專利名稱：抗cd86人源化單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物免疫學領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及單克隆抗體技術(shù)、抗體人 源化技術(shù)以及基因重組技術(shù)。
背景技術(shù)：
人體的免疫系統(tǒng)是人體抵抗外來病毒感染、維持身體健康最重要的防御屏障。 針對侵入人體的異物(病毒、被移植的器官等)，人體首先通過抗原遞呈細胞(APC)， 如樹突狀細胞，將抗原加工處理，然后通過APC細胞表面的MHC將抗原分別遞呈 給T細胞和B細胞。T細胞在其表面CD3抗原的幫助下，通過其表面的T細胞受 體(TCR)識別并結(jié)合遞呈的抗原，這是機體免疫反應激活的第一信號；然后，APC 細胞表面的CD86結(jié)合T細胞表面的CD28，實際這是T細胞激活的第二信號。T細 胞被激活后，產(chǎn)生活化的T細胞去破壞和殺死被病毒感染的或異源體細胞，防止 病毒的復制和傳播，這就是人體的細胞免疫途徑。B細胞則分泌特異性抗體結(jié)合入 侵的病毒顆粒，中和病毒的感染能力并引導體內(nèi)的巨噬細胞吞噬病毒顆粒，這是 人體的體液免疫途徑。當體內(nèi)的病毒被清除后，APC細胞不再遞呈經(jīng)加工的抗原后, 抑制性T細胞就通過其表面的CTLA-4抗原結(jié)合APC細胞表面的CD86抗原，阻斷CD86 對T細胞表面的CD28抗原的激活作用，從而將人體的免疫反應降低到正常水平。 這就是人體免疫系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)(見圖1:雙信號模型?？乖禺愋缘牧馨图毎?活需要兩種信號，信號I是抗原多肽與主要組織相容性復合物組成的復合物(MHC) 和T細胞受體(TCR)之間的相互作用，信號II是表達在抗原遞呈細胞表面的共 刺激細胞表面分子傳遞到T細胞的。通過操縱共刺激信號通路可以作為一種治療 手段促進或終止免疫反應)。如果人體免疫系統(tǒng)平衡的調(diào)節(jié)發(fā)生異常，就會產(chǎn)生疾病。例如，雖然腫瘤細 胞可以產(chǎn)生一些特異的抗原，但是腫瘤病人的T細胞并不能識別并殺死腫瘤細胞。 許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人體內(nèi)的T細胞表面CTLA-4的表達異常升高，雖然APC細 胞可以遞呈抗原，但是由于CTLA-4封閉了CD86抗原與CD28抗原的結(jié)合，導致T細胞無法活化，使腫瘤細胞逃避了機體的免疫監(jiān)視。如果用特異性的藥物或抗體封閉CTLA-4，使之無法與CD86抗原結(jié)合，就能夠激活腫瘤病人自身的T細胞，最 終達到清除腫瘤細胞的目的。如果人體的免疫反應過強，人體同樣會產(chǎn)生疾病。 例如，正常情況下，人體的T細胞不會識別自身的抗原，B細胞也不會產(chǎn)生針對自 身抗原的抗體，但是在自身免疫性疾病患者體內(nèi)，具有識別自身抗原功能的T、 B 細胞攻擊自身的組織器官，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊椎炎和系統(tǒng)性紅斑狼 拖等。如果采用特異的藥物或抗體封閉與T、 B細胞激活相關(guān)的CD3或CD86抗原， 就可以減輕自身免疫性疾病患者的癥狀。對于器官移植的病人，病人體內(nèi)的免疫細胞將移植物當作外來異物進行排斥。 因此在術(shù)后相當長的時間內(nèi)，病人需要服用免疫抑制劑以延長被移植物的存活時 間，如環(huán)磷酰胺。由于環(huán)磷酰胺是非特異性免疫系統(tǒng)抑制劑，有較強的副作用。 如果采用CD3或CD86的抗體直接阻斷T細胞的激活，既可抑制機體的免疫排斥反 應，又不會帶來明顯的不良反應。目前，單克隆抗體在世界醫(yī)藥市場異軍突起，已成為世界生物工程制藥業(yè)的 支柱產(chǎn)品之一。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，鼠源性單克隆抗體將逐漸被人源化抗體所 替代，其主要原因是鼠源性單克隆抗體與人補體成分結(jié)合能力低，CDC作用相應 較弱，對腫瘤細胞的殺傷能力較弱；它與NK等免疫細胞表面Fc受體親和力弱， 介導的ADCC作用較弱；鼠源抗體在人血循環(huán)中的半衰期短，它發(fā)揮ADCC與CDC 作用的時間較短；鼠單克隆抗體具有免疫原性，宿主易產(chǎn)生抗抗體引起過敏反應。本發(fā)明者通過不斷摸索，最終實現(xiàn)了對鼠抗人CD86單克隆抗體基因的人源化 改造，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明第一個目的在于提供一種CD86人源化單克隆抗體。本發(fā)明第二個目的在于提供一種編碼CD86人源化單克隆抗體重鏈可變區(qū)的 DNA分子。本發(fā)明第三個目的在于提供一種編碼CD86人源化單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的 DNA分子。本發(fā)明第四個目的在于提供一種載體，所述載體包含編碼CD86人源化單克隆 抗體重鏈可變區(qū)的'DNA序列和/或編碼CD86人源化單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的DNA 序列。本發(fā)明第五個目的在于提供一種轉(zhuǎn)染方法。 本發(fā)明第六個目的在于提供一種宿主細胞。本發(fā)明第七個目的在于提供CD86人源化單克隆抗體在制備預防或治療自身免 疫性疾病或抑制移植物排異反應的藥物上的應用。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供一種CD86人源化單克隆抗體，所述抗體包括小鼠來源 的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及人源的抗體恒定區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)是序列 表中SEQ ID N0:1所示序列，所述輕鏈可變區(qū)是序列表中SEQ ID N0:2所示序列。本發(fā)明的另一個方面提供一種DNA分子，所述DNA分子是編碼序列表中SEQ ID N0:1的核苷酸序列，即SEQ ID N0:3所示序列。本發(fā)明的另一個方面提供一種DNA分子，所述DNA分子是編碼序列表中SEQ ID N0:2的核苷酸序列，即SEQ ID N0:4所示序列。