專利名稱：用于預(yù)防或治療體重過重的胃腸激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減輕哺乳動物體重的合成物和使用方法。
背景技術(shù)：
肥胖是發(fā)生率最高但缺乏有效治療方法的疾病之一。它使人處于虛弱狀態(tài)，降低了生活質(zhì)量并顯著增加了患其他疾病的風(fēng)險。
在美國，目前有25％的成年人屬于臨床意義上的肥胖。據(jù)估計，肥胖直接導(dǎo)致美國的保健費用每年450億美元，占總保健費用的8％。在歐洲，肥胖人數(shù)也日益增加。由于缺少新的方法，預(yù)測到2005年，20％的英國人將成為臨床意義上的肥胖病人。醫(yī)療人員和健康權(quán)威正逐漸認(rèn)識到肥胖是一種代謝疾病。但在長期的肥胖控制中，能與飲食控制和鍛煉相結(jié)合應(yīng)用的有效且安全的藥物仍缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供這類藥物，并提供鑒定和進(jìn)一步開發(fā)此類藥物的方法。
前高血糖素原(preproglucagon)是一種160個氨基酸組成的多肽，它以組織特異性方式被激素原轉(zhuǎn)換酶-1和-2切割而產(chǎn)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周組織中具有不同功能的許多產(chǎn)物。在腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，前高血糖素原切割的主要轉(zhuǎn)譯后產(chǎn)物是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)，腸高血糖素和胃腸激素(oxyntomodulin，OXM)，如圖A所示。到目前為止，OXM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用仍未被證明。
雖然GLP-1與GLP-2顯示能抑制食物攝取，但未能證明不同的肽OXM有此作用。作為生物活性肽，OXM的重要性也未能證明。
與預(yù)計相反，現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)OXM肽能抑制食物攝取，和降低體重。
因此本發(fā)明第一方面是提供含OXM的合成物，用于哺乳動物體重過重的預(yù)防與治療。
在本文中，術(shù)語“胃腸激素”與“OXM”一樣，指含以下OXM肽序列或其類似物的任意合成物
OXM序列為本領(lǐng)域所熟知并有文字記錄。本發(fā)明涉及本文引用的所有序列，具體包括以下的人OXM序列(與老鼠、大頰鼠和牛的OXM序列相同)His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr LysArg Asn Lys Asn Asn Ile Ala鮟鱇魚的OXM序列如下His Ser Glu Gly Thr Phe Ser Asn Asp TyrSer Lys Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Ala GlnGlu Phe Val Arg Trp Leu Met Asn Asn LysArg Ser Gly Val Ala Glu鰻鱺的OXM序列如下His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Asn Asp TyrSer Lys Tyr Leu Glu Thr Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Ser LysArg Ser Gly Gly Pro Thr本文中使用的術(shù)語OXM還涵蓋任何含有以上OXM序列的類似物，其中1位上的組氨酸殘基被保留，或者被攜帶陽電荷的芳香族部分或其衍生物所替代，其中，該部分優(yōu)選為氨基酸，更優(yōu)選組氨酸衍生物，以上OXM序列的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21或22位的氨基酸可單獨地被其他任何所選氨基酸單獨替代，但1位組氨酸除外。
此序列中任何一個或多個(可至22)a-氨基酸殘基都可單獨地被其他任何a-氨基酸殘基所替代。如本領(lǐng)域所熟知，除組氨酸外的任何氨基酸殘基都可被一個保守替代物所代替，即用一個相似化學(xué)類型的氨基酸來替代，例如，用一個疏水氨基酸來代替另一個疏水氨基酸。
如上所述，1-22位氨基酸均可被替代。除了以上替代選項外，也可用非必需或改造過的或者氨基酸的同分異構(gòu)體來替代。例如，1-22位的氨基酸可用同分異構(gòu)體(例如D-氨基酸)，或者改性氨基酸，例如正氨基酸(如己氨酸或戊氨酸)，或非必需氨基酸(例如?；撬?所替代。此外，1-22位氨基酸也可用通過其側(cè)鏈連接的相應(yīng)的或者不同的氨基酸(例如γ鏈谷氨酸)來替代。對于上述各種替代，1位上的組氨酸殘基是不能改變的或如上述限定。
另外，除1位的組氨酸外(或如上所限定)，1、2、3、4或5位氨基酸殘基可從OXM序列中去除。被去除的殘基可以是任意2、3、4或5位的相鄰殘基或者完全分離的殘基。
OXM序列的C末端可通過加入其它氨基酸殘基或者其他部分來改性?？蓪⑸鲜鯫XM作為其相應(yīng)的鹽提供。藥學(xué)上可接受的OXM鹽及其類似物的例子包括衍生自有機酸，例如甲磺酸，苯磺酸和對-甲苯硫酸；衍生自無機酸，例如鹽酸和硫酸等的鹽；及甲基磺酸鹽，苯磺酸鹽，對-甲苯磺酸鹽，鹽酸和硫酸鹽等；或衍生自堿，例如有機堿和無機堿的鹽。適用于形成本發(fā)明合成物的鹽的無機堿的例子包括氫氧化物，碳酸鹽和氨、鋰、鈉、鈣、鉀、鋁、鐵、鎂、鋅等的重碳鹽酸。這種鹽也可用適當(dāng)?shù)挠袡C堿形成。適合于形成具有本發(fā)明合成物的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽的這種堿包括無毒性，并足以形成鹽的有機堿。這樣的有機堿為本領(lǐng)域所熟知，可包括氨基酸，如精氨酸和賴氨酸，單、雙、或三羥基烷基胺，例如單-，雙-和三乙胺，膽堿，單-，雙-和三烷基胺，如甲胺，二甲胺，和三甲胺；胍；N-甲葡萄糖胺；N-甲基哌嗪；嗎啉；乙(撐)二胺；N-苯甲基苯乙胺；tris(羥甲基)；氨基甲烷等。
