對(duì)癌基因的反義寡核苷酸。
35.權(quán)利要求34的治療用綴合物，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
36.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒性劑。
37.權(quán)利要求36的治療用綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是藥物或毒素。
38.權(quán)利要求37的治療用綴合物，其中所述藥物具有選自抗有絲分裂藥、烷化劑、抗代謝藥、抗血管生成藥、細(xì)胞凋亡劑、生物堿和抗生素及其組合的藥物特性。
39.權(quán)利要求37的治療用綴合物，其中所述藥物選自氮芥、吉西他濱、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類(lèi)似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷類(lèi)、SN-38、COX-2抑制劑、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、抗生素、酶、酶抑制劑、表鬼臼毒素、鉑配位絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素類(lèi)拮抗劑、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素、紫杉醇、喜樹(shù)堿、多柔比星及其類(lèi)似物、抗代謝藥、烷化劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥、細(xì)胞凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-11和它們的組合。
40.權(quán)利要求37的治療用綴合物，其中所述毒素的來(lái)源選自動(dòng)物、植物和微生物。
41.權(quán)利要求37的治療用綴合物，其中所述毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
42.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。
43.權(quán)利要求42的治療用綴合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素和它們的組合。
44.權(quán)利要求43的治療用綴合物，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子(TNF)，所述造血因子是白介素(IL)，所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))，所述干擾素是干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子命名為“S1因子”。
45.權(quán)利要求42的治療用綴合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α或它們的組合。
46.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述治療劑是放射性核素。
47.權(quán)利要求46的治療用綴合物，其中所述放射性核素的能量介于60keV和700keV之間。
48.權(quán)利要求47的治療用綴合物，其中所述放射性核素選自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111Ag、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它們的組合。
49.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述治療劑是光敏治療劑。
50.權(quán)利要求49的治療用綴合物，其中所述光敏治療劑選自色原和染料。
51.權(quán)利要求32的治療用綴合物，其中所述治療劑是酶。
52.權(quán)利要求51的治療用綴合物，其中所述酶選自蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
53.一種多價(jià)多特異性抗體或其片段，所述抗體或其片段包含不止一個(gè)對(duì)PAM4靶抗原具有親和性的抗原結(jié)合部位和一個(gè)或多個(gè)對(duì)半抗原分子具有親和性的半抗原結(jié)合部位。
54.權(quán)利要求53的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是人源化抗體或其片段。
55.權(quán)利要求53的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是全人抗體或其片段。
56.權(quán)利要求53的抗體或其片段，所述抗體或其片段還包含診斷劑或治療劑。
57.一種抗體融合蛋白或其片段，所述抗體融合蛋白或其片段包含至少兩種PAM4單克隆抗體或其片段。
58.一種抗體融合蛋白或其片段，所述抗體融合蛋白或其片段包含至少一種第一PAM4單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段，其中所述第二單克隆抗體或其片段不是PAM4單克隆抗體或其片段。
59.權(quán)利要求58的抗體融合蛋白或其片段，其中所述第二單克隆抗體是癌相關(guān)抗體。
60.權(quán)利要求59的抗體融合蛋白或其片段，其中所述癌相關(guān)抗體結(jié)合胰腺癌上的抗原或者來(lái)源于胰腺癌。
61.權(quán)利要求59的抗體融合蛋白或其片段，其中所述癌相關(guān)抗體選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根據(jù)以下抗原定義的抗體路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
62.權(quán)利要求57的抗體融合蛋白，其中所述融合蛋白還包含至少一種診斷劑或治療劑。
63.一種DNA序列，所述DNA序列包含編碼選自以下的單克隆抗體或其片段的核酸(a)PAM4抗體或其片段；(b)包含至少兩種所述PAM4單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段；(c)包含至少一種包含所述單克隆抗體或其片段的第一PAM4單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中所述第二單克隆抗體或其片段不是PAM4單克隆抗體或其片段；和(d)包含至少一種第一PAM4單克隆抗體或其片段和至少一種第二單克隆抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中所述第二單克隆抗體是癌相關(guān)抗體。
64.權(quán)利要求63的DNA序列，其中所述癌相關(guān)抗體選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根據(jù)以下抗原定義的抗體路易斯抗原Le(y)、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因產(chǎn)物、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6和HER2/neu。
