專利名稱：抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及基因工程。特別是關于一種抗肝癌基因工程單鏈抗體。
背景技術：
按照世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全世界每年就有100余萬患者死于肝癌，而我國肝癌的發(fā)病率占全世界的42.5％。迄今國外的Shouval及Dunk等和國內的謝弘及我們等都報道了抗肝癌單克隆抗體，其中的一些單克隆抗體用131I標記后，進行了有效的臨床肝癌放射免疫顯像。然而鼠源性單克隆抗體用于病人會產生人抗鼠免疫球蛋白抗體，限制了在治療中重復使用，因而使用基因工程的手段對單克隆抗體進行改造成鼠/人嵌合或單鏈抗體才是解決問題的好辦法。雖然抗結腸癌、乳腺癌等腫瘤的基因工程鼠/人嵌合抗體、單鏈抗體等在國外已有許多報道，但抗肝癌的基因工程抗體國外目前尚未見報道，國內連我們的工作單位共有5個單位報導了肝癌單鏈抗體，如(1)牛利國等.細胞與分子免疫學雜志，1998，14(2)102-104。(2)畢向軍、楊冬華.第一軍醫(yī)大學學報，2001，21(12)910-913.《腫瘤》2001，14(2)102-104。(3)謝捷明等。福建醫(yī)學雜志，2000，22(1)203-205。(4)李賞等.免疫學雜志，2002，18(B)(06)20-21。我們最早在我國1996年克隆了單克隆抗體HAb25的輕鏈與重鏈的基因，1998年相繼發(fā)表了抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25的應用論文，對scFv25進行了人源化、二硫鍵穩(wěn)定以及融合蛋白的制備。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，它利用基因工程將單克隆抗體改造成單鏈抗體，用于克服上述缺點。
本發(fā)明的技術方案是制備了一種抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，它的氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E WI G EIA PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F KN KA T LTVH-CDR2
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所述的抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，它的重鏈氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q VQ L LE SG T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K LS C K A SG Y T F TS Y WM HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V KQ R P G Q G L E WI G EIA PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N GR I Y Y N E K F KN KA TL TVH-CDR2
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所述的人源化及二硫鍵穩(wěn)定的scFv25氨基酸序列是GAA TTC GAG GTA CAG CTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGTTCT CTG AAA CTG TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACT TTC ACT TCT TAC TGG ATGCAC TGG GTT CGT CAG GGC CCG GGT AAA GGT CTG GAA TGG ATC GGT GAA ATT AACCCG TCT AAC GGT CGT ATC TAC TAC AAC GAA AAG TTC AAG AAC AAA GCT ACT CTG
ACT GTT GAC AAA TCT AAG AAC ACT GCT TAC CTG CAG ATG AAC TCT CTG CGT GCTGAG GAC ACT GTG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGGGGC TGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TAG GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGTGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCCCTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT CAG AGCCTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGCCAG TGT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GT T TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTCCCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC GAG ATC AGCAGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTTCCG TAC ACG TTG GGA GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA本發(fā)明與已有技術對比特點是抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25除具有一般單鏈抗體的優(yōu)點外，如分子量小、穿透能力強、免疫原性低、血循環(huán)及全身廓清快和容易基因工程大量生產等，進一步證明它保留并超出了HAb25的特異性及親合性，并進行了人源化、穩(wěn)定性及融合蛋白制備及應用，是一種非常具有臨床應用潛力的基因工程抗體。
下面對本發(fā)明抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25的實施進行詳細說明。
具體實施例方式一，抗肝癌單克隆抗體HAb25的制備用外科手術切除的新鮮的原發(fā)性肝細胞肝癌標本制備肝癌細胞懸液為免疫原免疫BALB/C小鼠，采用腹腔免疫途徑，選擇了腹腔巨噬細胞或胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞。將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/O細胞融合，獲得雜交瘤細胞，用石蠟切片進行免疫組織化學方法篩選，凡與正常肝細胞石蠟切片不反應而與肝癌切片反應的予以保留，得到可持續(xù)分泌抗體的杭肝癌單克隆抗體HAh25雜交瘤細胞株，將HAb25雜交瘤細胞株接種于小鼠腹腔，收集腹水，腹水內蛋白經硫酸胺沉淀和陽離子常壓液相色譜純化，獲得HAb25活性蛋白。HAb25經檢測證明具有較強的特異性和較高的親和力，具體表現(xiàn)在；1、肝細胞肝癌石蠟切片陽性反應率為84％(79/94)，與癌周肝、肝炎、肝血管瘤、肝囊腫和肝轉移瘤無交叉反應，與肝硬化只有5.7％(3/53)的交叉反應。