此類鹽可以本領(lǐng)域熟知方法按常規(guī)制備。所述堿性化合物的酸加成鹽可通過將游離堿性化合物溶解在水中，或者水酒精溶液，或者其他含有所需酸的適當(dāng)溶劑中而制備。當(dāng)OXM含有酸性功能基因時，所述合成物的堿性鹽可通過使所述合成物與適當(dāng)?shù)膲A反應(yīng)而制備。酸性或堿性鹽可直接分離或者通過濃縮溶液，例如通過蒸發(fā)來獲得。OXM也可以溶于溶劑或者水合形式存在。
可將本發(fā)明的OXM共軛于一個或多個，例如脂類，糖，蛋白質(zhì)或者多肽。OXM可通過結(jié)合于一個組群連接(例如通過共價或離子鍵)而共軛，或者與其締結(jié)。當(dāng)OXM結(jié)合于該組群時，共軛鍵最好不要通過C或N末端的氨基酸?？蓪XM共軛于一聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇聚；氧乙烯-聚氧丙烯共聚物；多糖如纖維素、纖維素衍生物、殼聚糖、阿拉伯膠、刺梧桐樹膠、瓜耳樹膠、黃原膠、黃芪膠、褐藻酸、角叉萊膠、瓊脂糖和帚叉藻聚糖、右旋糖苷、淀粉、淀粉衍生物、聚酯、聚胺、聚酐和聚鄰酯。
OXM也能被化學(xué)改性。具體地，OXM的氨基酸側(cè)鏈、的N末端和/或C末端能被改性。例如，可使OXM進(jìn)行一次或多次烷化，二硫化物形成，金屬絡(luò)合，?；?，酯化，酰胺化，硝化，酸處理，堿處理，氧化或還原。進(jìn)行這些過程的方法是本領(lǐng)域熟知的。特別是OXM可作為低級烷化脂，低級的烷化酰胺，低級二烷基酰胺，酸加成鹽，羧酸鹽或其烷化加減鹽。具體說，OXM的氨基或者羧基末端此衍生可以通過例如酯化，酰胺化，?；?，氧化或者還原而成。特別是OXM的羧基末端也可衍生形成一酰胺基團。
OXM可用金屬，特別是二價金屬處理。鋅、鈣、鎂、銅、錳、鈷、鉬或鐵中的一種或幾種金屬都可用于處理OXM。
OXM也可與藥學(xué)上可接受的這載體或稀釋劑組合提供。本領(lǐng)域熟知的合適運載體和/或稀釋劑包括藥物級淀粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖(或者其他糖類)，碳酸鎂，明膠，油，酒精，去污劑，乳化劑或水(無菌的最好)。該組合物可以是一種組合物的混合制劑，或可以是供同時、分開或者相繼使用(包括給藥)的組合制劑。OXM可采用結(jié)晶固體，粉末，水溶液，懸浮液或者油劑提供。
前述所指的與本發(fā)明組合物可通過任何方便的方法來給藥，例如口服(包括吸入)，非腸道給藥，粘膜(例如口腔，舌下，鼻部)給藥，直腸給藥，皮下或透皮給藥，采取相應(yīng)形式的該組合物。
對于口服給藥，該組合物可配制成液體或固體，例如溶液，糖漿，懸浮液或乳液，片劑，膠囊以及藥糖塊。
液體制劑通常包括、該組合物的懸浮液或溶液或生理學(xué)上可接受鹽的含適水溶液或非水液體載體，例如水，乙醇，甘油，聚乙二醇或油。這些制劑還可含有懸浮劑，防腐劑，調(diào)味劑或者著色劑。
片劑形式的組合物可用藥學(xué)上常規(guī)用于制備固體制劑的適當(dāng)運載體制備。這樣的運載體包括硬脂酸鎂，淀粉，乳糖，蔗糖和微晶纖維。
膠囊形式的組合物可用常規(guī)的膠囊包封程序來制備。例如，可采用標(biāo)準(zhǔn)運載體來制備含活性成分的粉末，顆粒或者小團，并將其填充入硬明膠膠囊中；或可采用適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)運載體，例如水樹脂，纖維素，硅酸鹽或者油來制備分散液或懸浮液，并將其填充入軟明膠膠囊中。
可設(shè)計用于口服的合成物在其通過消化道時保護活性分子不受降解，例如有外裹層的片劑或者膠囊。
典型的非腸道吸收組合物包括此組合物或其生理學(xué)上可接受的鹽的溶液或懸浮液以滅菌的水性堿、非水性運載體或非腸道可吸收的油，例如聚乙二醇，吡咯烷酮乙烯聚合物，卵磷脂，花生油或芝麻油配制?；蛘咴撊芤阂部梢詢龈桑o藥前再用適當(dāng)?shù)娜軇┲亟ā?br> 鼻腔或口服給藥的組合物可以方便地制成氣霧劑，滴劑，凝膠和粉末形式。氣霧劑通常含有用生理學(xué)可接受的水或非水溶劑配制的活性物質(zhì)的溶液或00懸浮液，一劑或多劑以滅菌形式裝于密封容器中，如藥筒或可重復(fù)使用的噴霧器裝置。密封容器也可以是一次性分配裝置，如單劑鼻腔吸入器或者裝有一次性堆放容器內(nèi)物質(zhì)的計量閥的氣霧分配器。若該藥劑形成含氣霧分配器，將加入藥學(xué)上可接受的推進(jìn)劑。此氣霧劑形式可采取泵噴霧器形式。
適合口浹或舌下給藥的組合物包括片劑，藥糖塊和錠劑，其中活性成分與一種運載體，如糖和阿拉伯樹膠，黃芪膠或明膠和甘油一起配制。
用于直腸或陰道給藥的組合物可制成使用方便的栓劑形式(含有一中方便的栓劑基質(zhì)，如可可，黃油)，子宮托，陰道管，泡沫材質(zhì)或灌腸劑。
適于透皮給藥的組合物包括藥膏，凝膠，貼片和粉末注射的注射劑。
該組合物以單位計量形式如藥片，膠囊或安瓿使用方便。
OXM可用作預(yù)防措施，來防止過度的體重增加，或可用于降低體重的治療方法。
雖然沒有證明患體重過重的哺乳動物為臨床意義上的肥胖，但是體重過重通常就是肥胖。OXM可以是液體，固體或者半固體形式。
在當(dāng)今社會，預(yù)防或治療哺乳動物體重過重確實需要。優(yōu)選的哺乳動物是人，雖然也包括其他哺乳動物如馬，犬科動物(特別是家庭飼養(yǎng)的犬科動物)，貓科動物(特別是家庭飼養(yǎng)的貓科動物)以及那些生產(chǎn)肉類的哺乳動物如豬，牛和綿羊科動物。本發(fā)明可用于這類動物的體重過重，而使瘦肉的生產(chǎn)最大化。
本文中，術(shù)語“預(yù)防”指任何程度減輕過重體重的作用。本文中的術(shù)語“治療”指任何程度改善過重體重。
第二方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或者治療哺乳動物體重過重的方法，該方法包括給予哺乳動物含OXM的合成物。哺乳動物很可能需要預(yù)防或治療體重過重。體重減輕有美體作用。含OXM的合成物將以有效濃度給藥。
本發(fā)明第一方面的所有優(yōu)選特征也適用于第二方面。
本發(fā)明的第三方面提供一種美化性減輕哺乳動物體重的方法，該方法包括給予哺乳動物含OXM的合成物。在這樣的情況下，體重減輕純粹是出于美化外觀的目的。
第一、第二方面的所有優(yōu)選特征也適用于第三方面。
不受理論的束縛，可明白本發(fā)明是通過給予OXM作為進(jìn)食抑制劑來預(yù)防或治療哺乳動物體重過重。通過減少食物攝入結(jié)果是防止和治療哺乳動物體重過重。本文中，術(shù)語“食物”包括被攝取并具有發(fā)熱值的物質(zhì)。
