專利名稱：高分子量凝集素的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備高分子量凝集素組合物的方法，特別包括甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)，適于使用重組制備的凝集素作為起始物，高分子量凝集素組合物，及包含其的藥用組合物，以及所制備的組合物在制備治療多種疾病的藥用組合物中的用途。
背景技術(shù)：
甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)是一種蛋白質(zhì)，其可作為替換劑或替代療法而用于具有功能性和/或臨床癥狀的遺傳性或獲得性MBL缺陷的患者。
MBL是屬于膠原凝集素(collectin)家族的蛋白質(zhì)，其特征是亞基的低聚物結(jié)構(gòu)，每一亞基都包含鈣依賴性，C-型碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，附于膠原柱上。MBL經(jīng)由相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASP-甘露糖結(jié)合型凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin associated serineproteases))，即通過與C1q相似的機(jī)制激活補(bǔ)體系統(tǒng)。
源自人血漿的MBL被組裝成亞基的寡聚體，每一亞基都含有三個(gè)相同的多肽鏈。MBL分子中的亞基數(shù)量各異(Lipscombe RJ，et al由不同基因型的個(gè)體表達(dá)的人類甘露糖結(jié)合型蛋白的物化特性的差異，Immunology 85(1995)660-667.)。已有證據(jù)顯示，生物活性多肽為包含三個(gè)以上亞基的寡聚體。血漿包含三個(gè)亞基以上的寡聚體以及變性和結(jié)構(gòu)受損的蛋白，其在如SDS凝膠上形成的條帶處在較高寡聚體相應(yīng)的主要MBL條帶之間。
重組來源的MBL顯示出與血漿來源的MBL相似的寡聚體變化(Vorup-Jensen T等人甘露糖結(jié)合型凝集素的重組表達(dá)，Int Immunopharm1(2001)677-687)。但是，通常重組制備的MBL的低分子量形態(tài)的含量要高于血漿來源的MBL。MBL的低分子量形態(tài)包括，例如單多肽鏈、單亞基和亞基二聚體。
PCT申請WO00/70043公開了一種從低分子量形態(tài)中分離高寡聚體的方法，其中重組來源的MBL用特殊柱子進(jìn)行分級。
本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了含蛋白質(zhì)分級組分的沉淀方法。例如在Storgaard P，Nielsen EH，Andersen O，Skriver E，Mortensen H，HojrupP，Leslie G，Holmskow U，Svehag SE.不同大小和超微結(jié)構(gòu)的豬甘露糖結(jié)合型蛋白質(zhì)的分離和定性。Scand J Immunol 1996；43289-96中就公開了從豬血清中分離MBL的方法，其中使用PEG沉淀方法純化MBPs，在甘露糖瓊脂糖凝膠、蛋白A-和抗豬IgM-瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和層析，隨后凝膠過濾。
WO99/64453公開了通過使用乙醇沉淀對血漿進(jìn)行Cohn分級。所得到的分級組分包含其它分子MBL。
發(fā)明概述從溶液快速而簡便的分離凝集素，如甘露糖結(jié)合型凝集素或其衍生物和變體(在此統(tǒng)稱為凝集素)的方法是非常重要的。
而且，控制凝集素的質(zhì)量分布也是非常重要的，因?yàn)樗瞿囟嚯牡牟煌丫垠w具有不同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明公開了一種通過在溶液中加入沉淀劑導(dǎo)致沉淀來分離凝集素，如MBL的方法。該方法可作為所述多肽的制備、純化和/或配方過程中的單位操作步驟。與其它方法相比，其優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明所述方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)換所述多肽寡聚體的組合物，以便所述多肽的高分子量寡聚體從所述多肽的低分子量寡聚體中分離出來。