65.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求60的DNA序列。
66.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求63的DNA序列。
67.一種將診斷劑或治療劑或其組合傳遞到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含與至少一種診斷劑和/或治療劑綴合的PAM4抗體或其片段的組合物和(ii)給予有需要的患者權(quán)利要求12的診斷用綴合物或治療用綴合物。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑選自放射性核素、造影劑和光敏診斷劑/檢測(cè)劑。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是放射性核素。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述放射性核素的能量介于20keV和4000keV之間。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述放射性核素是γ發(fā)射同位素、β發(fā)射同位素或正電子發(fā)射同位素。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述放射性核素選自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ發(fā)射體、β發(fā)射體或正電子發(fā)射體。
73.權(quán)利要求68的方法，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是造影劑。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述造影劑是順磁離子。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述順磁離子是包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)在內(nèi)的金屬。
76.權(quán)利要求73的方法，其中所述造影劑是包括鑭(III)、金(III)、鉛(II)、尤其是鉍(III)在內(nèi)的金屬。
77.權(quán)利要求73的方法，其中所述造影劑是超聲增強(qiáng)劑。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述超聲增強(qiáng)劑是脂質(zhì)體。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述脂質(zhì)體是充氣的。
80.權(quán)利要求73的方法，其中所述造影劑是選自碘化合物、鋇化合物、鎵化合物和鉈化合物的不透射線物質(zhì)。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述不透射線物質(zhì)選自鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鹽、丙碘酮和氯化亞鉈。
82.權(quán)利要求68的方法，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑是光敏診斷劑/檢測(cè)劑。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自以下的熒光標(biāo)記化合物異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自以下的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
85.權(quán)利要求82的方法，其中所述光敏診斷劑/檢測(cè)劑是選自螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白的生物發(fā)光化合物。
86.權(quán)利要求67的方法，其中所述治療劑選自細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素類(lèi)拮抗劑、生長(zhǎng)因子、放射性核素、金屬、造影劑、寡核苷酸、酶、酶抑制劑和光敏治療劑。
87.權(quán)利要求86的治療用綴合物，其中所述寡核苷酸是反義寡核苷酸。
88.權(quán)利要求87的寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸是針對(duì)癌基因的反義寡核苷酸。
89.權(quán)利要求88的反義寡核苷酸，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
90.權(quán)利要求86的方法，其中所述治療劑是細(xì)胞毒性劑。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是藥物或毒素。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述藥物具有選自抗有絲分裂藥、烷化劑、抗代謝藥、抗血管生成藥、細(xì)胞凋亡劑、生物堿和抗生素及其組合的藥物特性。
93.權(quán)利要求91的方法，其中所述藥物選自氮芥、吉西他濱、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類(lèi)似物、蒽環(huán)霉素、SN-38、紫杉烷類(lèi)、COX-2抑制劑、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、抗生素、酶、酶抑制劑、表鬼臼毒素、鉑配位絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素類(lèi)拮抗劑、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素、紫杉醇、喜樹(shù)堿、多柔比星及其類(lèi)似物、抗代謝藥、烷化劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥、細(xì)胞凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-11和它們的組合。
94.權(quán)利要求91的方法，其中所述毒素的來(lái)源選自動(dòng)物、植物和微生物。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
96.權(quán)利要求86的方法，其中所述治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。
97.權(quán)利要求96的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素和它們的組合。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子(TNF)，所述造血因子是白介素(IL)，所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))，所述干擾素是干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ，所述干細(xì)胞生長(zhǎng)因子命名為“S1因子”。