本發(fā)明第四方面提供OXM在制造用于防止或治療體重過重藥物中的用途。
第一和第三方面的優(yōu)選待征都可應(yīng)用于第四方面。
本發(fā)明的第一、二、四方面內(nèi)容與藥物有關(guān)，具體的劑量方案最終由主治醫(yī)師決定，并且在在使用OXM時考慮到以下因素動物的類型、年齡、體重、癥狀的嚴(yán)重程度和/或治療力度，給藥方法，副反應(yīng)和/或相反的跡象?？捎蓸?biāo)準(zhǔn)設(shè)計的臨床試驗和對病人的病情進(jìn)展和康復(fù)的全面監(jiān)控來確定具體的劑量范圍。
這些試驗可采用逐步增加劑量的方法，使用動物所能承受的最大劑量的低百分比值作為人使用的起始劑量。
本發(fā)明第五方面涉及與運用OXM來鑒定能抑制哺乳動物攝食的制劑。本發(fā)明這方面提供了一種鑒定和進(jìn)一步開發(fā)防治體重過重的合適藥物的方法。
OXM的應(yīng)用可包括此肽本身的使用或包括OXM的原理或模型特征的應(yīng)用。所用的OXM功能或結(jié)構(gòu)特性可以是肽本身的特性，或者可以是一種計算機構(gòu)建的模型，一種物理的二維或三維模型或者一種電子構(gòu)建的(例如計算機構(gòu)建的)一級、二級或三級結(jié)構(gòu)，以及藥效基團(三維電子密度圖譜)或其X-射線晶體結(jié)構(gòu)。
此結(jié)構(gòu)特性可用于鑒定潛在的能與OXM相互作用從而影響其功能的，可通過計算機建立模型和/或合理的藥物設(shè)計進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的每一方面的優(yōu)選特性都對其他各方面作了必要的修正。


現(xiàn)在通過實施例方式說明本發(fā)明，并參見以下圖表，其中圖A是前高血糖素原及其組成成分圖；圖1是ICV和iPVN兩種方法注射高血糖素原衍生的相關(guān)產(chǎn)物對禁食老鼠食物攝入的影響的比較。圖1A表明在給禁食動物IVC注射GLP-1、OXM、胰高血糖素或腸高血糖素(均3nmol)后8小時的累計攝食量(g)。*，P＜0.05(以生理鹽水作為對照)。圖1B表明在給禁食動物急劇iPVN注射GLP-1，OXM(均為1nmol)，或激動素(exendin)-4(0.03nmol)后，24小時食物的累計攝入量(g)。*，所有組在1，2，4h時P＜0.01(以生理鹽水作為對照)。*，只用激動素-4在8h時P＜0.05(以生理鹽水作為對照)。
圖2是兩張ICV和iPVN給予OXM對禁食老鼠攝食影響的作用效果圖。圖2A，在給禁食老鼠急劇ICV注射OXM(0.3，1，3，或10nmol)后8小時食物的累計攝入量(g)。圖2B給禁食老鼠即刻iPVN注射OXM(0.3，1，3，或10nmol)后8小時食物的累計攝入量(g)。*，P＜0.05(以生理鹽水作為對照)。
圖3是兩張在黑暗初期ICV注射OXM作用效果的柱形圖。在黑暗初期飽食老鼠接受OXM、GLP-1(3nmol)或鹽水的ICV注射，測定注射后1h的食物攝入量(克；A)和行為(B)。*，P＜0.05(以生理鹽水作為對照)。
圖4是OXM和GLP-1由激動素-(9-39)所致食物攝入的抑制作用的兩張柱形圖。圖4A，急劇ICV注射GLP-1(3nmol)、GLP-1加激動素-(9-39)(30nmol)、OXM(3nmol)、OXM和激動素-(9-39)(30nmol)，或單用激動素-(9-39)(30nmol)后1h的食物攝入量。圖4B，給禁食老鼠急劇iPVN注射GLP-1(1nmol)、GLP-1和激動素-(9-39)(10nmol)、OXM(1nmol)、OXM和激動素-(9-39)(10nmol)，或單用激動素-(9-39)(10nmol)后1h的食物攝入量。**，P＜0.005(以生理鹽水作為對照)。
圖5是GLP-1和OXM對老鼠下丘腦膜[125I]GLP-1的結(jié)合競爭。
圖6表明兩種作用效果a)在黑暗早期給禁食24h的老鼠IP注射OXM(30，100和300nmol/kg溶于50μl生理鹽水中)或生理鹽水后的累計食物攝入量(實心方塊＝生理鹽水，空環(huán)＝OXM 30nmol/Kg，空心三角＝OXM 100nmol/Kg，空三角＝OXM 300nmol/Kg)；b)黑暗期開始前給非禁食的老鼠IP注射OXM(30，100和300nmol/kg溶于50μl生理鹽水中)或生理鹽水后的食物的累計攝入量(實心方塊＝生理鹽水，空環(huán)＝OXM 30nmol/Kg，實心三角＝OXM 100nmol/Kg)。*P＜0.05(以生理鹽水作為對照)；圖7表明一周內(nèi)每天兩次IP注射OXM(50nmol/Kg)或生理鹽水對a)食物累計攝入量(g)；和b)體重增加量(g)的影響。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005(以生理鹽水作為對照)；圖8表明IP注射OXM(50nmol/Kg)，生理鹽水或陽性對照(1小時＝GLP-1(50nmol/Kg)；2小時＝CCK(15nmol/Kg))，對禁食36小時的老鼠胃排空的影響。胃內(nèi)容物(干重)以喂食后三十分鐘內(nèi)攝食量的百分比表示。**P＜0.01(以生理鹽水作為對照)；圖9顯示增加注射入禁食24小時的老鼠弓形核內(nèi)的OXM劑量(0.01-1.0nmol)對注射后1h食物攝入量的影響。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.05(以生理鹽水作為對照)；圖10表明在IP注射OXM(30nmol/Kg)、GLP-1(30nmol/Kg)或生理鹽水之前15分鐘iARC注射激動素9-39(5nmole)對注射后1小時食物攝入的影響。(S＝生理鹽水，G＝GLP-1(30nmol/Kg)，Ex＝激動素9-39(5nmoles))；圖11a表明IP注射A)生理鹽水和B)以O(shè)XM(50nmol/Kg)於下丘腦弓形核中顯示的fos-樣免疫反應(yīng)。***P＜0.005(生理鹽水作對照)；
圖11b表明IP注射A)生理鹽水和B)OXM(50nmol/Kg)或C)IP CCK(15nmol/Kg)于腦干中NTS和AP中顯示的fos-狀免疫反應(yīng)。
具體實施例方式
A以ICV和iPVN注射OXM后引起禁食老鼠的攝食量顯著減少。