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及變更溶液中凝集素寡聚體分布的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及增加包含多種凝集素分子的組合物的比率R的方法，其中R為分子量高于二聚體凝集素(dimer lectin)分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含低分子量凝集素和高分子量凝集素，所述制劑的比率R＝R0，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選重懸所述沉淀部分獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
因此最終獲得的組合物與起始物質(zhì)相比，前者包括含量增高的高分子量凝集素寡聚體。
這一比率的增加特別地導(dǎo)致組合物包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及生產(chǎn)包含多種凝集素分子的組合物，其中所述凝集素分子基本上全部具有高于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選重懸所述沉淀部分獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
由于本發(fā)明的起始物質(zhì)包含高分子量凝集素以及低分子量凝集素，本發(fā)明還涉及從包含高于二聚體凝集素分子量的高分子量凝集素分子和低于或等于二聚體凝集素分子量的低分子量凝集素分子的凝集素制劑中分離包含多種凝集素分子的組合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全都具有高于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，所述方法包括，獲得所述凝集素制劑，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選重懸所述沉淀部分獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
對大多數(shù)目的來說，高分子量凝集素(high mass lectins)是必需的，但是對某些應(yīng)用來說，則需要低分子量凝集素，相應(yīng)的，本發(fā)明更進(jìn)一步涉及生產(chǎn)包含多種凝集素分子的組合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有低于或等于二聚體凝集素的低分子量，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出沉淀，獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選地獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，獲得含有上清部分凝集素分子的組合物。
對于上述全部方法來說，優(yōu)選的，沉淀部分的比率R＝R1，其中R1至少為1，如至少為1.05，如至少為1.10，如至少為1.15，如至少為1.25，如至少為1.50，如至少為1.75，如至少為2.0，如至少為2.5，如至少為3.0，如至少為4.0，如至少為5.0，如至少為6.0，如至少為7.0，如至少為8.0，如至少為9.0，如至少為10.0，如至少為15，如至少為20，如至少為30，如至少為40，如至少為50，如至少為60，如至少為70，如至少為80，如至少為90，如至少為100，如至少為100，如至少為1000，如至少為10000。
對于上述公開的全部方法，R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中R為分子量高于三聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于三聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率。
