專利名稱：一種抗人凝血因子Ⅶ單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種抗人凝血因子VII單克隆 抗體及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
傷口的凝血，在人凝血因子VII與組織因子形成復(fù)合物后啟動(dòng)。該復(fù)合物可以激 活凝血因子X成為Xa，凝血因子IX變成IXa。Xa和其他因子形成復(fù)合物，將凝血酶原轉(zhuǎn) 化為凝血酶，凝血酶通過最終將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白從而形成血纖蛋白凝塊，誘導(dǎo) 局部止血[Robert H, et al, Molecular biology andbiochemistry of the coagulation factors and pathways of haemostasis. William's Hematology, 2001 :1409-1434]。人凝 血因子VII可用于凝血因子VIII或IX的抑制物> 5BU的先天性血友病患者、預(yù)計(jì)對(duì)注射 凝血因子VIII或凝血因子IX、具有高記憶應(yīng)答的先天性血友病患者、獲得性血友病患者、 先天性FVII缺乏癥患者和具有GP II b-IIIa和/或HLA抗體和既往或現(xiàn)在對(duì)血小板輸注 無效或不佳的血小板無力癥患者，也可用于在外科手術(shù)過程中或有創(chuàng)操作中的出血。人凝血因子VII的抗體可用于人凝血因子VII的分離純化和含量檢測(cè)。然而，目 前現(xiàn)有的抗體尚難以令人滿意，故尚缺特異性強(qiáng)的檢測(cè)人凝血因子VII的有效方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高特異性和高親和力的抗人凝血因子VII單克隆抗 體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供了一種高特異性和高親和力的抗人凝血因子VII單克隆抗體， 及其制法和用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測(cè)人人凝血因子VII的試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗人凝血因子VII的單克隆抗體，它特異性地 結(jié)合于人凝血因子VII。在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的針對(duì)人凝血因子VII的效價(jià)大于20000。在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的針對(duì)人凝血因子VII的效價(jià)大于25600。在另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體是IgG類型。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合 于人凝血因子VII的本發(fā)明第一方面中的單克隆抗體和選自下組的偶聯(lián)部分可檢測(cè)信 號(hào)、藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明第一方面中所述的單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測(cè)人凝血因子VII的試劑盒，它含有本發(fā)明 第一方面中所述的單克隆抗體或本發(fā)明第二方面中所述的免疫偶聯(lián)物。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面中所述的單克隆抗體的用途，它被
3用于制備檢測(cè)人凝血因子VII的試劑盒或試劑。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。例如，就某一大范圍 (如10-100)的上限可以與另一優(yōu)選的較小范圍(如20-80)的下限20進(jìn)行組合，從而構(gòu)成 另一范圍(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過多年深入的研究，研制成功一種雜交瘤單克隆抗體，即抗人凝血因 子VII的單克隆抗體F7-2。具體地，本發(fā)明以人凝血因子VII為免疫抗原免疫Balb/C小 鼠，將小鼠的致敏脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)ELISA篩選和有限 稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔產(chǎn)生單克隆抗體。本發(fā)明的單 克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可用于人凝血因子VII的分離純化和酶聯(lián)免疫 吸附分析法(ELISA)等。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了 具有抗人凝血因子VII的單抗的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體、 具有抗人凝血因子VII的單抗可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋 白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈 和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)， 只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95% 同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括可檢測(cè)信號(hào)(如熒光 分子)、藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗人凝 血因子VII的單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與抗人凝血因子VII的 單抗或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。