一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，包括以下組分：包被羊抗鼠多克隆抗體的酶標(biāo)板；鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物；鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品；清洗液；分析液；增強(qiáng)液。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了該試劑盒的制備方法及其在定量檢測(cè)鼠源抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明解決了“免疫診斷技術(shù)中定量檢測(cè)未有效包被到固體載體上的鼠源抗體濃度，從而計(jì)算有效包被到固體載體上的抗體包被率，以評(píng)估包被效果”的技術(shù)難題，該試劑盒能夠定量檢測(cè)鼠源抗體，具有檢測(cè)靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，操作流程短，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，尤其涉及一種檢測(cè)鼠源抗體時(shí)間分辨 免疫熒光試劑盒；此外，本發(fā)明還涉及該檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的制備 方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，免疫診斷方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的研究，免疫診斷技術(shù) 主要有以下幾種類型：熒光標(biāo)記免疫技術(shù)、同位素標(biāo)記免疫技術(shù)、酶標(biāo)記免疫技術(shù)、膠體金 標(biāo)記免疫技術(shù)和發(fā)光免疫技術(shù)等。鼠源抗體（尤其是鼠單克隆抗體）已廣泛應(yīng)用在免疫診 斷試劑盒的開(kāi)發(fā)和制備過(guò)程中，鼠源抗體常用于包被酶標(biāo)板、芯片、膠體金顆粒、乳膠微球 顆粒和磁性微球顆粒等固體載體上，然后用BSA(Bovine Serum Albumin,即牛血清白蛋白） 或OVA (Ovalbumin，即雞卵白蛋白）等其它蛋白封閉抗體未結(jié)合的載體位點(diǎn)，洗脫，從而完 成了抗體的包被。鼠源抗體包被效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是產(chǎn)品性能能否達(dá)到其設(shè)計(jì)要求或者判定 標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 由于產(chǎn)品的性能受到很多因素的影響，因此單純地以產(chǎn)品性能能否達(dá)到設(shè)計(jì)要求 或判定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷在固體載體上抗體的包被效果并不科學(xué)。鼠源抗體結(jié)合在固體載體上的 比率是反映抗體包被效果的一個(gè)非常重要的而且直接的指標(biāo)，更直接地反映了鼠源抗體結(jié) 合在固體載體上的具體抗體量，因此，亟需開(kāi)發(fā)一種鼠源抗體快速定量檢測(cè)新產(chǎn)品。
[0004] 時(shí)間分辨突光免疫分析方法（Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是 1982 年發(fā)展起來(lái)的一種新型的非放射性標(biāo)記技術(shù)。TRFIA利用鑭系元素金屬的三價(jià)離子及其 螯合物作為熒光標(biāo)記，常用的鑭系元素為銪（Eu)、鋱（Tb)、釤（Sm)和鏑（Dy)，最常用的是 銪、鋱，鑭系元素標(biāo)記物比較穩(wěn)定，可以保存1-2年，克服了同位素、酶標(biāo)等不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。 TRFIA現(xiàn)已成為免疫檢測(cè)中一項(xiàng)非常有應(yīng)用前景的分析手段，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、示 蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、多標(biāo)記、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。在抗體檢測(cè)方面，時(shí)間分 辨熒光免疫分析方法的檢測(cè)目標(biāo)物通常是針對(duì)某一抗原包括小分子抗原的抗體，一般不會(huì) 采用該方法來(lái)檢測(cè)某一種屬動(dòng)物的抗體（例如鼠源抗體）。目前，對(duì)于采用時(shí)間分辨熒光免 疫分析方法定量檢測(cè)鼠源抗體尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒， 解決免疫診斷技術(shù)中定量檢測(cè)未有效包被到固體載體上的鼠源抗體濃度，從而計(jì)算有效包 被到固體載體上的抗體包被率，以評(píng)估包被效果，該試劑盒能夠定量檢測(cè)鼠源抗體，具有檢 測(cè)靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，操作流程短，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明還提供該試劑盒的制 備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的原理是競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光分析法，如圖1所示，具體包括如下步驟：將羊抗鼠 多克隆抗體包被到酶標(biāo)板上，形成包被羊抗鼠多克隆抗體的酶標(biāo)板1，待測(cè)樣品中的鼠源 抗體2先與包被在酶標(biāo)板1上的羊抗鼠多克隆抗體反應(yīng)（震蕩、洗板），形成鼠單克隆抗 體/羊抗鼠多克隆抗體免疫復(fù)合物3,然后加入鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體4反應(yīng)（震 蕩、洗板）形成鼠源抗體/羊抗鼠多克隆抗體/鑭系元素免疫復(fù)合物5,加入增強(qiáng)液震蕩 反應(yīng)，在熒光檢測(cè)設(shè)備如Aut 〇DELFIA1235上讀熒光信號(hào)，從而確定標(biāo)準(zhǔn)品中鼠源抗體的濃 度。當(dāng)鑭系元素離子在熒光增強(qiáng)液中從鼠單克隆抗體上解離后發(fā)出強(qiáng)熒光，熒光強(qiáng)度與樣 品中的鼠源抗體濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中鼠源抗體的濃度，再按照公式 " 100 % -鼠源抗體濃度*待檢樣品體積/鼠源抗體投入量*100 % "計(jì)算鼠源抗體的包被率。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免 疫熒光試劑盒，包括以下組分：