肽和化學(xué)試劑GLP-1，腸高血糖素，胰高血糖素和SP-1購自半島實驗室(PeninsulaLaboratories，Inc.)(St.Helens，UK)，OXM購自IAF BioChem Pharma(Laval，Canada)。激動素-4和激動素-(9-39)由英國倫敦Hammersmith醫(yī)院臨床科學(xué)中心止血單元藥物研究委員會(Medical Research Council，Hemostasis Unit，ClinicalSciences Center，Hammersmith Hospital，London，UK)在396 MPS肽合成儀(Advanced ChemTech，Inc.)上用F-moc化學(xué)試劑合成并經(jīng)反相HPLC在C8柱(Phenomex，Macclesfield，UK)上純化。分子量通過質(zhì)譜驗證正確。所有的化學(xué)試劑都購自Merck & Co.，(Lutterworth，Leicester，UK)，另有說明的除外。
動物成年雄性Wistar老鼠(ICSM，Hammersmith Hospital)在控制溫度(21-23℃)和光線(光照12小時，黑暗12小時)的條件下單籠培養(yǎng)；隨時可獲得食物(RM1 diet，Special Diet Services UK Ltd.，Witham，UK)和自來水。日常對待手術(shù)后康復(fù)的老鼠直至研究完成。所有動物操作程序都得到英國內(nèi)務(wù)部動物處(British Home OfficeAnimals)的批準(zhǔn)(Scientific Procedures Act 1986(Project License PIL 90/1077)。試驗合成物的ICV和iPVN插管和灌注動物置放永久性不銹鋼導(dǎo)管(Plastics One，Roanoke，VA)，主體定位注入ICV或iPVN。所有的研究工作均在禁食24h后的早期光照階段，在0900-1100之間進(jìn)行，測定注射后1，2，4，8和24h的食物攝入量。
喂食實驗方法高血糖素原衍生物和相關(guān)肽對食物攝取的影響的比較在1a實驗中，老鼠ICV注入10μl的生理鹽水，GLP-1(13nmol)，OXM(3nmol)，胰高血糖素(3nmol)，或腸高血糖素(3nmol；n＝8/每組)。
在所有的實驗中，采用具有以下序列的人OXMHis Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr LysArg Asn Lys Asn Asn Ile Ala采用具有以下序列的人GLP-1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValSer Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg在1b實驗中，老鼠iPVN注入1μl生理鹽水，GLP-1(1.0nmol)，OXM(1.0nmol)，腸高血糖素(1.0nmol)，胰高血糖素(1.0nmol)或SP-1(3.0nmol；n＝12-15/group)。當(dāng)注射ICV時，激動素-4抑制食物攝入比GLP-1更強。因此，激動素-4注射劑量為0.03nmol的iPVN。
OXM劑量增加對食物攝入量的影響研究在2a實驗中，給老鼠ICV注射生理鹽水，GLP-1(3nmol)，或OXM(0.3，1，3或10nmol；n＝8/group)。在2b試驗中，給老鼠iPVN注射生理鹽水GLP-1(1.0nmol)，或OXM(0.1，0.3，或1.0nmol；n＝12-15/group)。為了評估OXM是否通過GLP-1受體起作用，用GLP-1受體的拮抗劑激動素-(9-39)進(jìn)行研究。
夜間喂食與行為分析實驗3OXM可能通過引起非特異性厭食而抑制食物的攝入，這可能不是真正的過飽因素。因此，在黑暗期將GLP-1(3nmol)，OXM(3nmol)或生理鹽水(n＝6/group)注射入插入ICV導(dǎo)管的老鼠。注射后1h進(jìn)行攝食量測定(實驗3a)和行為分析(實驗3b)。注射后1h采用行為評分表來觀察老鼠的行為。
在實驗4a中，老鼠分別用ICV注射鹽水；GLP-1(3nmol)；GLP-1(3nmol)加激動素-(9-39)(30nmol)，OXM(3nmol)，OXM(3nmol)加激動素-(9-39)(30nomol)，或激動素-(9-39)(30nmol)單獨注射。在4b試驗中，老鼠分別用iPVN注射鹽水，GLP-1(1nmol)，GLP-1(1nmol)加激動素-(9-39)(10nmol)，OXM(1nmol)，OXM(1nmol)加激動素-(9-39)(10nmol)，或激動素-(9-39)(10nmol，n＝10-12/組)單獨注射。
實驗5 受體結(jié)合試驗受體結(jié)合試驗在終體積0.5ml的溶液進(jìn)行。溶液含老鼠丘腦下部的細(xì)胞膜(含200μg蛋白質(zhì))；500Bq的[125I]GLP-1(100pM)和未標(biāo)記競爭肽(GLP-1和OXM)。含膜溶液室溫孵育90分鐘。結(jié)合的和游離的放射性標(biāo)記物通過離心分離(2分鐘、4℃)。沉淀的膜用試驗緩沖液(0.5ml、冰浴的)洗滌，洗滌后按上述方法離心。除去上清液，沉淀的放射活性用γ計數(shù)儀測量。特異性結(jié)合值(飽和)計算為在缺乏(總結(jié)合)和存在1μm GLP-1或OXM(非飽和結(jié)合)時[125I]GLP-1結(jié)合量之間的差異。所有曲線是用一式三份測量值點構(gòu)成。IC50值用Prism 3程序(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)計算得到。
統(tǒng)計關(guān)于食物攝取分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)形式表示。實驗各組間的統(tǒng)計學(xué)差異先進(jìn)行方差分析(ANOVA)，繼而以多重方差(post-hoc)最小顯著性差異檢驗(Systat8.0，Evanton，IL)確定。關(guān)于行為分析，數(shù)據(jù)顯示為每種行為發(fā)生數(shù)的中值和范圍。使用Mann-Whitney U檢驗(Systat 8.0)比較各組間的差異。所有檢驗中，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果高血糖素原衍生物和相關(guān)多肽對食物攝取的影響的比較。