99.權(quán)利要求96的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子。
100.權(quán)利要求96的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ、TNF-α或它們的組合。
101.權(quán)利要求86的方法，其中所述治療劑是放射性核素。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述放射性核素的能量介于60keV和700keV之間。
103.權(quán)利要求96的方法，其中所述放射性核素選自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111Ag、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它們的組合。
104.權(quán)利要求86的方法，其中所述治療劑是光敏治療劑。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述光敏治療劑選自色原和染料。
106.權(quán)利要求86的方法，其中所述治療劑是酶。
107.權(quán)利要求106的方法，其中所述酶選自蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
108.一種將診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合傳遞到靶的方法，所述方法包括(a)給予患者權(quán)利要求53的抗體或其片段；(b)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以清除所述患者血流中的非抗體量；和(c)給予所述患者包含診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合并且與所述抗體的結(jié)合部位結(jié)合的載體分子。
109.權(quán)利要求108的方法，其中所述載體分子與所述抗體的不止一個(gè)結(jié)合部位結(jié)合。
110.權(quán)利要求108的方法，其中所述診斷劑/檢測(cè)劑或所述治療劑選自同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、激素類(lèi)拮抗劑、寡核苷酸、酶、酶抑制劑、生長(zhǎng)因子、放射性核素和金屬。
111.權(quán)利要求110的治療用綴合物，其中所述寡核苷酸是反義寡核苷酸。
112.權(quán)利要求111的寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸是針對(duì)癌基因的反義寡核苷酸。
113.權(quán)利要求112的反義寡核苷酸，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
114.一種診斷或治療癌癥的方法，所述方法包括(a)給予有需要的患者權(quán)利要求50的抗體或其片段；(b)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以清除所述患者血流中的非抗體量；和(c)給予所述患者包含診斷劑/檢測(cè)劑、治療劑或其組合并且與所述抗體的結(jié)合部位結(jié)合的載體分子。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
116.權(quán)利要求114的方法，其中所述方法可用于患病組織的手術(shù)中鑒定、患病組織的經(jīng)內(nèi)窺鏡檢查鑒定或患病組織的血管內(nèi)鑒定。
117.一種治療患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予所述患者治療有效量的包含PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段的抗體或其片段，其中所述PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段與至少一種治療劑綴合；和(b)將所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。
118.權(quán)利要求117的方法，所述方法還包括給予第二單克隆抗體或其片段。
119.權(quán)利要求118的方法，其中所述第二單克隆抗體或其片段是裸單克隆抗體或其片段。
120.權(quán)利要求118的方法，其中所述第二單克隆抗體或其片段選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根據(jù)以下抗原定義的抗體路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
121.權(quán)利要求118的方法，其中所述第二單克隆抗體或其片段與治療劑或診斷劑/檢測(cè)劑綴合。
122.權(quán)利要求117的方法，所述方法還包括給予權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)的第二單克隆抗體或其片段。
123.權(quán)利要求117的方法，其中所述PAM4抗體經(jīng)胃腸外給予。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述PAM4抗體以20-2000毫克蛋白/劑的劑量給予。
125.權(quán)利要求124的方法，其中所述劑量重復(fù)給予。
126.權(quán)利要求117的方法，其中所述PAM4抗體或其片段選自非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)PAM4抗體或其片段、人PAM4抗體或其片段和人源化PAM4抗體或其片段。
127.權(quán)利要求126的方法，其中所述人PAM4抗體和人源化PAM4抗體恒定區(qū)和絞鏈區(qū)包含人IgG的恒定區(qū)和絞鏈區(qū)。
128.權(quán)利要求117的方法，其中在給予所述患者與由所述惡性腫瘤表達(dá)的第二腫瘤標(biāo)記起反應(yīng)的第二裸抗體或綴合抗體之前、同時(shí)或之后給予所述PAM4抗體。
129.權(quán)利要求117的方法，其中在給予所述患者至少一種治療劑之前、同時(shí)或之后給予所述PAM4抗體。
130.一種診斷患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予所述患者診斷有效量的包含PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段的診斷用綴合物，其中所述PAM4單克隆抗體或其片段或PAM4抗體融合蛋白或其片段與至少一種診斷劑/檢測(cè)劑綴合；和(b)任選將所述PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。
131.一種治療患者的癌細(xì)胞的方法；所述方法包括(i)給予所述患者治療有效量的包含裸PAM4單克隆抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物；(ii)將所述裸PAM4單克隆抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段配制在藥學(xué)上適合的賦形劑中。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述組合物還包含第二裸抗體或其片段。