[0008] 包被羊抗鼠多克隆抗體的酶標(biāo)板；
[0009] 鑭系元素離子標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物；
[0010] 鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品（濃度已知，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線）；
[0011] 清洗液（市售商品）；
[0012] 分析液（市售商品）；
[0013] 增強(qiáng)液（市售商品）。
[0014] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述羊抗鼠多克隆抗體的包被濃度為1-100 μ g/ml。
[0015] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物中抗體是 鼠單克隆抗體，所述標(biāo)記示蹤物是鑭系元素金屬離子及其螯合物中的一種，包括銪Eu、鋱 Tb、釤Sm和鏑Dy。
[0016] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物中鑭系元 素離子與鼠單克隆抗體的摩爾比例是6-10:1。
[0017] 此外，本發(fā)明還提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0018] 步驟1.羊抗鼠多克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備：
[0019] 將羊抗鼠多克隆抗體在包被液中透析，用包被液將羊抗鼠多克隆抗體稀釋到 1-100 μ g/ml，然后包被到96孔酶標(biāo)板中，再用封閉保護(hù)液封閉，最后甩干封閉保護(hù)液干燥 密封備用；
[0020] 步驟2.鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物的制備：
[0021] 將鼠單克隆抗體用標(biāo)記液進(jìn)行透析，取透析好的鼠單克隆抗體加入到鑭系元素離 子中進(jìn)行標(biāo)記，然后純化，收集標(biāo)記物；
[0022] 步驟3.鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品的制備：用鼠單克隆抗體和PBS配制濃度為0.1、 0· 5、1· 0、2· 0、5· 0和10ng/ml的鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品；
[0023] 所述清洗液、分析液和增強(qiáng)液為市售商品。
[0024] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟2中，所述取透析好的鼠單克隆抗體加入到鑭 系元素離子中進(jìn)行標(biāo)記，所述鑭系元素離子與鼠單克隆抗體的摩爾比例是6-10:1。
[0025] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟1中，所述的包被液采用如下方法制得：在 900ml 去離子水中依次加入 35. 08g Na2HP04-12H20、15. 91g NaH2P04-2H20和 9. 00g NaCl，待完 全溶解后用1NHC1或INNaOH調(diào)整PH值至6. 8±0. 1。
[0026] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟1中，所述的封閉保護(hù)液采用如下方法制得：將 8. 77gNa2HP04 ·12Η20 和 3. 98gNaH2P04 ·2Η20 加入到 600ml 去離子水中，再依次加入 lgBSA， 60gTrehalose 和 lg Diazolidinyl Urea,待完全溶解后調(diào)整 PH 值至 6· 8±0· 1，定容到 1L。
[0027] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟2中，所述的標(biāo)記液采用如下方法制得：在 900ml去離子水中依次加入2. 12gNa2C〇dP6. 72gNaHC03，待完全溶解后用1NHC1或INNaOH 調(diào)整PH值至9. 2±0. 2。
[0028] 此外，本發(fā)明還提供了試劑盒在定量檢測(cè)鼠源抗體中的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0029] 步驟1.待檢樣品的制備：將鼠源抗體包被到酶標(biāo)板、芯片、膠體金顆粒、乳膠微球 顆粒和磁性微球顆粒等固體載體上后，收集其廢棄液，測(cè)量廢棄液的體積并用分析液稀釋 作為待檢樣品；
[0030] 步驟2.將鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品和待檢樣品依次加入到羊抗鼠多克隆抗體包被的 酶標(biāo)板上，每個(gè)校準(zhǔn)品和待檢樣品重復(fù)三孔，再加入分析液，震蕩孵育；
[0031] 步驟3.將清洗液用去離子水進(jìn)行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板多次 并甩干；
[0032] 步驟4.將純化好的鑭系元素離子標(biāo)記的鼠單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標(biāo) 板中，震蕩孵育；
[0033] 步驟5.用稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板多次并甩干；
[0034] 步驟6.每孔加入增強(qiáng)液，在時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀上按所編程序檢測(cè)熒光信號(hào)；
[0035] 步驟7.根據(jù)熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待檢樣品的熒光信號(hào)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中， 求得待檢樣品中鼠源抗體的檢測(cè)濃度，再按照公式" 100% -廢棄液中鼠源抗體檢測(cè)濃度* 廢棄液體積*稀釋倍數(shù)/鼠源抗體投入量*100% "計(jì)算鼠源抗體的包被率。