2、經膠體金標記后，在4℃下與肝癌細胞作用1小時后，37℃下培養(yǎng)0，5，10、20、30、60、120分鐘后，在電經電鏡下觀察到抗體通過胞飲、被覆內陷、絨毛折斷吞噬、糖萼內陷及直接擴散途徑內化到肝癌細胞。
3.HAb25經131I標記后，注入荷人肝癌裸鼠，72小時可在腫瘤部位清晰顯像(ECT)，T/N值為6.844.HAb25經131I標記后以3-5mci/人注入5名疑為肝癌的病人，其中4例在ECT下可顯像。HAb25和藥物的免疫交聯(lián)物對荷人肝癌裸鼠有一定治療作用。
二、抗肝癌單鏈抗體(scFv25)的制備；從HAb25雜交瘤細胞中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR法擴增出單克隆抗體HAb25的輕、重鏈可變區(qū)基因(YL，VH)，經分析是重排的IgV區(qū)基因。將VLVH通過人工合成的多肽Linker連接起來，形成一個分子量只有全抗體1/6的活性抗體分子。具體說明如下1、取HAb25雜交細胞株，提取總RNA，經Oligo(dT)為引物逆轉錄合成cDNA，加輕、重鏈引物經PCR擴增出VL和VH，克隆入pUC19質粒載體并進行序列分析，與已知IgV序列比較，有較高的同源性，并右新抗體的一定變異，成功的獲得了HAb25的輕、重鏈可變區(qū)基因VL.VH。
2、單鏈抗體的構建先將人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆載體，構建成pUC19-Linker，進一部將VL克隆入pUC19-Linker，構建成pUC19-Linker-VL，再將VH克隆入pUC19-Linker-VL，構建成pUC19-VH-Linke-VL，即重組抗肝單鏈抗體克隆載體pUC19-scFv25，然后將scFv25亞克隆入pET15b，構建成抗肝癌單鏈抗體的重組原核表達載體pET15b-SCFV25。
3、scFv 25的誘導表達重組pET15b-scFv25.原核表達載體宿主菌經IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導表達，收集菌體—提取包涵體 變性—>復性—>進一步純化，獲得抗肝癌單鏈抗體scFv 25；活性蛋白。
4、scFv25的活性測定scFv25與SMMC-7721肝癌細胞作用封閉抗原后加親本抗體HAb25，作用后加FITC標記的羊抗鼠IgG，以親本抗體自身及無關抗體作對照。流式細胞儀測定結果顯示，scFv25可封閉親本抗體53％的親和活性，在裸鼠內瘤/肝比值scFv25提高到9.6。
三、scFv25的人源化改造及二硫鍵穩(wěn)定和融合蛋白的制備應用1、人源化改造單克隆抗體在臨床上有極大的應用價值，但應用于體內會誘導人抗鼠抗體(HAMA)反應，嚴重限制了它的應用前景。為降低鼠源抗體的免疫原性，必須將其進行人源化，HAb25是肝細胞癌特異性鼠源單克隆抗體，進行人源化改造，表達出的單鏈抗體將可能用于放射免疫顯像及生物導向治療。用同源模建預測抗體可變區(qū)的三維結構及利用蛋白質工作站，以計算機輔助設計確定人源化突變方案。根據(jù)人源化替換方案，重鏈可變區(qū)將對21處進行人源化，保留8處；輕鏈進行2處替換而保留其余7處差異殘基。由于重鏈可變區(qū)的人源化突變集中于前80個氨基酸，可通過部分基因合成、重疊PCR方法構建人源化重鏈可變區(qū)基因；輕鏈可變區(qū)的兩個突變則在引物中引入。根據(jù)人源化設計的結果，構建了肝細胞癌特異性鼠單抗HAb25的鼠源及人源化單鏈抗體基因并以3種不同的表達途徑進行了表達研究。結果表明，不論是融合表達、胞內表達或分泌表達，還是降低培養(yǎng)溫度、改變誘導物IPTG的濃度，表達產物都是以包涵體形式存在，經過其融合蛋白對裸鼠肝癌的治療效果是滿意的。
2、二硫鍵穩(wěn)定人源化hscFv25是1株很有前途的抗肝癌人源化抗體，但作為臨床應用而言，重組抗肝癌單鏈抗體-hTNF仍存在一定的缺陷，這主要表現(xiàn)在單鏈抗體的穩(wěn)定性差。由于上述缺陷，我們以二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(ds-scFv)替代原來的單鏈抗體，提高了穩(wěn)定性。二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體是在保留單鏈抗體的Linker的基礎上，在輕、重鏈內各定點突變引入1個半胱氨酸，以完整的1條鏈的形式進行表達，并在輕重鏈可變區(qū)之間形成二硫鍵，達到提高穩(wěn)定性的作用。由原來的37℃，1小時的半衰期，達到在4℃放置3個月活性無明顯下降。
3、融合蛋白制備及治療效果制備并高效表達抗肝癌鼠及人源化單鏈抗體m/hscFv25，與人天然型TNF-α連接后取得了一定的治療效果。但由于天然型TNF-α的毒副作用很大，用高活性、低毒性的突變型TNF-α(mTNF-α)將之替代，構建新型、高效、低毒的抗肝癌抗體原核表達載體pGEX4T-1/scFv25-mTNF-α，通過誘導表達、純化后，對SMMC-7721肝癌細胞及荷肝癌裸鼠進行導向治療研究。體內荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠抑瘤實驗結果顯示，經抗體治療14天后，mscFv25-mTNF-α和hscFv25-mTNF-α治療組的腫瘤抑制率均為5/5，其中2/5為完全緩解，3/5為部分緩解，兩組的療效相似(P＞0.05)；mTNF-α對照組的腫瘤緩解率為5/5，均為部分緩解，較m/hscFv25-mTNF-α治療組療效明顯降低(P＜0.05)。
權利要求
1.抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，它的特殊氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E W I G E I A PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F K N KA T L TVH-CDR2GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D K S S N T A Y M E L T S L T S EGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD S A V Y S C A RL V G P F S Y W GVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGAQ G T L V T V S S E LG G G G S G GGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG G S G G G G SG S R C E L V M T QLinkerACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P V S L G D Q A S I S CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S Q S L V H S N GN T Y L H W Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K L L I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R F S G S G S G T D F T LAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A E D L G V Y F CS Q SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL G G G T K L E L K R VVL-CDR3GACD。