根據(jù)本發(fā)明的凝集素，可為任意凝集素，其中被制成幾種低聚物形式，如甘露糖結(jié)合型凝集素。特別的，本發(fā)明涉及生產(chǎn)MBL組合物的方法。MBL該術(shù)語意指甘露糖結(jié)合型凝集素(或者甘露糖結(jié)合型蛋白，如某些作者所稱)。MBL優(yōu)選為人類MBL，其具有如PCT申請WO00/70043中所示的蛋白質(zhì)序列或其與MBL功能等價(jià)的衍生物或變體。本發(fā)明將在下面描述凝集素MBL的相關(guān)內(nèi)容。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其允許處于探討中的凝集素大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及任何包含在生產(chǎn)所述MBL的過程中應(yīng)用所述方法的商業(yè)化或大規(guī)模生產(chǎn)MBL的方法。


圖1.使用抗血漿來源的MBL的HYB131-01的SDS-PAGE Western。P＝血漿來源的MBL；1＝使用本發(fā)明之前的重組來源的MBL；3＝使用本發(fā)明之后的重組來源的MBL。
圖2.使用抗血漿來源的MBL的HYB131-01的SDS-PAGE Western。左免疫印跡，右印跡的光密度分析(Scion Software)。樣品1＝使用本發(fā)明之前的重組來源的MBL(R＝6)；該例中主條帶的分子量為(從右向左)47kDa，160kDa，230kDa，290kDa，330kDa和365kDa(肩)。
2＝使用本發(fā)明的重組來源的MBL(上清)(R＝0)；該例中主條帶的分子量為(從右向左)47kDa和160kDa。3＝使用本發(fā)明的重組來源的MBL(沉淀)(R＞＞1000)；該例中主條帶的分子量為(從右向左)230kDa，290kDa，330kDa和365kDa(肩)和400-600kDa。
圖3.MBL在3L HyQ培養(yǎng)基中的沉淀。左沉淀前的培養(yǎng)基。中剛加入沉淀劑后的培養(yǎng)基。右加入沉淀劑40分鐘后的培養(yǎng)基。
圖4.使用BioAnalyzer系統(tǒng)計(jì)算樣品的R值。左熒光染色凝膠(Agilent標(biāo)準(zhǔn)方法，L＝marker ladder)。右樣品1和3的整合峰值(箭頭所指為計(jì)算R的整合峰值)。樣品1和2＝高分子量形態(tài)占優(yōu)的重組來源的MBL(R＝19)。3和4＝低分子量形態(tài)占優(yōu)的重組來源的MBL(R＝0.2)。
發(fā)明詳述此處使用的比率R可通過使用任何適用的方法進(jìn)行計(jì)算。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中對一個(gè)樣品中R值的數(shù)值估算可通過如下方法進(jìn)行將SDS-PAGE免疫印記掃描為TIFF文件格式，或另一非壓縮的位圖文件格式。通過使用圖象處理程序，例如Scion Image for Windows 4.0(Scion公司，www.scioncorp.com上的beta版免費(fèi)軟件)，測定樣品條帶的像素密度，然后輸出至數(shù)據(jù)處理程序(如Excel)。
用標(biāo)記(markers)(蛋白質(zhì)精度標(biāo)準(zhǔn)，BioRad)的遷移確定二聚體凝集素的相應(yīng)遷移。高于參照遷移位點(diǎn)(對應(yīng)MBL 200kDa)的全部像素信號除以低于參照遷移位點(diǎn)(對應(yīng)MBL 200kDa)的全部像素信號而得到R值。R0被定義為起始物質(zhì)的比率，而R1為沿沉淀樣品相應(yīng)估算線的比率。
測算比率R的另一方法為使用基于芯片的電泳系統(tǒng)作為BioAnalyzer系統(tǒng)(獲自Agilent)。這里，波峰區(qū)域的整合作為標(biāo)準(zhǔn)估算步驟的一部分而完成。
沉淀劑本發(fā)明的中心方面為能夠通過沉淀包含低分子量和高分子量兩種形式的MBL制劑中分離低分子量和高分子量形式的MBL。術(shù)語“沉淀劑(precipitating agent)”的詞義與本文中的術(shù)語“沉淀劑(precipitant)”的詞義相同。沉淀劑可以是任一種基本上非變性，水溶性蛋白質(zhì)沉淀劑，這類沉淀劑中的很多種在蛋白質(zhì)純化技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，沉淀劑可以是高分子量沉淀劑，例如PEG，其分子量例如為200Da、300Da、400Da、550Da、600Da、1,000Da、1,450Da、1,500Da、2,000Da、3,000Da、3,350Da、4,000Da、6,000Da、8,000Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da和35,000Da，以及PEG與另一化合物，例如與PEG自身或蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)合物，其多為商業(yè)上可獲得的PEG組合物。