[0036] 本文中出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)"分析液"、"清洗液"、"增強(qiáng)液"、"包被液"、"封閉保護(hù)液"、"標(biāo) 記液"、"洗脫液"具體說(shuō)明見(jiàn)表1 :
[0037] 表 1
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下 組分： 包被羊抗鼠多克隆抗體的酶標(biāo)板； 鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物； 鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品； 清洗液； 分析液； 增強(qiáng)液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在 于，所述羊抗鼠多克隆抗體的包被濃度為1-100 μ g/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在 于，所述鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物中抗體是鼠單克隆抗體，所述標(biāo)記示蹤物是 鑭系元素金屬離子及其螯合物中的一種，包括銪Eu、鋱Tb、釤Sm和鏑Dy。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)鼠源抗體的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征 在于，所述鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物中鑭系元素離子與鼠單克隆抗體的摩爾比 例是 6-10:1。
5. -種權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1.羊抗鼠多克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備： 將羊抗鼠多克隆抗體在包被液中透析，用包被液將羊抗鼠多克隆抗體稀釋到 1-100 μ g/ml，然后包被到96孔酶標(biāo)板中，再用封閉保護(hù)液封閉，最后甩干封閉保護(hù)液干燥 密封備用； 步驟2.鑭系元素標(biāo)記的鼠單克隆抗體標(biāo)記物的制備： 將鼠單克隆抗體用標(biāo)記液進(jìn)行透析，取透析好的鼠單克隆抗體加入到鑭系元素離子或 其螯合物中進(jìn)行標(biāo)記，然后純化，收集標(biāo)記物； 步驟3.鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品的制備：用鼠單克隆抗體和PBS配制濃度為0. 1、0. 5、 1. 0、2· 0、5· 0和10ng/ml的鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品； 所述清洗液、分析液和增強(qiáng)液為市售商品。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述取透析好的鼠單克隆 抗體加入到鑭系元素離子中進(jìn)行標(biāo)記，所述鑭系元素離子與鼠單克隆抗體的摩爾比例是 6-10:1。
7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述的包被液采用如下方法 制得：在 900ml 去離子水中依次加入 35. 08g Na2HP04-12H20、15. 91g NaH2P04-2H20 和 9. 00g NaCl，待完全溶解后用1NHC1或INNaOH調(diào)整PH值至6. 8±0. 1。
8. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述的封閉保護(hù)液采用如下 方法制得：將8. 77g Na2HP04 ·12Η20和3. 98g NaH2P04 ·2Η20加入到600ml去離子水中，再依次 加入 lg BSA，60g Trehalose和 lg Diazolidinyl Urea,待完全溶解后調(diào)整PH值至6. 8±0· 1， 定容到1L。
9. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述的標(biāo)記液采用如下方法 制得：在900ml去離子水中依次加入2. 12g Na2C03和6. 72g NaHC03，待完全溶解后用IN HC1 或 INNaOH 調(diào)整 PH 值至 9. 2±0. 2。
10. -種如權(quán)利要求1所述的試劑盒在定量檢測(cè)鼠源抗體中的應(yīng)用，其特征在于，包括 如下步驟： 步驟1.待檢樣品的制備：將鼠源抗體包被到固體載體上后，收集其廢棄液，測(cè)量廢棄 液的體積并用分析液稀釋作為待檢樣品； 步驟2.將鼠單克隆抗體校準(zhǔn)品和待檢樣品依次加入到羊抗鼠多克隆抗體包被的酶標(biāo) 板上，每個(gè)校準(zhǔn)品和待檢樣品重復(fù)三孔，再加入分析液，震蕩孵育； 步驟3.將清洗液用去離子水進(jìn)行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板多次并甩 干； 步驟4.將純化好的鑭系元素離子標(biāo)記的鼠單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標(biāo)板 中，震湯鮮育； 步驟5.用稀釋的清洗液清洗酶標(biāo)板多次并甩干； 步驟6.每孔加入增強(qiáng)液，在時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀上按所編程序檢測(cè)熒光信號(hào)； 步驟7.根據(jù)熒光數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待檢樣品的熒光信號(hào)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得 待檢樣品中鼠源抗體的檢測(cè)濃度，再按照公式" 100 % -廢棄液中鼠源抗體檢測(cè)濃度*廢棄 液體積*稀釋倍數(shù)/鼠源抗體投入量*100% "計(jì)算鼠源抗體的包被率。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104062429SQ201410261089
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】張展英, 趙金博, 田豐, 周蓓昕 申請(qǐng)人:美艾利爾（上海）診斷產(chǎn)品有限公司