抗butyrophilin-3人源化抗體及其使用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)和人源化抗體研究領(lǐng)域。本發(fā)明涉及對人butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)的抗原決定簇具有特異性識別的人源化抗體分子和包含所述抗體分子及其片段的組合物。本發(fā)明還涉及人源化抗butyrophilin-3抗體在治療各種疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]人的butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)基因家族位于6號染色體MHC I類分子基因簇的延伸端，最初稱為MHC相關(guān)基因。Butyrophilin-3家族包含三個成員:BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3。Butyrophilin-3基因在小鼠上缺失。Butyrophilin-3蛋白是單次穿膜蛋白，其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)屬于免疫球蛋白超基因家族，包含有一個N端的IgV樣結(jié)構(gòu)域，和一個近膜端的IgC樣結(jié)構(gòu)域。BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3的胞外區(qū)氨基酸組成上高度同源，其中IgV樣結(jié)構(gòu)域的同源性達(dá)99-100%。因此,針對IgV樣結(jié)構(gòu)域的抗butyrophilin-3抗體通常能同時識別BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3，因此它是抗-BTN3A1人源化抗體、抗-BTN3A2人源化抗體和抗-BTN3A3人源化抗體的總稱。
[0003]BTN3A1表達(dá)于人類各種腫瘤細(xì)胞膜表面，如非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞肝癌、胃癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、急性原髓樣白血病、慢性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、紅白血病、骨髓瘤細(xì)胞、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤等。
[0004]針對腫瘤細(xì)胞膜表面BTN3A1的抗體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞微管蛋白的解聚。因此開發(fā)一種人源化抗butyrophilin-3抗體能夠有效地治療多種腫瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是基于所獲得的一株具有與人butyrophilin-3蛋白特異性結(jié)合的親本抗人butyrophilin-3鼠單克隆抗體6D9,通過克隆、鑒定與基因結(jié)構(gòu)的分析,確定了其⑶R區(qū)序列，構(gòu)建了相應(yīng)的人源化抗體及其真核細(xì)胞表達(dá)載體，并獲得了表達(dá)并分泌該抗人butyrophilin 3人源化抗體的細(xì)胞株,生產(chǎn)純化了該人源化抗體。
[0006]本發(fā)明研發(fā)了針對butyrophilin-3蛋白IgV樣結(jié)構(gòu)域的人源化抗體，命名為Xylizumab (再力助單抗)，發(fā)現(xiàn)Xylizumab能夠識別BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3三個蛋白，其結(jié)合的表位位于butyrophilin 3蛋白IgV樣結(jié)構(gòu)域。
[0007]Xylizumab能夠抑制20種人類腫瘤細(xì)胞系的生長，這些細(xì)胞系覆蓋了上皮來源的癌癥細(xì)胞如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(Calu-Ι)、肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系(Huh7，HepG2)、胃癌細(xì)胞系(MGC80-3)、胰腺腺癌細(xì)胞系(PANC-1, BxPC-3, CFPAC-1)、乳腺癌細(xì)胞系(SKBR3)、卵巢癌細(xì)胞系(SK0V3)、宮頸癌細(xì)胞系(HeLa);血液系統(tǒng)腫瘤，如急性原髓樣白血病細(xì)胞系(HL-60, NB4)、慢性髓樣白血病細(xì)胞系(K-562)、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(U266，KM3)、紅白血病細(xì)胞系(HEL);肉瘤，如骨髓瘤細(xì)胞系(U-2 OS, MNNG/H0S)、滑膜肉瘤細(xì)胞系(SW982)、軟骨肉瘤細(xì)胞系(SW1353)。但它對正常細(xì)胞系HFLl沒有表現(xiàn)出抑制作用。Xylizumab能夠誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡，這種現(xiàn)象對于HL-60細(xì)胞特別明顯，并且Xylizumab能夠完全抑制HL-60的生長。
[0008]Xylizumab介導(dǎo)的腫瘤生長抑制是通過抗體與細(xì)胞膜上的BTN3A1結(jié)合后，來向胞內(nèi)傳遞生長抑制信號的。Xylizumab在正常濃度10ug/ml的水平下就能發(fā)揮抑制效應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)體系中濃度增加至500ug/ml的時候,它能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)微管蛋白解聚。
[0009]動物實驗顯示Xylizumab能夠減緩移植性肝癌IfepG2和移植性骨肉瘤MNNG/HOS的生長，延長裸鼠的生存期。
[0010]另外，這個抗體能夠抑制骨髓來源的原代急性髓性白血病M3和M4的細(xì)胞克隆形成，這說明該抗體能夠治療某些原代血液系統(tǒng)腫瘤。
[0011]由于BTN3A1廣泛表達(dá)于幾乎所有類型腫瘤細(xì)胞系中，所以BTN3A1能夠做為不同類型腫瘤的共同革G標(biāo)。Xylizumab能夠通過與細(xì)胞膜上的BTN3A1結(jié)合來介導(dǎo)胞內(nèi)微管解聚，這項功能的發(fā)現(xiàn)豐富了我們對抗體功能的認(rèn)識，也拓展了抗體的應(yīng)用范圍。利用抗體的這一新功能，可以動態(tài)可逆地調(diào)節(jié)微管的聚合，并且以這個抗體為基礎(chǔ)的免疫治療也會具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0012]因此，本發(fā)明主要涉及了以下幾個方面:
第一方面，本發(fā)明涉及一種抗人butyrophi I in-3人源化抗體,其中所述人源化抗體由含有3個輕鏈可變區(qū)的輕鏈和含有3個重鏈可變區(qū)的重鏈組成，其中所述3個輕鏈可變區(qū)CDR 的氨基酸序列為 QSLSDN (SEQ ID NO:1)、FAS (SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ IDNO:3)，重鏈可變區(qū) CDR 的氨基酸序列為 GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。本領(lǐng)域公知，抗體的結(jié)合特異性及親合力均主要由CDR序列決定，根據(jù)成熟、公知的現(xiàn)有各項技術(shù)可輕易地將非CDR區(qū)域的氨基酸序列改變而獲得具有相類似的生物活性的變體。本發(fā)明涉及的具有與上述CDR序列完全相同的CDR序列的單克隆抗體變體，因其具有與本發(fā)明所述的人源化抗體完全相同的CDR序列，因此具有相類似的生物活性。