但是優(yōu)選的沉淀劑為低分子量沉淀劑。低分子量沉淀劑的實(shí)例為硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、磷酸鈉和氯化鈉。有效陰離子沉淀劑的實(shí)例為銨離子(NH4+)，鈉離子(Na+)，鉀離子(K+)和銫離子(Cs+)。有效陽離子沉淀劑的實(shí)例為硫酸根離子(SO42-)，磷酸根離子(PO43-)，和乙酸根離子(CH2COO-)。
因此在一個(gè)實(shí)施方案中，沉淀劑選自陽離子沉淀劑。沉淀劑可選自包含Ca2+的試劑，如CaCl2，氯化鈣(CaCl2，CaCl2.H2O，CaCl2.2H2O，CaCl2.6H2O)，硝酸鈣(Ca(NO3)2，Ca(NO3)2.3H2O，Ca(NO3)2.4H2O)，亞硝酸鈣(Ca(NO2)2.H2O，Ca(NO2)2.4H2O)，碘化鈣(CaI2，CaI2.6H2O)，溴化鈣(CaBr2，CaBr2.6H2O)，溴酸鹽(Ca(BrO3)2.H2O)，氯酸鈣(Ca(ClO3)2，Ca(ClO3)2.2H2O，(Ca(ClO4)2)，鉻酸鈣(CaCrO4.2H2O)，高錳酸鈣(Ca(MnO4)2.5H2O)，次磷酸鈣(Ca(H2PO2)2)，鈣鐵氰化物(Ca3[Fe(CN)6]2.12H2O，Ca2Fe(CN)6.12H2O)，硫代硫酸鈣(CaS2O3.6H2O)，以及如低溶解含鈣劑，如甲酸鈣(Ca(CHO2)2)，甲酸鈣(Ca(C2H3O2)2，Ca(C2H3O2)2.H2O，Ca(C2H3O2)2.2H2O)，丙酸鈣(Ca(C3H5O2)2.H2O)，乳酸鈣(Ca(C3H5O3)2.5H2O)，馬來酸鈣(CaC4H2O4.H2O)，戊酸鈣(Ca(C5H9O2)2)和枸櫞酸鈣(Ca3(C6H5O7)2.4H2O)。
加入的陽離子沉淀劑優(yōu)選的濃度范圍為0.001M至于5.0M，如0.01M至5.0M、如0.05M至2.5M、如0.01M至2.5M、例如0.1M至2.0M、如0.1M至1.0M。
在另一實(shí)施方案中沉淀劑選自陰離子沉淀劑。陰離子沉淀劑可選自陰離子，如磷酸鹽、碳酸鹽和硫酸鹽。
沉淀劑的反離子可存在于制劑的溶劑中或在加入沉淀劑之前、同時(shí)或之后加入。關(guān)于陽離子沉淀劑，制劑優(yōu)選地包含選自碳酸鹽、硫酸鹽和/或磷酸鹽，優(yōu)選磷酸鹽的陰離子。
從上清中分離沉淀可由任意的適用方法進(jìn)行，優(yōu)選過濾或離心。
制劑可包含溶劑，如選自來自培養(yǎng)罐的液體培養(yǎng)基、來自純化過程的液體中間產(chǎn)物、液體方劑、任何緩沖液或純水。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶劑是培養(yǎng)基，由此該方法可在培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)MBL后直接實(shí)施于液體培養(yǎng)基，任選地先于過濾步驟。
沉淀一經(jīng)形成，即可通過任何適用的步驟，特別是適用于大規(guī)模生產(chǎn)的步驟從上清中分離出來?？梢圆捎梦龢悠飞锨咫S后離心的方法進(jìn)行分離。因此本發(fā)明的另一優(yōu)勢顯示了，即發(fā)酵產(chǎn)生的大量水可以在基本上不丟失相關(guān)MBL的情況下而被去除。而且，如上述包含低分子量分子的上清可被進(jìn)一步作為樣品以通過層析法獲取MBL分子。
沉淀可在任何能使所形成的沉淀穩(wěn)定存在的pH值下產(chǎn)生。pH的范圍一般為2＜pH＜11，如pH＝3、如pH＝4、如pH＝5、如pH＝6、如pH＝7、如pH＝8、如pH＝9、如pH＝10。
沉淀可在任何能使所形成的沉淀穩(wěn)定存在的溫度下產(chǎn)生。溫度設(shè)置范圍為0℃＜溫度＜80℃，如4℃、如10℃、如15℃、如20℃、如25℃、如30℃、如35℃、如40℃、如50℃、如60℃、如70℃，但是沉淀一般在室溫下進(jìn)行。
沉淀劑優(yōu)選地選自那些能使沉淀在數(shù)日內(nèi)、優(yōu)選為數(shù)小時(shí)、優(yōu)選為30分鐘內(nèi)完成的沉淀劑。
通過使用Novex系統(tǒng)和商業(yè)可獲得的凝膠(NuPAGE 3-8％ Tris-Acetate，Invitrogen)，用SDS-PAGE測定本文所提及的分子量。使用商業(yè)可獲得的MBL特異性抗體(Hyb131-01，Statens Serum Institute，Copenhagen)的免疫印記驗(yàn)證MBL。采用基于BioRad蛋白質(zhì)精度標(biāo)準(zhǔn)(BioRad161-0362)的標(biāo)準(zhǔn)曲線插入法，通過繪制In(遷移)對分子量的圖來估算Hyb131-01主條帶分子量。