133.權(quán)利要求132的方法，其中所述第二裸抗體或其片段是PAM4單克隆抗體或其片段。
134.權(quán)利要求132的方法，其中所述第二抗體或其片段不是PAM4單克隆抗體或其片段。
135.權(quán)利要求132的方法，其中所述第二抗體或其片段選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根據(jù)以下抗原定義的抗體路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
136.權(quán)利要求134的方法，其中所述第二抗體或其片段選自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根據(jù)以下抗原定義的抗體路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因產(chǎn)物和HER2/neu。
137.權(quán)利要求131的方法，其中所述裸PAM4抗體經(jīng)胃腸外給予。
138.權(quán)利要求137的方法，其中所述裸PAM4抗體以20-2000毫克蛋白/劑的劑量給予。
139.權(quán)利要求138的方法，其中所述劑量重復(fù)給予。
140.權(quán)利要求131的方法，其中所述裸PAM4抗體選自非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)PAM4抗體、人PAM4抗體和人源化PAM4抗體。
141.權(quán)利要求140的方法，其中所述人和人源化裸PAM4抗體恒定區(qū)和絞鏈區(qū)包含人IgG的恒定區(qū)和絞鏈區(qū)。
142.權(quán)利要求132的方法，其中在給予所述患者所述第二裸抗體之前、同時(shí)或之后給予所述裸PAM4抗體或其片段。
143.一種診斷患者的惡性腫瘤的方法，所述方法包括(i)對(duì)來(lái)自所述患者的標(biāo)本用包含權(quán)利要求1的裸PAM4單克隆抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段的組合物進(jìn)行體外診斷分析。
144.權(quán)利要求143的方法，其中所述惡性腫瘤是癌。
145.權(quán)利要求144的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
146.權(quán)利要求143的方法，其中所述體外診斷分析選自免疫測(cè)定、PCR、RT-PCR和免疫組織化學(xué)。
147.權(quán)利要求146的方法，其中所述體外診斷分析是RT-PCR或免疫測(cè)定。
148.權(quán)利要求147的方法，其中所述標(biāo)本是體液或組織。
149.權(quán)利要求146的方法，其中所述診斷分析是免疫組織化學(xué)。
150.權(quán)利要求149的方法，其中所述標(biāo)本是細(xì)胞群體或組織。
151.一種手術(shù)中鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和
152.一種經(jīng)內(nèi)窺鏡檢查鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和
153.一種血管內(nèi)鑒定患者的表達(dá)PAM4抗原的患病組織的方法，所述方法包括(A)給予有效量的包含至少一個(gè)特異性結(jié)合表達(dá)PAM4-抗原的靶向組織的臂和至少另一個(gè)特異性結(jié)合靶向綴合物的臂的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述一個(gè)特異性結(jié)合靶向組織的臂是hPAM4抗體或其片段；和(B)給予選自以下的靶向綴合物(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2； 和
154.一種在內(nèi)窺鏡檢查、血管內(nèi)導(dǎo)管或外科手術(shù)中檢測(cè)損害的方法，其中所述方法包括(a)給準(zhǔn)備進(jìn)行所述手術(shù)的患者注射雙特異性抗體F(ab)2或其F(ab′)2片段、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體，其中所述雙特異性抗體或其片段、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體具有與PAM4抗原特異性結(jié)合的第一抗體結(jié)合部位，并且具有與半抗原特異性結(jié)合的第二抗體結(jié)合部位，允許所述抗體片段附加在靶部位；(b)任選用半乳糖基化抗獨(dú)特型清除劑清除非靶向抗體片段，如果在注射約24小時(shí)內(nèi)所述雙特異性片段大部分沒(méi)有從循環(huán)中清除的話，然后注射二價(jià)標(biāo)記半抗原，所述半抗原很快地集中在靶部位并通過(guò)腎臟清除；(c)在初次注射48小時(shí)內(nèi)，通過(guò)使用檢測(cè)手段近距離檢測(cè)靶部位升高的附加標(biāo)記水平來(lái)檢測(cè)存在的所述半抗原，然后進(jìn)行所述手術(shù)，其中所述檢測(cè)在不使用造影劑或扣除劑的情況下進(jìn)行。
155.一種在手術(shù)中、血管內(nèi)手術(shù)中或內(nèi)窺鏡手術(shù)中近距離損害檢測(cè)的方法，其中所述方法包括(a)給準(zhǔn)備進(jìn)行所述手術(shù)的患者胃腸外注射有效量的hPAM4免疫綴合物或其片段，(b)在注射48小時(shí)內(nèi)實(shí)施所述手術(shù)；(c)用檢測(cè)所述標(biāo)記抗體或其片段的存在的檢測(cè)手段，對(duì)患者的內(nèi)部可及部位進(jìn)行近距離掃描；和(d)根據(jù)在所述部位用所述檢測(cè)手段檢測(cè)到所述標(biāo)記抗體或其片段水平升高，對(duì)所述標(biāo)記抗體或其片段的附加部位進(jìn)行定位。
全文摘要
本發(fā)明涉及單價(jià)和多價(jià)單特異性抗體以及多價(jià)多特異性抗體。這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案具有一個(gè)或多個(gè)相同的結(jié)合部位，其中每個(gè)結(jié)合部位與靶抗原或靶抗原上的表位結(jié)合。這些抗體的另一個(gè)實(shí)施方案具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合部位，其中這些結(jié)合部位對(duì)靶抗原上的不同表位或者不同的靶抗原具有親和性，或者對(duì)靶抗原和半抗原具有親和性。本發(fā)明還涉及可用于在宿主中表達(dá)這些功能性抗體的重組載體。更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及命名為PAM4的腫瘤相關(guān)抗體。本發(fā)明還涉及人源化PAM4抗體和人PAM4抗體以及所述抗體在診斷和治療中的用途。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1675245SQ03819294
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月14日
發(fā)明者D·M·戈登伯格, H·漢森, Z·屈 申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司