本發(fā)明的再一個方面提供一種載體，所述載體包含序列表中SEQ ID N0:3所 示序列和/或序列表中SEQ ID N0:4所示序列。本發(fā)明的還有一個方面提供一種轉(zhuǎn)染方法，所述轉(zhuǎn)染方法是將包含抗體重鏈 可變區(qū)基因的載體與包含輕鏈可變區(qū)基因的載體和一種帶有抗性篩選基因的載體 共轉(zhuǎn)染宿主細胞，或?qū)贵w重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因的載體與帶有 抗性篩選基因的載體共轉(zhuǎn)染宿主細胞。本發(fā)明進一步提供一種宿主細胞，所述宿主細胞為包含序列表中SEQ IDN0:3 所示序列和/或序列表中SEQ ID N0:4所示序列的載體所轉(zhuǎn)染的細胞。本發(fā)明更進一步提供CD86人源化單克隆抗體在制備預防或治療自身免疫性疾 病或抑制移植物排異反應的藥物上的應用。發(fā)明詳述利用DNA重組技術(shù)將鼠單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū) 的表達載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞表達出人鼠嵌合抗體，其人源化程度達到70% 左右，完整地保留了異源單抗的可變區(qū)，最大限度地保持了其親和活性，降低了 免疫原性。1. CD86基因的克隆靜脈抽取人血，經(jīng)FICOLL密度離心，取上層有核細胞部分，經(jīng)PBS清洗后， 用Trizol法提取總RNA，然后用Oligo (dT)作為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成 cDNA，隨后采用PCR的方法擴增人CD86的全長基因。2. 抗原制備與動物免疫將所獲得的CD86基因分別克隆到真核基因表達載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒， 隨后轉(zhuǎn)染工程細胞，混合并經(jīng)培養(yǎng)后選擇陽性細胞。取一部分陽性細胞作為細胞 抗原，免疫小鼠，分離脾細胞。3. 細胞融合混合脾細胞與骨髓瘤細胞，進行融合反應，其間更換數(shù)次培養(yǎng)液，每次換液 前均觀察雜交瘤細胞的生長。待出現(xiàn)雜交瘤細胞后，取上清以檢測抗體的分泌。4. 抗體的檢測采用流式細胞術(shù)檢測分泌抗體的特異性，若雜交瘤細胞有分泌人CD86抗體， 則可在檢測結(jié)果中看到表達目的基因的CH0細胞與空白CH0細胞存在明顯的峰移。5. 單克隆抗體的制備與鑒定將上述篩選出的陽性細胞株進行抗體制備，采用小鼠腹腔接種法。用鹽析法 對抗體進行粗提，隨后用蛋白親和層析法進一步純化抗體，并采用流式細胞儀檢 測抗體與抗原的結(jié)合。6. 抗體的蛋白質(zhì)N-端測序取純化后的單克隆抗體進行SDS-PAGE，分離抗體的重鏈和輕鏈，接著進行 Western-blot試驗，隨后使用蛋白質(zhì)序列測序系統(tǒng)對重鏈、輕鏈進行蛋白測序。7. CD86單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的克隆根據(jù)蛋白測序結(jié)果反推抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)5'端序列并合成相應引物，選 擇重鏈和輕鏈恒定區(qū)序列作為3'端引物，采用RT-PCR方法分別擴增重鏈和輕鏈 可變區(qū)的基因。將所得基因克隆到載體中，進行DNA序列分析確證。8. 人源化表達載體的構(gòu)建與表達構(gòu)建重鏈、輕鏈表達載體，所述載體已分別含有人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)序 列基因；克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基因序列；將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆到表達 載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化檢測人源化抗體的表達，選擇抗體表達濃度高的克隆擴大培養(yǎng)以 純化抗體。9. 抗體的純化與鑒定擴大培養(yǎng)抗體表達濃度高的克隆，經(jīng)濃縮后采用親和層析進行純化。采用UV 法檢測抗體濃度，采用SDS-PAGE法檢測抗體純度。10. 人源化CD86抗體抑制樹突狀細胞對T細胞的激活 將分離的人樹突狀細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時加入不同比率的CD4+T細胞。提取細胞基因組DNA，隨后檢測DNA的合成。采用這一試驗方法，以證明經(jīng)人源化改 造后，CD86抗體仍具有抑制T細胞激活的能力。有益效果本發(fā)明提供的CD86人源化單克隆抗體大大減少了鼠單克隆抗體的免疫原性， 實現(xiàn)了其在工程細胞(如CH0細胞)中的無血清培養(yǎng)基高表達，且表達產(chǎn)物生物 活性高，可以應用于自身免疫性疾病和抑制器官移植后宿主排異反應藥物的制備 上。


圖l人體T細胞的激活與抑制(雙信號模型)。圖2 CD86單抗特異結(jié)合成熟DC細胞表面的CD86抗體。圖3人源化CD86抗體的純化結(jié)果。圖4人源化CD86抗體抑制DC細胞對T細胞的激活能力。圖5免疫斑點印跡檢測人源化CD86抗體在CH0細胞中的表達。
具體實施方式
下面用實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限 制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落 在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實施例l CD86基因的克隆1. FIC0LL密度梯度離心靜脈抽取5ml人血，經(jīng)FIC0LL密度梯度離心(用 等體積PBS緩沖液稀釋血液,在15ml塑料離心管中先加入3ml FIC0LL溶液，用 移液器將10ral稀釋的血液小心地鋪在FIC0LL溶液的上層，盡量避免液面混合， 室溫下2000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，離心結(jié)束后，小心棄血漿層，用移液器小心吸取中間白色細胞層并轉(zhuǎn)移到新的離心管中)，取上層有核細胞部分并用10毫 升PBS(150腿ol/L的NaCl， 2. 7mmol/L的KC1， 6. 5咖ol/L的Na2HP04， 1. 