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，其特征是它的重鏈氨基酸序列是ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCAM Q V Q L L E S G T E L. V K P G A SGTG AAA CTG TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGT TAT TGG ATG CACV K L S C K A S G Y T F TS Y W M HVH-CDR1TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCTW V K Q R P G Q G L E W I G EI A PAGC AAC GGT CGT ATT TAC TAC AAT GAA AAG TTC AAG AAC AAG GCC ACA CTG ACTS N G R I Y Y N E K F K N KA T L TVH-CDR2GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAT ATG GAA CTC ACC AGC CTG ACA TCT GAGV D K S S N T A Y M E L T S L T S EGAC TCT GCG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGG GGCD S A V Y S C A RL V G P F S Y WGVH-CDR3CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GAG CTCQ G T L V T V S S E L ；它的輕鏈氨基酸序列是GGA TCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAGG S R C E L V M T QACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGAT P L S L P V S L G D Q A S I S CRTCT AGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTGS S Q S L V H S N GN T Y L H W Y LVL-CDR1CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTTQ K P G Q S P K L L I YK V S N R FVL-CDR2TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTCS G V P D R F S G S G S G T D F T LAAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGTK I S R V E A E D L G V Y F CS Q SACA CAT GTT CCG TAC ACG TTG GGA GGG GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA CGT GTCT H V P Y TL G G G T K L E L K R VVL-CDR3GACD；它的連接肽是GGT GGA GGC GGT TCA GGT GGAG G G G S G GGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCTG G S G G G G S。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，其特征是所述的人源化及二硫穩(wěn)定后的氨基酸序列是GAA TTC GAG GTA CAG CTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGTTCT CTG AAA CTG TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACT TTC ACT TCT TAC TGG ATGCAC TGG GTT CGT CAG GGC CCG GGT AAA GGT CTG GAA TGG ATC GGT GAA ATT AACCCG TCT AAC GGT CGT ATC TAC TAC AAC GAA AAG TTC AAG AAC AAA GCT ACT CTGACT GTT GAC AAA TCT AAG AAC ACT GCT TAC CTG CAG ATG AAC TCT CTG CGT GCTGAG GAC ACT GTG GTC TAT TCT TGT GCA AGA TTG GTG GGA CCC TTC TCT TAC TGGGGC TGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TAG GAG CTC GGT GGA GGC GGT TCA GGTGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCT GGA TCC ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCCCTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCC TGC AGA TCT AGT CAG AGCCTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGCCAG TGT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GT T TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTCCCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC GAG ATC AGCAGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTTCCG TAC ACG TTG GGA GGG ACC AAG GTC GAG ATC AAA。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及基因工程。特別是關于一種抗肝癌基因工程單鏈抗體。這種抗肝癌基因工程單鏈抗體scFv25，它利用基因工程將單克隆抗體改造成單鏈抗體，用于克服鼠源性單克隆抗體用于病人會產生人抗鼠免疫球蛋白抗體的缺點。它除具有一般單鏈抗體的優(yōu)點外，如分子量小、穿透能力強、免疫原性低、血循環(huán)及全身廓清快和容易基因工程大量生產等，進一步證明它保留并超出了HAb25的特異性及親合性，并進行了人源化、穩(wěn)定性及融合蛋白制備及應用，是一種非常具有臨床應用潛力的基因工程抗體。
文檔編號C07K16/44GK1535985SQ03114660
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權日2003年4月9日
發(fā)明者劉彥仿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學