如本文所用，“免疫毒素”指對(duì)靶細(xì)胞有特異性親和力和殺傷力的物質(zhì)，例如免疫 偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治療分 子與抗人凝血因子VII的單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。以本發(fā)明的單抗F7-2為 例，具體的例子有例如131I-F7-2偶聯(lián)物等。對(duì)于本發(fā)明抗人凝血因子VII的單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。 抗人凝血因子VII的單抗V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydetermining region,CDR)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些 具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗人凝血因子VII的單 抗⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab’ )2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠 抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明還提供了編碼人凝血因子VII標(biāo)志性抗原的cDNA。本發(fā)明的抗人凝血因 子VII的單抗的抗原的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合 成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)人凝血因子VII標(biāo)志性抗原的核苷酸序列，尤其是 開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片 段按正確次序拼接在一起。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以 如上用常規(guī)技術(shù)，利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在 一起，形成單鏈抗體。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通 過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生 物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載 體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì) 菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、C0S7、293細(xì)胞、或 Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、 用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過 濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法 的結(jié)合。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人凝血因子VII的試劑盒，它含有上述的單克隆 抗體或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明人篩選到6株高特異性和高親和力的雜交瘤細(xì)胞 株，是骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與產(chǎn)生人凝血因子VII抗體的Balb/c小鼠B淋巴細(xì)胞融合后篩選 獲得的細(xì)胞株，所述B淋巴細(xì)胞來自于人凝血因子VII免疫的Balb/c小鼠。該單克隆抗 體是由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的，具有對(duì)人凝血因子VII特異性結(jié)合的特點(diǎn)，屬于IgG類
5抗體，最高效價(jià)達(dá)到25600 (單克隆抗體F7-2)。所述的單克隆抗體是將雜交瘤細(xì)胞株接種 Balb/c小鼠腹腔后，從產(chǎn)生的腹水中純化獲得的免疫球蛋白。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明的抗凝血因子VII的單抗具有非常高特異性和極高的親和力。(b)本發(fā)明的抗凝血因子VII的單抗適用于定性和定量檢測(cè)人凝血因子VII的酶 聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)方法并可以用于人凝血因子VII的純化過程。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如 Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例材料(1)抗原重組人凝血因子VII，Novo Nordisk公司產(chǎn)品，純度大于95%;Sp2/0細(xì) 胞株，購自ATCC ；DNEM培養(yǎng)基，Gibco公司；HAT，Gibco公司；HT，購自Gibco公司；胎牛血 清，購自Gibco ；Balb/c小鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；PEG4000，Sigma公司；福氏佐 劑，Sigma公司；HRP標(biāo)記抗小鼠IgG，Sigma公司；TMB顯色液，MBI公司。