5mmol/L 的KH2P04， pH7.4)清洗3次。 .2. Trizol法提取總RNA:細胞用1毫升Trizol試劑重懸，加200微升氯 仿，振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，于12000Xg、 4。C離心10分鐘，取上層水相，加等體積的異丙醇，于4。C放置30分鐘，隨后于12000Xg、 4。C離心30分鐘， 棄液體，沉淀用1毫升70%的乙醇洗滌一次，室溫晾干后，用IOO微升水溶解總 腿。3. 用01igo (dT) 12-18作為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA:1) 在0. 5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 " g,補充適量的DEPC H20 使總體積達llwl，在管中加10uM Oligo (dT) 12-18 lul，輕輕混勻、 離心；2) 70。C加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少lmin。然后加 入下列試劑的混合物10XPCR緩沖液2ul、 25mM MgCl2 2ul、 10mM dNTPmiX lul、 0. lMDTT2ul，輕輕混勻，離心，42。C孵育2-5min;3) 加入Superscript II1 ti 1，在42。C7K浴中孵育50min;4) 于7(TC加熱15min以終止反應；5) 將管插入冰中，加入RNase H lu 1， 37。C孵育20min，降解殘留的 RNA， -2(TC保存?zhèn)溆谩?. 采用PCR的方法擴增人CD86的全長基因，所用引物分別為 C廳5，端弓l物(SEQ ID N0:5): 5， -gcaggctccaccatggatcc-3，； C跳3，端弓l物(SEQ ID N0:6): 5， -acatgtttttaggacccagc-3 ，。5. PCR產(chǎn)物克隆至T-EASY載體(PROMEGA)及質(zhì)粒的提取1) PCR產(chǎn)物和T載體的連接a) PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預期大小的DNA 片段(凝膠中DNA片段的回收使用試劑盒進行操作，例如碧云天的DNA 凝膠回收試劑盒D0056,采用試劑盒提供的方法操作)；b) 配制連接混合液50ng的T-EASY載體、200ng的待插入片段、 5ul的快速連接緩沖液(2X)隨后加雙蒸水或MilliQ水至9.5"1、 0. 1的Rapid T4 DNA連接酶，總體積lOul;c) 用移液器輕輕吹打混勻或輕微渦懸混勻上述連接混合液，室溫 離心數(shù)秒，使液體積聚于管底；d) 室溫孵育5-10分鐘或更長時間，隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。2) 受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37'C下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期；將該菌懸液以 1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)2-3小時至 0D6。。=0. 5左右。3) 感受態(tài)細胞制備(CaCl2法)a) 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，4。C下3000Xg離 心IO分鐘；b) 棄上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮細胞， 冰上放置15-30分鐘后，4'C下3000Xg離心10分鐘；c) 棄上清，加入4ml預冷含15y。甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液， 輕輕懸浮細胞，冰上放置數(shù)分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液；d) 感受態(tài)細胞分裝成200"1的小份，貯存于-7(TC可保存半年。4) 轉(zhuǎn)化a) 從-7(TC冰箱中取200iil感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍， 隨后立即置冰上；b) 加入連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘；c) 42。C水浴中熱擊90秒或37'C水浴5分鐘，隨后迅速置于冰上冷 卻3-5分鐘；d) 向管中加入lml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37。C振蕩 培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基 因(Ampr );e) 將上述菌液搖勻后取100 u 1涂布于含Amp的篩選平板上，正面 向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°0培養(yǎng) 16-24小時。5) 質(zhì)粒的提取質(zhì)粒的提取采用深圳尚能生物科技有限公司的質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒(產(chǎn)品貨號NP1011-100)，按照說明書操作，質(zhì)粒用50 微升水溶解，取l微升做序列分析確證，結(jié)果顯示正確。實施例2抗原制備與動物免疫1.將實施例1所得CD86基因克隆到真核基因表達載體上，如pCDNA3等載 體上1) CD86基因與pCDNA3載體的連接a) 連接混合液50ng的EcoRV限制性內(nèi)切酶消化的pCDNA質(zhì)粒DNA、 200-500ng的平末端CD86或CTLA4 DNA片段、5 P 1的快速連接緩沖液(2 X) 隨后加雙蒸水或MilliQ水至9. 5 " 1、 0. 5 n 1的Rapid T4 DNA連接酶， 總體積10ul;b) 用移液器輕輕吹打混勻或輕微渦懸混勻，室溫離心數(shù)秒，使液 體積聚于管底；c) 室溫孵育5-10分鐘或更長時間，隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。2) 受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E. coliDH5a單菌落，接種于3-5ml LB液體 培養(yǎng)基中，37。