[0013]第二方面,本發(fā)明涉及抗人butyrophilin-3人源化抗體的片段,其中該片段選自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、SCFv和抗體最小識別單位組成的組。并且該片段包含了 3個輕鏈可變區(qū)的⑶R和3個重鏈可變區(qū)的⑶R，其輕鏈可變區(qū)⑶R氨基酸序列為QSLSDN (SEQID NO:I) ,FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重鏈可變區(qū) CDR 序列為GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和 ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。
[0014]第三方面，本發(fā)明涉及一種治療疾病的方法，其中所述疾病選自由以下組成的組:腫瘤，如:骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤、甲狀腺髓樣癌(MTC)、結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、肝癌、胃癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸部癌、膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌、血液系統(tǒng)腫瘤、淋巴系統(tǒng)腫瘤、胸腺瘤、黑素瘤等；自身免疫性疾病，如:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性血管炎、自身免疫性肝病、天皰瘡、硬皮病、皮肌炎、混合性結(jié)締組織病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺自身免疫病、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏病、銀屑病、干燥性綜合癥、惡性貧血、新生兒溶血、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、重癥肌無力、結(jié)節(jié)性多動脈炎、Wegener肉芽腫病、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎等；免疫排斥性疾病，如宿主抗移植物反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)、輸血相關(guān)性移植物抗宿主病、 過敏性反應(yīng)等。
【附圖說明】
圖1a是采用ELISA方法證實抗-butyrophilin-3人源化抗體Xylizumab識別從CHO細(xì)胞表達(dá)純化的BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。b是采用ELISA方法證實抗-butyrophi I in_3人源化抗體Xylizumab識別的抗原決定簇位于butyrophilin-3蛋白的Ig V結(jié)構(gòu)域。由于butyrophilin-3蛋白的Ig V結(jié)構(gòu)高度同源，因此Xylizumab能夠同時識別BTN3A1、BTN3A2和 BTN3A3。
圖2是Xylizumab抑制裸鼠移植性肝細(xì)胞肝癌IfepG2的生長。
圖3是Xylizumab抑制裸鼠移植性骨肉瘤MNNG/H0S的生長。
圖4是Xylizumab延長移植性肝細(xì)胞肝癌HepG2荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=14.36, P<, 0.001)。
圖5是Xylizumab延長移植性骨肉瘤MNNG/H0S荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=12.67, P<, 0.001)。
【主權(quán)項】
1.一種組合物，其包括包含輕鏈可變區(qū)⑶R(互補(bǔ)決定區(qū))序列QSLSDN (SEQ IDNO:1)、FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重鏈可變區(qū) CDR 序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:4)、ISSGGNYS(SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)的人源化抗-butyrophilin-3抗體、單鏈抗體或其抗體片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗butyrophilin-3人源化抗體包含人抗體IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定區(qū)的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗體片段選自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和抗體最小識別單位組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中抗-butyrophilin-3人源化抗體或其片段是裸抗體或其片段。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述人源化抗-butyrophilin-3抗體與butyrophilin 3A1 (BTN3A1), butyrophilin 3A2 (BTN3A2), butyrophilin 3A3 (BTN3A3)彡口口。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述,抗-butyrophilin-3人源化抗體是抗-BTN3A1人源化抗體、抗-BTN3A2人源化抗體和抗-BTN3A3人源化抗體的總稱。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗-butyrophilin-3人源化抗體或其片段與至少一種診斷劑和/或治療劑偶聯(lián)以形成免疫偶聯(lián)物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述治療劑選自由以下組成的組:裸抗體、細(xì)胞毒素劑、藥物、放射性核素、硼原子、免疫調(diào)節(jié)劑、光敏性治療劑、免疫偶聯(lián)物、寡核苷酸和激素。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述細(xì)胞毒素劑是藥物或毒素。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述藥物具有選自由抗有絲分裂、烷基化、抗代謝、抗血管生成、細(xì)胞凋亡、生物堿、C0X-2抑制劑和抗生素劑組成的組的藥物性質(zhì)。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述藥物選自由以下組成的組:氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位絡(luò)合物、長春花生物堿、經(jīng)取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、拮抗劑、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、喜樹堿、奧沙利鉬和阿霉素。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述藥物選自由以下組成的組:5_氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽環(huán)霉素、苯達(dá)莫司汀、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜樹堿、卡鉬、10-羥基喜樹堿、亞硝脲氮芥、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、C0X-2抑制劑、伊立替(CPT-1l)、SN-38、卡鉬、克拉屈濱、喜樹堿、環(huán)磷酰胺