ICV給藥在實驗1a中，OXM和GLP-1顯著減少了再進(jìn)食。這種對食物攝取的抑制持續(xù)到注射后4個小時(圖1A)。胰高血糖素和腸高血糖素(3noml)在任何時間點對食物攝取都沒有影響(圖1A)。
iPVN給藥在實驗1b中，當(dāng)iPVN注射后，OXM，GLP-1(3nmol)和激動素-4(0.03nmol)也抑制了再進(jìn)食。這種抑制持續(xù)到注射后8小時，比ICV注射更久(圖1B)。腸高血糖素，胰高血糖素(1nmol)和SP-1(3nmol)在iPVN注射后任何時間點對進(jìn)食都沒有影響。
增加OXM劑量對食物攝取的影響ICV給藥在實驗2a中，當(dāng)ICV注射后，OXM以劑量依賴方式減少了再進(jìn)食，劑量3nmol時，注射后1、2、和4小時達(dá)到最大抑制作用。
IPVN給藥在實驗2b中，當(dāng)iPVN注射后，GLP-1(1nmol)和OXM(1nmol)顯著減少食物攝取量，持續(xù)到注射后8小時(圖2B)。
OXM對在黑暗期開始時ICV插管飽食老鼠的影響黑暗期是老鼠自然進(jìn)食時間。因此，評估此時假定的致飽因素對非禁食動物的影響更具有生理學(xué)意義。
OXM對食物攝取的影響在實驗3a中，在黑暗早期注射時，注射一小時后，與注射鹽水的相比，GLP-1和OXM都顯著降低了進(jìn)食(圖3A)。
觀察ICV注射OXM后對行為的影響。
在黑暗早期，ICV給予OXM(3nmol)導(dǎo)致顯著降低進(jìn)食行為的發(fā)生(在實驗3a中已經(jīng)提到過)，并增加了飼養(yǎng)行為(在實驗3b中)(圖3B)。梳理毛發(fā)、靜止、低頭、挖洞或移動行為無變化。
為了評估OXM是否通過GLP-1受體發(fā)揮作用，用GLP-1受體拮抗劑——激動素-(9-39)作試驗。
ICV給藥 實驗4GLP-1受體拮抗劑—激動素-(9-39)和GLP-1以10∶1比率(拮抗劑/激動劑)的ICV給藥，阻斷了GLP-1的厭食作用(圖4A)。此外，激動素-(9-39)和OXM的共同給藥導(dǎo)致OXM的厭食作用減弱(圖4A)。
iPVN給藥與上述相似，當(dāng)iPVN注射后，GLP-1和OXM的厭食作用都被同時注射的激動素-(9-39)所阻斷(圖4B)。
受體結(jié)合實驗5GLP-1對老鼠下丘腦膜制備物中，GLP受體的親和力(IC50)是0.16nM(圖5)。OXM對同一制備物中，GLP-1受體的親和力是8.2nM(圖5)，大約比GLP-1弱兩個數(shù)量級。
討論當(dāng)注射ICV和iPVN，OXM對禁食所致的再進(jìn)食有強抑制作用。此種作用對于iPVN可持續(xù)8小時，對于ICV持續(xù)4小時。在ICV和iPVN的摩爾給藥量相同時，OXM的作用的量級和時間過程與GLP-1大致相同。此外，OXM能抑制黑暗期開始時非禁食老鼠攝取食物，此時老鼠沒有厭食行為癥狀。
研究提示胃粘膜上有OXM特異性結(jié)合位點。然而，在CNS沒有鑒定到這類結(jié)合位點。因此，推測OXM是通過下丘腦的GLP-1受體發(fā)揮作用，如同OXM和GLP-1在進(jìn)食研究中有相類似作用。已顯示OXM對GLP-1受體具有納摩爾親和力(IC50＝8.2nm)，大約比GLP-1的(IC50＝0.16nM)弱兩個數(shù)量級。盡管對GLP-1的親和力弱，但OXM降低食物攝取與GLP-1是同一個數(shù)量級。一種解釋是OXM可能通過下丘腦的GLP-1受體和自己的受體起作用。因此盡管其對GLP-1受體親和力低，OXM誘導(dǎo)的反應(yīng)比得上GLP-1的作用。
激動素-(9-39)是GLP-1受體拮抗劑激動素-4的一層段，是GLP-1受體的選擇性強拮抗劑。當(dāng)GLP-1和激動素-(9-39)共同注射時，GLP-1的厭食作用被阻斷。當(dāng)OXM和激動素-(9-39)共同注射時，OXM的厭食作用也完全被阻斷。這增強了OXM是通過GLP-1受體發(fā)揮作用的論點。
我們研究了在即刻ICV注射后，腸高血糖素和胰高血糖素對禁食老鼠的作用。給與這些多肽藥物后，沒發(fā)現(xiàn)對禁食所致食物攝取有影響。此外，當(dāng)iPVN給藥時，這些多肽也沒有作用。當(dāng)iPVN注射時，沒有觀察到SP-1，假定的OXM的最小活性結(jié)構(gòu)，對食物攝取有抑制作用。因此，觀察到的OXM作用是特異性的。
B外周OXM給藥也能導(dǎo)致食物攝取減少和體重減輕。
多肽和化學(xué)藥品
OXM購自IAF BioChem Pharma(Laval，Canada)。GLP-1購自半島實驗室(PeninsulaLaboratories Inc，St.Helens，UK)。激動素-(9-39)是在倫敦Hammersmith醫(yī)院止血單元藥物研究委員會(Medical Research Council Hemostasis Unit Clinical SciencesCentre Hammersimth Hospital London UK)中采用F-moc化學(xué)試劑在396 MPS多肽合成儀上合成，用反相HPLC C8柱(Phenomex Macclesfied，UK)純化，以0.1％三氟乙酸配的乙晴梯度為洗脫。正確的分子量通過質(zhì)譜證實。除非另有說明，所有化學(xué)試劑都是從Merck Eurolab Ltd(Lutterworth Leicestershire，UK)購買。
動物成年雄性Wistar老鼠(180-200g)在控制溫度(21-23℃)和光照(12小時光照，12小時黑暗)條件下，單籠飼養(yǎng)。它們能夠得到足量標(biāo)準(zhǔn)鼠食(RM1 diet，Special DietServices UK Ltd，Witham Essex，UK)和水。所有操作過程的進(jìn)行都得到英國內(nèi)務(wù)部動物處(British Home Office Animals)的批準(zhǔn)(科學(xué)操作)Act 1986(項目證號PPL90/1077，70/5281和70/5516)。
弓形核內(nèi)套管插入術(shù)立體定位給動物植入永久性留置的單側(cè)不銹鋼導(dǎo)入套管(Plastics One，Ronoke.VA)，植入到下丘腦的弓形核中。套管植入位置是前囪后3.3mm，和外側(cè)0.3mm及頭骨外表面向下9.0mm。
腹膜內(nèi)注射所有的腹膜內(nèi)注射用1ml注射器和25號針頭。注射體積根據(jù)各動物體重調(diào)整，最大注射量500μl。所有肽溶于生理鹽水中。
在這些研究中，所用的人OXM和人GLP-1的序列在上述第9頁提供。