C下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期；將該菌懸液以 1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2-3小時至 0D6。。=0. 5左右。3) 感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)a) 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，4。C下3000Xg離 心IO分鐘；b) 棄去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮細 胞，冰上放置15-30分鐘后，4。C下3000Xg離心IO分鐘；c) 棄去上清，加入4ml預冷含15%甘油的0. 05mol/L的CaCl2溶液， 輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液；d) 感受態(tài)細胞分裝成200 li 1的小份，貯存于-7(TC可保存半年。4) 轉(zhuǎn)化a) 從-7(TC冰箱中取200ul感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍， 隨后立即置冰上；b) 加入連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；c) 42。C水浴中熱擊90秒或37。C水浴5分鐘，隨后迅速置于冰上冷 卻3-5分鐘；d) 向管中加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37。C振蕩培 養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基 因(Ampr );e)將上述菌液搖勻后取100 u 1涂布于含Amp的篩選平板上，正面 向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37'C培養(yǎng) 16-24小時。5)質(zhì)粒提取采用深圳尚能生物科技有限公司的質(zhì)粒DNA小量提取試 劑盒(產(chǎn)品貨號NP1011-100)，按照說明書操作，質(zhì)粒用50微升水溶解。2. 轉(zhuǎn)染CHO細胞取3嗎上述步驟1中獲得的質(zhì)粒DNA，與CH0培養(yǎng)基混合至5(V1，取3pl Lipofctamine試劑(Invitrogen)，用CHO細胞培養(yǎng)基稀釋到50nl，混合二者并 在室溫下放置15-30分鐘，然后將混合物緩慢加入已培養(yǎng)48小時的CHO細胞中(3 X106/ral)，輕輕混勻，于37度、含5%(]02的培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，隨后加入G418 至終濃度400 pg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)以選擇陽性細胞。3. 制備5乂107個0086的陽性細胞作為細胞抗原-用500微升PBS溶液懸浮并與等體積弗氏完全佐劑充分混合后，小鼠皮下多 點(每點100-200微升)注射免疫。選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小 鼠，鼠齡在8 12周，雌雄不限。為避免小鼠反應不佳或免疫過程中死亡，同時 免疫3 4只小鼠。免疫間隔2 3周，注射量與初次免疫量相同，共3次，末次 免疫為腹腔注射，3 4天后，分離脾細胞。實施例3細胞融合在50ml沉淀管中混合10s脾細胞和l(f小鼠骨髓瘤細胞S/P20，并加入50m12.5 XFCS — 1640液。室溫400Xg離心3rain，使細胞沉淀，移去上清液。輕敲管底部， 使沉淀流動，把沉淀管放于4(TC水浴中，使其達融合溫度。將預熱至4(TC的50%PEG 0. 8ml經(jīng)lml吸管緩慢滴加入管內(nèi)，邊滴加PEG邊 搖動沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程持續(xù)2rain。加lmll640液，邊 滴加邊搖動沉淀管，持續(xù)lmin，重復兩次。加入RPMI 1640液15ml，室溫，400 Xg離心lmin，使細胞沉淀。去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT (次黃嘌呤(hypoXanthine， H) 10Oumol/L,、氨甲蝶呤(aminopterin， A) 400nmol/L禾口 胸腺嘧啶核苷(thymidine, T) 16uraol/L)的完全1640液。將融合的細胞液滴加 至40孔塑料培養(yǎng)盤中，該培養(yǎng)盤為已于前一日種有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)盤，每孔l滴(約0.05ml)，輕搖后，放入含5%0)2飽和濕度的37°(:溫箱中培育。第3、 6、 9、 10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。輕輕吸取上清液，根據(jù)需 要加入適量的飼養(yǎng)細胞。于第12、 15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每 次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在IO天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。 大多數(shù)雜交瘤細胞在10 20天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在l個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤 細胞出現(xiàn)后，吸取上清液，用斑點雜交的方法檢查抗體的分泌(具體步驟，同如 下實施例8所述)。所述雜交瘤細胞已進行生物材料的保藏，保藏的具體信息如下所述培養(yǎng)物分類命名中國倉鼠卵巢細胞株CHO-YD-86細胞株；保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，簡稱CCTCC);保藏單位地址中國武漢武漢大學(郵編430072);保藏日期2007年11月23日；保藏編號CCTCC一C200743。實施例4抗體的檢測采用流式細胞術(shù)(FACS)檢查分泌抗體的特異性。吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液，用含0. 5%BSA的PBS緩沖液(150ramol/L的 NaCl， 2. 7mmol/L的KCl， 6. 5咖ol/L的Na2HP04， 1. 5mmol/L的KH2P04， pH7. 4)經(jīng) 1: 5、 1: IO和I: 50稀釋，與CHO細胞或表達CD86的CHO細胞室溫孵育30分鐘， PBS洗滌3次，再加l: 200稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育30分鐘， PBS洗滌3次，采用流式細胞儀檢測抗體的結(jié)合情況。如果雜交瘤細胞有分泌抗人CD86的抗體，在FACS結(jié)果圖上可以看到表達目 的基因的CHO細胞與空白CHO細胞存在明顯的峰移。FACS檢測分泌抗體特異性的結(jié)果見圖2。特異性表達CD80和CD86的CHO細 胞用YD-aCD86或CTLA4Ig在冰上結(jié)合30分鐘，洗滌后用FITC標記的抗人IgG 二 抗染色30分鐘，洗滌后用流式細胞儀檢測，可見YD-aCD86特異性結(jié)合表達CD86 的CHO細胞，不結(jié)合表達CD80的CH0細胞。實施例5單克隆抗體的制備與鑒定將實施例4篩選出的陽性細胞株進行抗體制備，采用的是小鼠腹腔接種法， 選用BALB/c小鼠或其親代小鼠。先用降植垸或液體石蠟行小鼠腹腔注射， 一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，接種細胞的數(shù)量為5X10V鼠。接種一周后即 有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5 10ml的腹水。采用葡萄球菌A蛋白親和層析法(GE Healthcare)對抗體進行純化。首先用 鹽析法對抗體進行粗提。1. 鹽析法1) 取10 ml腹水加等體積生理鹽水，于攪拌下逐滴加入兩倍體積的飽和硫酸 銨，硫酸銨的終飽和度為50%;2) 于4。C、 3h以上，使其充分沉淀，離心(3000rpm) 20min，棄上清，以等 體積生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加2倍體積的飽和硫酸銨；3) 置4°C3h以上(此時(NH丄S04的飽和度為33%)，重復上述第二步過程l 2次；末次離心后所得沉淀物為Y-球蛋白，以0.01MPBS (pH7.4)溶解至2ml裝 入透析袋；4) 對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無朋4+為止；5) 取透析袋內(nèi)樣品少許作適當倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計測蛋白2. 親和層析1) 試劑與儀器a) SPA-Sepharose L-4B (pharmacia);b) 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH8. 0) + 0. 02% NaN3;c) 0. lmol/L擰檬酸緩沖液(pH4. 0) + 0. 02% NaN3。2) 步驟a) 用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH8. 0)浸泡SPA-S印haroseCL-4B凝膠15min。 按lg干膠200ml上述緩沖液充分洗漆凝膠(用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌)；b) 裝柱后用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH8. 0)平衡；先于10000g離心除去抗 體硫酸銨粗提物中的雜質(zhì)，必要時用0.22um濾膜過濾，上樣前用lmol/L Tris(pH9. 0)液調(diào)整標本液pH至8. 1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^夜；c) 加樣， 一般按25 30mg IgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)充分淋洗，至到淋洗液0D值為<0. 02;d) 用pH4.0的檸檬酸洗脫液洗脫，流速20ml/h;e) 收集洗脫液測OD值。3.透析結(jié)合的抗體經(jīng)低pH洗脫后，立即加入0.5倍體積的2MTris(pH7.2) 中和，PBS透析過夜，其間更換3次緩沖液。取純化后的抗體，按1:200的比例用完全RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后，與10e5 表達CD86的成熟DC細胞(niDC)(以未成熟的DC細胞作為對照，iDC)室溫孵育 30分鐘，PBS洗滌3次，加熒光標記的二抗(1: 200稀釋的FITC標記的羊抗鼠 IgG)，室溫孵育30分鐘，洗滌3次。用流式細胞儀檢測抗體與抗原的結(jié)合。流式細胞儀檢測單克隆抗體與抗原結(jié)合的結(jié)果見圖2。從圖中可見，YD-CD86 單克隆抗體特異性地結(jié)合表達CD86的CHO細胞，而不能結(jié)合表達CD80的CHO細 胞；CTLA4Ig作為陽性對照，CTLA4Ig可以結(jié)合CD86和CD80。實施例6抗體的蛋白質(zhì)N-端測序取純化后的單克隆抗體10pg，與等體積2XSDS-PAGE電泳緩沖液混合，煮沸 5分鐘，用10y。的SDS-PAGE分離抗體的重鏈和輕鏈。電泳結(jié)束后，用含20%甲醇的 免疫印跡轉(zhuǎn)移緩沖液固定20分鐘(轉(zhuǎn)膜緩沖液甘氨酸2.9g; Tris 5. 8g; SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH20定容至1000ml),同時剪同樣大小的PVDF膜，甲醇 活化后，于去離子水中浸泡5分鐘，隨后于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10分鐘。轉(zhuǎn)膜裝置 從下至上依次按陽極、2層濾紙、PVDF膜、凝膠、2層濾紙、陰極的順序放好，濾 紙、凝膠和膜精確對齊，每一步去除氣泡。接通電源，恒流lmA/cra2，轉(zhuǎn)移1.5小 時。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，用考馬斯藍G250染色后脫色，用新的手術(shù) 刀片切下重鏈和輕鏈條帶，晾干后用保鮮膜包好，-20度保存，用于蛋白N-端測 序。蛋白質(zhì)的N-端序列分析采用ABI公司的LC491型蛋白質(zhì)序列測序系統(tǒng)進行。