(2)試驗(yàn)材料和設(shè)備96孔板(NUNC，USA)；酶標(biāo)版(COASTAR，USA)，C02培養(yǎng)箱 (Thermo-fisher公司)；導(dǎo)致顯微鏡(Nicon公司)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)；超凈工作臺(tái) (蘇州凈化設(shè)備廠)等。實(shí)施例1 單克隆抗體的制備(1)免疫動(dòng)物第1天，抗原50 μ g/只，0. 25ml抗原+0. 25ml完全福氏佐劑/只，攪拌機(jī)6000轉(zhuǎn) /分10分鐘，充分混勻，皮下多點(diǎn)注射，5只小鼠/抗原；第28天，抗原50 μ g/只，0. 25ml抗 原+0. 25ml不完全福氏佐劑/只，攪拌機(jī)6000轉(zhuǎn)/分10分鐘，充分混勻，皮下多點(diǎn)注射，5 只小鼠/抗原；第60天，抗原50 μ g/只，0. 25ml抗原+0. 25ml不完全福氏佐劑/只，攪拌機(jī) 6000轉(zhuǎn)/分10分鐘，充分混勻，皮下多點(diǎn)注射，5只小鼠/抗原；第90天，抗原50 μ g/只， 0. 25ml抗原+0. 25ml不完全福氏佐劑/只，攪拌機(jī)6000轉(zhuǎn)/分10分鐘，充分混勻，皮下多 點(diǎn)注射，5只小鼠/抗原。融合前4天，腹腔注射抗原30 μ g/只.(2)細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備1)細(xì)胞的復(fù)蘇將凍存在液氮中的細(xì)胞管取出，放入37°C水浴中，使迅速融化將 細(xì)胞轉(zhuǎn)移入IOml離心管內(nèi)，加入10ml DMEM含15%胎牛血清，離心IOOOrpm/分10分鐘，棄 上清，加入5ml的DMEM含15%胎牛血清，轉(zhuǎn)移入75cm的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2)在細(xì)胞融合前一周，復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞sp2/0，并擴(kuò)增傳代，保持良好的細(xì)胞活 力，用0.5%苔朌藍(lán)染色，用顯微鏡計(jì)數(shù)，透亮不著色的活細(xì)胞應(yīng)在90%以上。
飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1)取BALB/C小鼠3-5只，用勁椎脫位處死后，浸泡在75%酒精或1 1000新潔 而滅溶液中5分鐘。2)取出小鼠固定在蠟板上，使腹部朝上，用無菌剪刀在小鼠腹部皮膚剪一小口，注 意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外溢。進(jìn)而剝離腹部皮膚，暴露腹膜，用滅菌注射器將DMEM培 養(yǎng)液5ml注入腹腔中，右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，另一手輕輕按摩腹腔約1-2 分鐘。3)用原注射器抽取腹腔內(nèi)液體，每只約可得4_4.5ml，注入50ml離心管中。用含 1 % HAT 15%胎牛血清的DMEM補(bǔ)滿至IOOml (2管)。搖勻，放入96孔細(xì)胞板中，每孔100 μ 1 37°C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。免疫小鼠脾臟的制備1)免疫小鼠眼眶放血，脫頸處死，放入75%的酒精中消毒，2)無菌的條件下，分離脾臟，制備脾臟細(xì)胞，約1 X IO8個(gè)。細(xì)胞融合1)取sp2/0細(xì)胞1 X IO7個(gè)放入50ml離心管中離心IOOOrpm/分10分鐘，棄上清， 加入 5ml DMEM。2)脾臟細(xì)胞，約1 X IO8個(gè)放入50ml離心管中離心IOOOrpm/分10分鐘，棄上清， 加入 5ml DMEM。3)用移液管分別加入sp2/0細(xì)胞和脾臟細(xì)胞，放入50ml離心管中充分混合，離心 IOOOrpm/分10分鐘，棄上清。4)加入融合劑PEG 0. 7ml 一分鐘加完，靜止90秒，加入DMEM 40ml離心IOOOrpm/ 分10分鐘，棄上清。5)加入DMEM含15 %胎牛血清1 % HAT的培養(yǎng)基IOOml混合均勻；6)放入96孔細(xì)胞板中(含飼養(yǎng)細(xì)胞)，每孔100 μ 1 37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞篩選用間接ELISA法篩選融合細(xì)胞。1)用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至10 μ g/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔100 μ 1，置 入4 °C冰箱過夜。2)用ρΗ7· 2-7. 4的PBS (含0. 05%吐溫20)洗滌5次，拍干，加入5%的脫脂奶粉 溶液(PBST配制)每孔2001。放入37°C烘箱2小時(shí)。3)拍干。加入樣品每孔100 μ 1，放入37°C烘箱1小時(shí)。4)用 ρΗ7· 2-7. 4 的 PBS (含 0. 05% 吐溫 20)洗滌 5 次，拍干。5)加入酶標(biāo)記抗體每孔100 μ 1，放入37°C烘箱1小時(shí)。6)用 ρΗ7· 2-7. 4 的 PBS (含 0. 05% 吐溫 20)洗滌 5 次，拍干。7)加入底物TMB顯色，每孔100 μ 1，室溫放置5min。8)加入2mol/L的硫酸每孔50 μ 1終止。9)酶標(biāo)儀450nm/630nm雙波長讀數(shù)。10)取強(qiáng)陽性孔進(jìn)行克隆。細(xì)胞克隆
7