體內(nèi)方案1.研究外周給藥OXM對禁食動物的食物攝取的劑量反應(yīng)影響在研究前，動物被禁食24小時。在光照初期(09.00-10.00時)，老鼠分別腹膜內(nèi)注射體積500μl的鹽水；GLP-1(30nmol/kg體重，作為陽性對照組)和OXM(10-300nmol kg體重)(n＝12/組)。注射后，動物返回自己的籠子，并提供已稱重的鼠食。測定注射后1，2，4，8，和24小時的攝食量。
2.研究外周給藥OXM對非禁食動物在黑暗期攝取食物的影響黑暗期是老鼠“正常”的攝取食物時間。因此，此時任何食物攝取的抑制可認(rèn)為比禁食后再攝食的變化更符合生理情況。熄燈前(18.00-19.00時)動物腹膜內(nèi)注射鹽水或OXM(3-100nmol/kg體重)(n＝12/組)。測定關(guān)燈后1，2，4，8和12小時的攝食量。
3.反復(fù)腹膜內(nèi)注射OXM的影響45只動物按體重隨機分成3組(每組15只)1)鹽水處理組，并隨時獲得充足食物，2)OXM(每次注射50nmol/kg體重，根據(jù)前面的劑量反應(yīng)試驗得出的劑量)處理組，并隨時獲得充足食物，3)鹽水處理，但白天食物受限制和OXM處理，夜晚攝取食物。動物每天注射兩次(07.00點和18.00時)持續(xù)7天。每天測量食物攝取量(g)，體重(g)和水?dāng)z取量(ml)。第八天，動物被斷頭處死。取出并稱重附睪白色脂肪組織(WAT)和肩胛間棕色脂肪組織(BAT)作身體肥胖評估。
4.研究外周給藥OXM對胃排空的影響動物禁食36小時，以確保胃是空的。光照早期段(09.00-10.00時)，動物被允許接觸足量的已稱重的標(biāo)準(zhǔn)鼠食30分鐘。此后，取出食物并再稱重。動物分別腹膜內(nèi)注射鹽水，OXM(50nmol/kg體重)和CCk-8(15nmol/kg體重)。與前述食物攝取實驗同樣時間，在取食1，2，4或8小時后，每時間段每組殺死12只老鼠。CCk-8組在這次實驗中僅作為2小時點的陽性對照。動物用二氧化碳窒息處死?？焖龠M(jìn)行腹腔手術(shù)，暴露胃。結(jié)扎幽門連接處(2.0Mersilk Johnson & Johnson，Belgium)，然后結(jié)扎胃和食管連接處，取出胃。然后取出胃內(nèi)容物，置于已稱重的容器中，空氣干燥48個小時。一旦干燥，稱重內(nèi)容物，在半個小時再進(jìn)食期間每只老鼠留存在胃內(nèi)的鼠食百分率用下面的公式計算％胃內(nèi)殘余食物＝(胃內(nèi)容物干重)/(攝取食物總重)×1005.研究增加OXM弓形核內(nèi)用藥劑量的影響按體重將弓形核內(nèi)(Intra-ARC(iARC))植入套管的老鼠隨機分成6組，每組12-15只。在光照初期(09.00-10.00點)，禁食24小時的老鼠分別接受鹽水OXM(劑量為0.01，0.03，0.1，0.3和1.0nmol)iARC注射。測定注射后1，2，4，8和24小時的攝食量。
6.研究OXM的外周給藥是否直接通過弓形核的GLP-1受體發(fā)揮作用將弓形核內(nèi)(Intra-ARC(iARC))植入套管的老鼠隨機分成6組(n＝10-12/組)。在光照初期(09.00-10.00時)，禁食24小時的老鼠接受鹽水或激動素-(9-39)(5nmol)弓形核內(nèi)套管注射，15分鐘后，腹膜內(nèi)分別注射鹽水，OXM(劑量為30nmol/kg體重)，或GLP-1(劑量為30nmol/kg體重)。注射的細(xì)節(jié)在下表1中描述。
表1分組 ARC內(nèi)注射 腹腔內(nèi)膜給藥1鹽水鹽水2鹽水OXM(30nmol/kg)3鹽水GLP-1(30nmol/kg)4激動素-(9-39)(5nmol)鹽水5激動素-(9-39)(5nmol)OXM(30nmol/kg)6激動素-(9-39)(5nmol)GLP-1(30nmol/kg)免疫組織化學(xué)腹膜內(nèi)分別注射OXM(50nmol/kg)，CCK(劑量為每公斤體重15nmol/kg)，或鹽水90分鐘后，最終被麻醉的老鼠先通過賁門灌注0.1M的磷酸緩沖鹽水(PBS)，然后灌注4％的甲醛磷酸緩沖液(PBF)。取出腦子放在甲醛磷酸緩沖液固定過夜，然后轉(zhuǎn)移到蔗糖磷酸緩沖液(20％w/v)過夜。在冷凍超薄切片機中，將腦和腦干切成40μm的冠狀切片；切片通過親和素—生物素—過氧化物酶方法染色觀察fos-樣免疫反應(yīng)(FLI)。然后，將切片固定在聚-L-賴氨酸覆蓋的載玻片上，以遞增濃度(50-100％)的乙醇脫水，在二甲苯中脫脂，用DPX儀蓋上蓋玻片。玻璃片用光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E-800)觀察FLI-陽性核，用顯徽攝像儀(Xillix Micro Imager)捕獲影像。下丘腦和腦干的FLI-陽性核的數(shù)目由不知道本實驗的研究小組的獨立成員計算。計算每張切片的FLI-陽性核平均數(shù)目，并以整數(shù)值表示各動物的熒光陽性核數(shù)目。
下丘腦外植體靜態(tài)培養(yǎng)一種靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。雄性Wistar老鼠脫頸椎處死并立刻取出整個腦子。固定此腦子作成標(biāo)本，腹側(cè)面朝上，放置在振蕩的顯微鏡切片機(Microfild Scientific Ltd.，Dartmouth，UK)上。從下丘腦基部切取1.7mm的切片，側(cè)面封閉于在Willis環(huán)(Circle of Willis)并在含有經(jīng)95％O2和5％CO2平衡的1ml人造腦脊液的小室(chambers)中培養(yǎng)。該下丘腦切片含有中間前視覺區(qū)，PVN(下丘腦室旁核)，背內(nèi)側(cè)核(dorsomedial nucleus)，腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial nucleus)，下丘腦外側(cè)核(lateral hypothalamic)和ARC。將這些試管放在平臺上，37℃恒溫水浴中。經(jīng)過最初2個小時平衡后，每個外植體用于測試期之前在600μl aCSF(人造腦脊液)中培養(yǎng)45分鐘(基礎(chǔ)期)。所用的100nM OXM，是其GLP-1受體IC50的十倍劑量。最后接觸含有56mMKCl的aCSF45分鐘證實了該組織的活力。在每次實驗期末取出aCSF并保存在-20℃直到用放射免疫試驗測定αMSH-免疫反應(yīng)的。