測序結(jié)果如下CD86抗體重鏈N-端序列為SEQ ID NO. 7D I Q M T Q S P A S I S。 CD86抗體輕鏈N-端序列為SEQ ID NO. 8 V Q L Q Q S G A E L A;實施例7 CD86單克隆抗體重鏈與輕鏈可變區(qū)基因的克隆 根據(jù)實施例6所得的蛋白測序結(jié)果，反推抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)5'-端的序 列并合成相應引物，3'-端引物則選擇重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列，采用RT-PCR的 方法(見實施例1)從CD86雜交瘤細胞的cDNA中分別擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)的基 因并克隆到T-EASY載體中(見實施例2)。所設計的重鏈PCR引物序列為5，-端SEQIDN0.9: gttcaactgcagcagtctggag■3，-端SEQ ID NO. 10: cgaggaaacggtgaccgtg 所設計的輕鏈PCR引物序列為5'-端SEQ ID NO. 11: 5， -gatatccagatgacacag-3，3'-端SEQ ID NO， 12: 5， - cgtttcagctccagcttggtc-3， 經(jīng)DNA序列分析確證為鼠IgG2的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。 重鏈DNA序列SEQ ID NO. 3gcagacaaatcctccagcacagcctacatgcacctcagcagcctgacatctgaggactctgcagtcttttcaccgtttcctcg重鏈蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO. 1:VQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGFTFTDHFIN WVRQRTGQGLEWIGEIYPGTGNAFYSEKFKGKATLT ADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVFFCASPLRSGS H Y W YFDVWGAGTTVTVSS輕鏈DNA序列SEQ ID NO. 4: cgtttceigctccagcttggtcccagcaccgaatgtgagaggagtcccataatgatgttgacagtaataag tcccaaaatcttcaggctgcaggctgttg;atcttcagagaaaactgtgtgcctgatccactgccactgaa tcttgatggcacaccttcagctaaggtttttgceittatagaccaggaggtgaggagtttttccctctttcC3g犯gc agst at ggsggc t ggagsc tgtgtcatct ggst a t c 輕鏈蛋白質(zhì)可變區(qū)序列SEQ ID NO. 2: DIQMTQSPASISASVGETVTITCRASENIYSYLV WYQQKEGKTPHLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQ FSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK實施例8人源化表達載體的構(gòu)建與表達分別將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆到我們構(gòu)建的重鏈和輕鏈表達載體中。1. 構(gòu)建重鏈、輕鏈表達載體(pBS-HV和pBS-LV):pBS-HV:在pBluescript SKII(+)載體中克隆了 CMV啟動子、重鏈信號肽基 因序列、NheI和MluI酶切位點、重鏈衡定區(qū)基因序列和生長激素基因poly(A)加 尾信號；pBS-LV:在pBluescript SKII (+)載體中克隆了 CMV啟動子、輕鏈信號肽基因 序列、DraIII和HindIII酶切位點、輕鏈衡定區(qū)基因序列和生長激素基因poly (A) 加尾信號。2. 克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基因序列采用PCR的方法分別從CD86抗體重鏈和輕鏈基因中克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基 因序列，所采用的引物兩端分別添加與表達載體克隆位點相應的限制性內(nèi)切酶切 位點重鏈為Nhel和MluI，輕鏈為DraIII和HindIII,引物序列如下 重鏈5，-端引物序列(SEQ ID NO: 13):CT力a7C67GTCTTGTCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCTG 重鏈3，-端引物序列(SEQ ID NO: 14) : GT6m(XGAGGAAACGGTGACCGT 輕鏈5，-端引物序列(SEQ ID NO: 15):TG d力7g溫TATCCAGATGACACAGTCT 輕鏈3'-端引物序列(SEQ ID NO: 16 ) : GT^g6T兀GTCCCAGCACCGAATGTGAG3. 將重、輕鏈可變區(qū)基因序列克隆至已構(gòu)建的pBS-HV和pBS-LV載體中 將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，分別克隆到已構(gòu)建的重鏈和輕鏈表達載體(pBS-HV和pBS-LV)。1) 純化將構(gòu)建好的重鏈和輕鏈表達載體分別用限制性內(nèi)切酶NotI， Sacl線 性化并純化分別取10Pg質(zhì)粒DNA，分別加50單位的限制性內(nèi)切酶，50° C消化 5小時后，用QIAGEN公司的QIAquickPCR產(chǎn)物純化試劑盒(貨號28104)純化線 性化的DNA (具體步驟按照試劑盒說明書操作)；2) 共轉(zhuǎn)染取上述線性化的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA各4. 