1)先制備飼養(yǎng)細(xì)胞方法同上。2)用100 μ 1移液槍將待克隆化細(xì)胞孔中的細(xì)胞輕輕吹起，用顯微鏡計(jì)數(shù)3)將待克隆的細(xì)胞根據(jù)計(jì)數(shù)稀釋為100個(gè)/ml，共稀釋10ml，加入已制備飼養(yǎng)細(xì)胞 的96孔細(xì)胞板中，每孔100 μ 1。4)第一次克隆用含15%胎牛血清HT的DMEM稀釋細(xì)胞。5)篩選出的陽性孔連續(xù)克隆3次，第二第三次用含15%胎牛血清的DMEM稀釋細(xì) 胞。6)第一次克隆獲得7個(gè)陽性克??；第二次克隆獲得3個(gè)陽性克??；第三次克隆最 終獲得6株雜交瘤細(xì)胞。7) 6株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞Α:>12800雜交瘤細(xì)胞B > 25600雜交瘤細(xì)胞C > 12800雜交瘤細(xì)胞D :> 12800雜交瘤細(xì)胞E > 25600雜交瘤細(xì)胞F > 12800雜交瘤細(xì)胞A-F都被挑選出用于后續(xù)試驗(yàn)。其中效價(jià)最高的雜交瘤細(xì)胞B并重新 命名為F7-2。將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞F7-2克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為 滋養(yǎng)細(xì)胞)。經(jīng)過2-3輪克隆化培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的能夠產(chǎn)生高效價(jià)單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆。 將雜交瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。細(xì)胞擴(kuò)增1)將擴(kuò)增的細(xì)胞用100 μ 1的移液槍輕輕吹起，移入24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板擴(kuò)增2) 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板長滿后移至25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中3) 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶長滿后移至75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞凍存1)收取生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，加入50ml離心管中，IOOOrpm/分鐘10分鐘，
棄上清2)沉淀用90%胎牛血清10% DMSO的凍存液將細(xì)胞調(diào)整為106/ml3)將細(xì)胞懸液放入凍存管內(nèi)，每管1ml，放入塑料泡沫盒中-80°C過夜4)把-80°C細(xì)胞放入液氮中，同時(shí)記錄放置位置及只數(shù)。(3)腹水制備1)小鼠預(yù)處理接種雜交瘤細(xì)胞前10天小鼠腹腔注射液體石蠟油0. 5ml/只2)每只小鼠腹腔注射0. 8-1. OX IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞3)接種雜交瘤細(xì)胞后約8-10天小鼠腹部明顯脹大。4)脫頸處死小鼠，取腹水，IOOOrpm離心30min，取上清，分裝_20°C保存實(shí)施例2 抗體的純化和檢測(cè)6株雜交瘤細(xì)胞制備腹水，用商品化ProteinA純化，操作方法參照其使用說明，結(jié) 果獲得純化的單抗。
純化抗體后進(jìn)行結(jié)合特異性和親和力測(cè)試，結(jié)果表明，6種單抗的特異性和親和力 都很好，尤其是單抗F7-2的特異性和親和力最佳，比其他一般單抗(如雜交瘤細(xì)胞D產(chǎn)生 的單抗)高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種抗人凝血因子VII的單克隆抗體，其特征在于，它特異性地結(jié)合于人凝血因子VII。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的針對(duì)人凝血因子 VII的效價(jià)大于20000。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的針對(duì)人凝血因子 VII的效價(jià)大于25600。
4.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體是IgG類型。
5.一種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合于人凝血因子VII 的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體和選自下組的偶聯(lián)部分可檢測(cè)信號(hào)、藥物、毒素、細(xì)胞因 子、放射性核素、酶。
6.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
7.—種檢測(cè)人凝血因子VII的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗 體或權(quán)利要求5所述的免疫偶聯(lián)物。
8.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)人凝血因子VII 的試劑盒或試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人凝血因子VII單克隆抗體及其制備方法和用途。該單克隆抗體具有與人凝血因子VII抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的單克隆抗體片段和免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人凝血因子VII的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C07K16/36GK101906161SQ20091005258
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者盛澤林 申請(qǐng)人:蘇州澤璟生物制藥有限公司