放射免疫試驗測定αMSH-IRαMSH用一種室內(nèi)放射性免疫試驗(in-house radioimmunoassay)來測定，采用Chemicon International Inc.的抗體。
統(tǒng)計學(xué)分析IP和iARC攝食實驗的數(shù)據(jù)用ANOVA和隨后進(jìn)行的LSD(最小顯著差異)檢驗作了分析。不同處理組的脂肪墊重量用非配對t檢驗分析。比較了下丘腦外植體培養(yǎng)實驗各外植體與其自身基礎(chǔ)期的數(shù)據(jù)，用配對t檢驗分析。在所有情況下，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
結(jié)果1.禁食動物OXM外周給藥的影響與鹽水對照組相比，OXM經(jīng)腹膜內(nèi)給藥(100和300nmol/kg)，導(dǎo)致禁食24小時動物注射后1小時再進(jìn)食的明顯抑制(1小時OXM為100nmol/kg，5.4±0.2g(P＜0.05)，300nmol/kg，4.5±0.2g(P＜0.05)；而鹽水為6.3±0.2g)。100nmol/kg OXM所引起的攝食量減少持續(xù)到注射后8小時。然而，最高劑量OXM(300nmol/kg)對進(jìn)食的明顯抑制作用持續(xù)到注射后24小時(24小時OXM 300nmol/kg，9.5±0.6g；而鹽水17.5±0.7g，P＜0.05)(圖6a)。在測定的任何時間點30nmol/kg和10nmol/kg的OXM不能改變攝食量。
2.外周給藥OXM對非禁食動物黑暗期攝食量的影響在黑暗期前，立刻注射對通夜進(jìn)食的老鼠，在實驗的任何時間點，3和10nmol/kg的OXM對其攝食量均無影響。但是，30nmol/kg的OXM對攝食量有明顯抑制作用持續(xù)至注射后2小時。(2小時OXM，30nmol/kg，為4.5±0.4g而鹽水5.8±0.4g，P＜0.05)。注射后4小時攝食量減少，但不明顯。在整個黑暗期，100nmol/kg的OXM對攝食量有明顯抑制(8小時OXM為100nmol/kg，14.1±0.8g；而鹽水為16.9±0.5g，P＜0.05)(圖6b)。
3.OXM反復(fù)腹腔注射(IP)給藥的作用每天兩次Ip注射OXM(50nmol/kg)共七天與注射鹽水的對照動物相比，引起了積累性的日進(jìn)食量明顯減少(第7天累積攝食OXM為50nmol/kg，168±4.6g；而鹽水為180±4.3g，P＜0.05)(圖7a)。此外，注射OXM的動物比鹽水相比，體重增加明顯減慢(第7天累計增重OXM為50nmol/kg，21.0±1.5g；而鹽水為37.6±1.9g，P＜0.005)。另外，限制食物的“配對喂養(yǎng)”動物增重不如注射OXM動物那樣慢，盡管得到了同樣的進(jìn)食量。(第7天配對喂養(yǎng)為33.5±2.0g，P＝NS；而鹽水(隨意喂食)為P＜0.05；相比于OXM)(圖7b)。此外，持續(xù)的OXM引起了肥胖癥的減少，這在注射鹽水的配對動物中沒有觀察到(表2)。OXM處理動物在實驗第一和第二天飲水明顯減少(第一天OXM，為24.1±1.28ml；而鹽水對照為28.1±1.33ml，P＜0.05)。在隨后的幾天中，與注射鹽水動物相比，日飲水量增加(第3-6天)。然而，第七天，鹽水和OXM處理組之間飲水量沒有區(qū)別(未顯示)。
表2組織/激素 鹽水 OXM配對喂養(yǎng)WAT 0.69±0.02 0.51±0.01a0.61±0.02bBAT 0.16±0.01 0.12±0.01a0.15±0.01b每天兩次腹腔注射(IP)鹽水或OXM(50nmol/kg)七天，對限制食物和隨意攝食老鼠附睪白色脂肪組織(epididymal WAT)和肩胛間棕色脂肪組織(interscapular BAT)增量的作用。
4.延遲胃排空對OXM厭食作用的影響給禁食36小時老鼠食物一小時后，GLP-1處理動物的胃內(nèi)容物干重(作為30分鐘喂食期食物消耗的百分比)明顯高于鹽水處理動物(1小時GLP-1為50nmol/kg，76.9±2.7g；而鹽水對照組為65.8±1.6g，P＜0.01)，提示GPL-1引起了明顯胃排空減少。OXM處理動物胃內(nèi)容物比鹽水處理對照動物多，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性(1小時OXM，50nmol/kg為72.0；而鹽水對照組為65.8±1.6g，P＜0.07)。喂食后兩小時，與鹽水處理動物相比OXM對胃內(nèi)容物沒有影響。但是，在此刻，注射陽性對照物CCK(15nmol/kg)的動物胃內(nèi)容物明顯高(2個小時CCK，15nmol/kg為64.7±6.4g而鹽水對照組為38.5g；P＜0.01)，提示CCK引起了胃排空速率明顯下降。與鹽水對照動物相比，喂食后4或8個小時，OXM對胃內(nèi)容物沒有影響(圖8)。
5.弓狀核內(nèi)注射劑量增加的OXM作用的研究24小時禁食后再進(jìn)食的第一個小時里，iARC給藥OXM的所有劑量(除了0.01nmoles外)都明顯抑制了進(jìn)食(1小時OXM 0.03nmoles，6.1±0.5g(P＜0.05)；0.1nmoles，5.6±0.4g(P＜0.05)；0.3nmoles，5.1±0.6g(P＜0.01)；1.0nmole，3.6±0.5g(P＜0.005)；而鹽水對照為7.7±0.2g)(圖9)。OXM 0.3和1.0nmoles對進(jìn)食的顯著抑制作用持續(xù)到注射后8小時。注射后二十四小時，OXM 1.0nmoles對進(jìn)食有抑制，盡管不明顯(24小時OXM 1.0nmole為37.8±3.0g；而鹽水對照對40.8±1.6g，P＝NS)。
6.對外周給藥OXM是否通過弓狀核GLP-1受體起作用的研究腹腔內(nèi)給藥GLP-1(30nmol/kg)或OXM(30nmole/kg)都能在進(jìn)入黑暗期一小時后明顯抑制進(jìn)食(1小時GLP-1為5.0±0.6g；OXM為5.1±0.4g；而鹽水對照為9.2±0.3g)。然而，預(yù)先給藥GLP-1受體拮抗劑-激動素9-39(300nmol/kg)，直接將其注射入ARC，阻斷了OXM腹腔給藥所致的厭食作用(表3和圖10)。腹腔內(nèi)注射GLP-1抑制進(jìn)食不受在先的激動素9-39的iARC給藥的影響。
表3肽 進(jìn)食S.E.M.