5ug,等量混合后，與 20%量(l)ttg)的含neo基因(neomycin抗性基因)的載體pCDNA共轉(zhuǎn)染CH0細胞(具 體步驟見實施例2); 24小時后添加G418至終濃度40(^g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)10-15天 后，采用有限稀釋法將單一細胞轉(zhuǎn)入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；3) 檢測人源化抗體的表達待上述培養(yǎng)基變黃，吸取上清采用斑點雜交的方 法檢測人源化抗體的表達:用多通道移液器從96孔培養(yǎng)板中每孔取100微升上清， 在96孔點樣器中點樣于PVDF膜上，待液體吸干后，取下PVDF膜，用15ml含5%脫脂奶粉和0. 5%TWEEN-20的PBS緩沖液(PBST)室溫封閉過夜，用PBST輕微洗 滌后，用15ml 1:5000稀釋的HRP標記的兔抗人IgG室溫孵育l小時，PBST洗滌 3X15分鐘，每次200ml，取DAB藥片一片，用25mlPBS溶解后，加過氧化 氫，將PVDF膜浸入此溶液中顯色10-30分鐘，用PBS (見實施例l)洗滌。檢測 結(jié)果見圖5:免疫斑點印跡檢測人源化CD86抗體在CH0細胞中的表達。其中，泳 道l是克隆l，泳道2是克隆2，泳道3是陽性對照，泳道4是陰性對照。結(jié)果顯 示多個孔有抗體的表達，選擇抗體表達濃度高的克隆2擴大培養(yǎng)以純化抗體。實施例9抗體的純化與鑒定將實施例8獲得的待培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)移到1升的轉(zhuǎn)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)7天至培養(yǎng)基變 黃，離心棄上清，細胞用l升含200Mg/mlG418的新鮮培養(yǎng)基重懸，在轉(zhuǎn)瓶中繼續(xù) 培養(yǎng)7-IO天，離心取上清，用0.22um過濾器過濾后，4。C保存。將獲得的培養(yǎng)液濃縮至100ml,采用蛋白G親和層析柱進行純化。經(jīng)0. lmol/L PH8. 0磷酸緩沖液充分平衡親和層析柱后，用pH2. 7的0. 1M檸檬酸溶液洗脫抗體， 用2倍體積的2M Tris (pH7. 2)中和洗脫液，然后用1升PBS緩沖液(見實施例 l)透析過夜，中間換液3次?；厥胀肝龊蟮目贵w并用紫外分光光度計測定抗體濃 度，并經(jīng)SDS-PAGE檢測純度。經(jīng)測定，抗體的濃度為68(mg/ml。SDS-PAGE的結(jié)果見圖3。其中，泳道l為人IgG對照，泳道2、 3為純化的 YD-aCD86抗體，泳道4為蛋白質(zhì)分子量標準。從圖3可以看出，CD86的純度均很 高，達到99%。實施例10人源化CD86抗體抑制樹突狀細胞對T細胞的激活1. 細胞培養(yǎng)將分離的人樹突狀細胞培養(yǎng)在200iil含10y。FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，與此 同時加入1X1()5CD4+T細胞，比率為1:10和1:50 DC:T細胞。培養(yǎng)基中同時加入 (或不加)10 Pg/ml的人源化抗CD86抗體，于37。C、含有5%(:02培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 天。在最后16小時，加入終濃度為1Wi/孔的[3H]標記的胸腺嘧啶。收集細胞， PBS (見實施例1)洗滌三次。2. 提取細胞基因組DNA:1) 儀器高速冷凍離心機、臺式離心機、恒溫水浴、低溫冰箱或冰柜、冷凍 真空干燥器、取液器、電泳儀、水平電泳槽、紫外觀測儀；2) 試劑:細胞裂解液(lOOmMTris-HC1、 5mM EDTA、 500raMNaCl、 1% SDS (pH 7.5));飽和酚；氯仿/異戊醇；異丙醇；70%及無水乙醇；3M NaAC (pH5.2); RNA 酶；TAE緩沖液；載樣緩沖液；3) 步驟取動植物材料10g (鮮組織)或0.5g (干凍組織)于液氮環(huán)境中研 碎，加入65'C預熱的含有l(wèi)/10體積酚的10ml裂解液、等體積氯仿，于65t:放置 30分鐘，間隔5-IO分鐘輕搖一次；離心(12000-15000rpm， 15min )取上清，靜 止后加入0. 6體積冷異丙醇、0. 1體積3M乙酸鈉(pH5.2)，混勻，挑取絮狀體， 用70%冷乙醇洗滌，隨后真空干燥；加入2ral TE (或水)、1(H4 RNase，于65°C 反應10-30分鐘去除RNA;加入等體積酚/氯仿進行氯仿抽提輕輕混勻，于冰浴 沉淀5分鐘，5000rpm離心5分鐘，取上清；加入2體積無水乙醇、1/10體積乙 酸鈉，于冰浴30分鐘，隨后于10000 rpm離心10分鐘；取沉淀，用70%冷乙醇洗 滌，隨后真空干燥；所得干粉于-2(TC保存，或復溶于0.5-lml TE或水中，分裝 成小體積，于-2(TC或4'C保存。3.檢測DNA合成采用液體閃爍記數(shù)的方法1) 試劑與儀器閃爍液5g的PP0、 25g的P0P0P，溶于IOOO raL二甲苯中； 液體閃爍計數(shù)器FJ-2107G，西安二六二廠；2) 步驟取10 UL純化的基因組DNA，分別加水稀釋成l、 2、 10、 20、 100 倍，各取30 nL，加閃爍液5 raL，置于玻璃閃爍瓶中，測量樣品的每分鐘計數(shù) (cpm)。 T細胞的增殖以[3H]摻入量來計算，如果細胞有增殖，則DNA合成增加， [3H]摻入量則增加。3) 結(jié)果液體閃爍記數(shù)結(jié)果見圖4。圖4a是YD-aCD86抑制培養(yǎng)的DC細胞對T細胞的激活作用T細胞與DCs細 胞在抗-CD86 (YD-aCD86)或抗-CD80 (對照)存在的條件下共培養(yǎng)6天，然后用卩H] 標記的胸腺嘧啶做[3H]摻入實驗檢測T細胞的增殖。1:10和1:50為T細胞和DC 細胞的比率。從圖中可以看出，經(jīng)人源化改造后，CD86抗體仍具有很高的抑制T 細胞激活的能力。圖4bl表示YD-aCD86特異性抑制表達CD86的CHO細胞對T細胞增殖的作用； 圖4b2表示YD-aCD86不能抑制表達CD80的CHO細胞對T細胞增殖的作用。序列表<110〉<120>抗CD86人源化單克隆抗體〈130〉 CN081023〈160〉 16〈170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211〉 121〈212> PRT <213>人工合成〈400〉 1Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser15 10 15Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His Phe20 25 30lie Asn Trp Val Arg Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly35 40 45Glu lie Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Glu Lys Phe Lys50 55 60Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys Ala85 90 95Ser Pro Leu Arg Ser Gly Ser His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120兵 曉小勇冬盧鄭馮〈210> 2<211〉 107<212> PRT 〈213〉人工合成■〉 2Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser lie Ser Ala Ser Val Gly15 10 15Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr20 25 30Leu Val Trp Tyr Gin Gin Lys Glu Gly Lys Thr Pro His I>eu Leu Val35 40 45Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Gly Thr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 'Lys 100 105<210〉 3<211〉 363〈212〉 DNA <213〉人工合成<400〉 3gttcaactgc agcagtctgg agctgaactg tgcaaggctt ctggcttcac cttcactgac ggtcagggcc ttgagtggat tggagagatt gagaagttca agggcaaggc cacactgact cacctcagca gcctgacatc tgaggactct tccggtagtc actactggta cttcgatgtc teggcgaggcccg gggcttcagt gaagctgtcc 60C3ctttataa sctgggtgag gesgaggact 120tatcctggaa ctggtaatgc tttctacagt 180gcagacaaat cctccagcac agectacatg 240gcagtctttt tctgtgcaag tcccctgcgc' 300tggggcgcsg ggaccacggt caccgtttcc 360363<formula>formula see original document page 21</formula>〈400> 7Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser lie Ser 1 5 10〈210> 8<211> 11〈212〉 PRT <213>人工合成〈400〉 8Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala 1 5 10〈210〉 9<211〉 22〈212> 腿 <213〉人工合成〈400〉 9gttcaactgc agcagtctgg ag 2.2〈210〉 10〈211〉 19<212〉 DNA <213〉人工合成〈400〉 10cg郷a朋cg gtgsccgtg 19〈210〉 11〈211〉 18<212> DNA 〈213〉人工合成〈柳> 11gatatccaga tgacacag 18<210> 12〈211> 21〈212〉 DNA 〈213>人工合成〈400> 12cgtttcagct ccagcttggt c 21〈210〉 13〈211〉 39〈212〉 腿 <213>人工合成〈400〉 13ctacgcgtgt cttgtcccag gttcaactgc agcagtctg 39〈210〉 14〈211> 26〈212> DNA 〈213>人工合成〈400〉 14gtgctsigccg SLggaaeicggt gaccgt 26〈210〉 15〈211〉 31〈212〉 DNA 〈213〉人工合成〈400〉 15tgcacgatgt gatatccaga tgacacagtc t31<210> 16〈211〉 29 〈212〉腿 〈213〉人工合成〈400> 1權(quán)利要求
1.一種CD86人源化單克隆抗體，包括小鼠來源的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及人源的抗體恒定區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)是序列表中SEQ ID NO1所示序列，所述輕鏈可變區(qū)是序列表中SEQ ID NO2所示序列。
2. —種DNA分子，其特征在于，是序列表中SEQ ID N0:3所示序列。
3. —種DNA分子，其特征在于，是序列表中SEQ ID N0:4所示序列。
4. 一種載體，其特征在于包含序列表中SEQ ID N0:3所示序列和/或序列表中 SEQ ID NO :4所示序列。
5. —種轉(zhuǎn)染方法，其特征在于將權(quán)利要求4所述載體和一種帶有抗性篩選 基因的載體共轉(zhuǎn)染宿主細胞。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗性篩選基因是neomycin抗性基因。
7. —種宿主細胞，其特征在于包含權(quán)利要求4所述載體。
8. 如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征還在于所述宿主細胞選自大腸桿菌、 酵母菌、昆蟲細胞、CH0細胞和C0S細胞。
9. 權(quán)利要求1所述的CD86人源化單克隆抗體在制備預防或治療自身免疫性疾 病或抑制移植物排異反應的藥物上的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種CD86人源化單克隆抗體，其相關(guān)基因序列和表達系統(tǒng)。本發(fā)明提供的單克隆抗體大大減少了鼠單克隆抗體的免疫原性，實現(xiàn)了其在工程細胞(如CHO細胞)中的無血清培養(yǎng)基高表達，且表達產(chǎn)物生物活性高，可以應用于自身免疫性疾病和抑制器官移植后宿主排異反應藥物的制備上。
文檔編號A61K39/395GK101274963SQ20081004316
公開日2008年10月1日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者馮冬曉, 盧小兵, 勇 鄭 申請人:盧小兵;鄭 勇;馮冬曉