鹽水/鹽水9.2 0.3鹽水/GLP-1 5.0 0.6激動素9-39/*GLP-1 5.0 0.3鹽水/OXM 5.1 0.4激動素9-39/OXM 9.4 0.4激動素9-39/鹽水 9.0 0.3在OXM(30nmol/kg)，GLP-1(30nmol/kg)或鹽水的IP給藥前，激動素9-39(5nmole)iARC給藥或鹽水注射15分鐘對一小時攝食量(g)的影響。(S＝鹽水，G＝GLP-1(30nmol/kg)，Ox＝OXM(30nmol/kg)，Ex＝激動素9-39(5nmoles))。
7.繪制對IP OXM反應(yīng)中下丘腦的FLI表達(dá)圖在IP OXM(50nmol/kg)給藥后，幾乎只在下丘腦弓狀核中發(fā)現(xiàn)致密的FLI著色(圖11a)。其他下丘腦核(PVN(下丘腦室旁核)，DMH(下丘腦背內(nèi)側(cè)核)VMH(下丘腦腹內(nèi)側(cè)核))中均未顯示特異性的c狀溝(c-fos)著色。
在腦干中，IP CCK(15nmlo/kg)引起致密的FLI著色，大部分見于NTS(背側(cè)孤束核nucleus tractus solita)和后區(qū)(the area postrema)中(圖6b)。但是，在同一腦干核研究中，不論IP鹽水或IP OXM(50nmol/kg)均未引起特異性c-fos表達(dá)增加(圖11b)。
8.用OXM培育時下丘腦外植體釋放α-MSH的變化與基本釋放(basal release)相比，下丘腦外植體與OXM培育引起了α-MSH釋放的明顯增加(α-MSHOXM，100nM為4.1±0.6fmol/每個外植體；而基礎(chǔ)釋放為2.6±0.5fmol/每個外植體，P＜0.005)。外植體存活力通過在56mM KCl中培育評估，證實＞80％的外植體存活。將那些非存活(not viable)的外植體排除于此分析中。
討論OXM的外周給藥引起老鼠進(jìn)食減少。這可見于光照期禁食后和通過喂食期。厭食作用強并持續(xù)24小時。每天兩次腹腔注射OXM七天，與鹽水處理動物相比，日進(jìn)食減少，無快速減敏現(xiàn)象。OXM處理動物體重增加明顯少于配對喂養(yǎng)的動物，盡管兩組動物接收了相同的日攝取熱量。腹膜內(nèi)給藥OXM確實可以短暫減少水的攝取，盡管這個現(xiàn)象沒有持續(xù)；提示體重增加速率的降低并非由于脫水而致。
在總結(jié)長期研究時，取出附睪白色脂肪組織(epididymal WAT)和肩胛間棕色脂肪組織(interscapular BAT)并稱重。發(fā)現(xiàn)，與配對應(yīng)喂食的動物相比，盡管進(jìn)食量相同，OXM處理動物所有脂肪墊重量都有減少。因此看來外周OXM給藥也影響了其他新陳代謝參數(shù)。
過飽的一個主要作用是通過迷走神經(jīng)介導(dǎo)(vagally mediated)的可導(dǎo)致腦干活動的機制，過緩胃排空。GLP-1和OXM都是嚙齒動物和人胃排空的強抑制物，并且對GLP-1來說，認(rèn)為是其促使過飽的主要機制。我們推側(cè)OXM以同樣的方式起作用，并且它對胃排空的作用是引起持續(xù)厭食的原因。但是，盡管OXM外周給藥導(dǎo)致再給食后最初一個小時中胃排空輕微延遲，但這不明顯，而且作用是短暫的。這提示OXM確實能減緩胃排空，但它很可能不是造成強的持續(xù)進(jìn)食抑制的原因。
這里我們報告了OXM外周給藥幾乎只增加了ARC中的FLI。此外，我們發(fā)現(xiàn)用OXM培育下丘腦外植體引起了下丘腦外植體釋放POMC(阿片黑素皮素原pro-opiomelanocortin)-衍生產(chǎn)物——α-MSH增加。腹腔注射OXM不影響NTS和AP中的FLI表達(dá)——這些區(qū)域被認(rèn)為在整合迷走神經(jīng)介導(dǎo)的信號(vagally mediated information)中起重要作用，進(jìn)一步加強了關(guān)于OXM不是通過這些通路起作用的觀點。
據(jù)認(rèn)為腦干中的核是GLP-1作用的主要部位，隨后信號被傳遞到下丘腦PVN，在PVN介導(dǎo)了其厭食作用。OXM直接注射入ARC中，即使是很低的劑量都能引起強烈持久的進(jìn)食抑制作用，進(jìn)一步支持了ARC是OXM作用部位的推測。在ARC中預(yù)先給予激動素9-39阻斷了OXM外周給藥所引起的厭食作用。然而令人感興趣的是，GLP-1外周給藥無厭食作用。這些發(fā)現(xiàn)強有力表明OXM通過ARC中的GLP-1受體起作用。此外，還鑒定到介導(dǎo)GLP-1和OXM作用的不同通路。
綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示OXM在長期和短期調(diào)節(jié)進(jìn)食和體重維持中有潛在的重要性。勝于“傳統(tǒng)”的通過飽食通路來減少食欲，包括減緩胃排空和激活腦干核，循環(huán)性O(shè)XM通過直接與ARC相互作用——可能是激活此核中的POMC阿片里季皮質(zhì)原神經(jīng)元——而介導(dǎo)其厭食作用。因此，OXM可用于治療或預(yù)防哺乳動物肥胖等體重過重，并且為開發(fā)治療哺乳動物肥胖等體重過重治療藥物提供了一個新的目標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療哺乳動物體重過重的含有胃腸激素的合成物。
2.如權(quán)利要求1所述的含有胃腸激素的合成物，其特征在于，所述體重過重指肥胖癥。
3.如權(quán)利要求1或2所述的含有胃腸激素的合成物，其特征在于，所述合成物與藥藥學(xué)上可接受的賦形劑結(jié)合使用。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的含有胃腸激素的合成物，其特征在于，該合成物為液體，固體或半固體形式。
5.如權(quán)利要求1-4中任何一項所述的含有胃腸激素的合成物，其特征在于，所述哺乳動物是人。
6.一種預(yù)防和治療哺乳動物體重過重的方法，該方法包括給予哺乳動物含胃腸激素的合成物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述體重過重指肥胖癥。
8.一種美體性哺乳動物減重方法，所述方法包括給予哺乳動物含胃腸激素的所述合成物。
9.如權(quán)利要求6-8中任何一項所述的方法，其特征在于，所述合成物包含胃腸激素和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
10.如權(quán)利要求6-9中任何一項所述的方法，其特征在于，所述減重是減少食物攝入量的結(jié)果。
11.胃腸激素在制造用于預(yù)防和治療體重過重的藥物中的用途。
12.胃腸激素在鑒定抑制哺乳動物進(jìn)食的藥物中的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述用途利用了胃腸激素的功能和/或結(jié)構(gòu)特征。
14.如權(quán)利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述用途利用了胃腸激素的電子構(gòu)建模型。
15.如權(quán)利要求12-14中任何一項所述的用途，其特征在于，所述胃腸激素的特征是其一級、二級、三級結(jié)構(gòu)藥效基團和/或X-射線晶體結(jié)構(gòu)。
16.一種如此前描述的實施例中的用于預(yù)防和治療哺乳動物體重過重的含有胃腸激素的合成物。
17.一種預(yù)防和治療哺乳動物體重過重的方法，該方法的描述參見實施例。
全文摘要
本發(fā)明涉及防止和治療哺乳動物體重過重的合成物和使用方法。該合成物含有顯示出減少食物攝取的胃腸激素。
文檔編號A61P3/04GK1551780SQ02817279
公開日2004年12月1日 申請日期2002年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者斯蒂芬·羅伯特·布魯, 穆罕默德·阿里·加特, 卡羅琳·簡·斯墨爾, 凱瑟琳·路易絲·達(dá)金, 簡 斯墨爾, 路易絲 達(dá)金, 德 阿里 加特, 斯蒂芬 羅伯特 布魯 申請人:皇家學(xué)院創(chuàng)新有限公司