組合物比率R的增加度依賴于比率為R0的起始物質(zhì)，該起始物質(zhì)為MBL制劑。優(yōu)選地，組合物中至少50摩爾％的MBL的分子量高于二聚體凝集素的分子量，優(yōu)選地高于三聚體凝集素的分子量。因此，優(yōu)選地，組合物中至少50摩爾％的MBL的分子量高于200kDa、如高于225kDa、如高于250kDa、如高于300kDa。
術(shù)語“摩爾％”意指組合物中MBL多肽鏈的相對摩爾量。但是，摩爾％還可表示每個(gè)包含三個(gè)MBL多肽的MBL亞基的相對摩爾量。或者，此處所使用的百分?jǐn)?shù)可被換算為重量百分?jǐn)?shù)(％(w/w))。為清楚起見，此處使用的百分?jǐn)?shù)是與MBL多肽鏈相關(guān)的“摩爾％”，但是同一百分?jǐn)?shù)無論表示為與MBL多肽鏈相關(guān)的“摩爾％”還是表示為重量百分?jǐn)?shù)都是相同的。
通過本發(fā)明獲得的MBL似乎可提供僅包含寡聚體的級分，而不包含變性和/或結(jié)構(gòu)受損的MBL分子，該分子通常見于血漿MBL，因?yàn)镾DS-PAGE上的條帶基本上對應(yīng)于如下一個(gè)或多個(gè)級別范圍內(nèi)的分子級別I的分子量范圍為200kDa至270kDa，(優(yōu)選包含二聚體和/或三聚體)，級別II的分子量范圍為270kDa至300kDa，(優(yōu)選包含三聚體和/或四聚體)，級別III的分子量范圍為300kDa至400kDa，(優(yōu)選包含四聚體和/或五聚體)，和級別IV的分子量范圍為400kDa至600kDa，(優(yōu)選包含五聚體和/或更高的寡聚體)，所述分子量用SDS-PAGE測定，其中級別I的MBL占組合物中MBL總量的0-20摩爾％，如0-10摩爾％、如0-5摩爾％、如0-2摩爾％、如0-1摩爾％、如0至小于0.5摩爾％、如0至小于0.1摩爾％、如0至小于0.01摩爾％、如0至小于0.001摩爾％、如0.1-20摩爾％、如0.1-10摩爾％、如0.1-5摩爾％、如0.1-2摩爾％、如0.1-1摩爾％、如0.1至小于0.5摩爾％、如0.1至小于0.4摩爾％、如0.1至小于0.3摩爾％、如0.1至小于0.2摩爾％優(yōu)選地，MBL組合物包含屬于至少兩個(gè)級別的分子，如屬于至少三個(gè)級別的分子，更優(yōu)選地，屬于四個(gè)級別的分子。
此處所提及的高于某優(yōu)選地包含某MBL寡聚體的級別時(shí)，并非意指除外那些指特定級別的寡聚體以外的寡聚體也不能被采用。但是，并非用理論進(jìn)行限制而根據(jù)一個(gè)現(xiàn)在優(yōu)選的假說，上面列出的寡聚體被認(rèn)為主要出現(xiàn)在描述其的級別中。
“基本上相關(guān)”意指具有高于600kDa分子量的少量MBL分子可被采用，如低于10摩爾％的較少量、如低于5摩爾％的較少量。此外，“基本上”同樣是指每一級別中所述分子量的任何5％內(nèi)的偏差、如2％、如1％、如0.5％、如小于0.1％。
更優(yōu)選地，級別I的MBL占組合物中MBL總量的0.1-15摩爾％，如占組合物中MBL總量的0.1-12摩爾％、占組合物中MBL總量的0.1-10摩爾％、如占組合物中MBL總量的0.1-5摩爾％。
優(yōu)選地，級別II的MBL占組合物中MBL總量的0-50摩爾％、如級別II的MBL占組合物中MBL總量的0-30摩爾％、如級別II的MBL占組合物中MBL總量的5-30摩爾％、如級別II的MBL占組合物中MBL總量的10-30摩爾％。
優(yōu)選地，級別III的MBL占組合物中MBL總量的0-60摩爾％、如級別III的MBL占組合物中MBL總量的10-60摩爾％、如級別III的MBL占組合物中MBL總量的20-60摩爾％、如級別III的MBL占組合物中MBL總量的20-50摩爾％。
優(yōu)選地，級別IV的MBL占組合物中MBL總量的0-50摩爾％、如級別IV的MBL占組合物中MBL總量的0-30摩爾％、如級別IV的MBL占組合物中MBL總量的5-30摩爾％、如級別IV的MBL占組合物中MBL總量的10-30摩爾％。
在優(yōu)選實(shí)施方案中通過本發(fā)明獲得的組合物包含級別I的MBL的量為0-5摩爾％，級別II的MBL的量為10-30摩爾％，級別III的MBL的量為20-50摩爾％，和級別IV的MBL的量為10-30摩爾％、如級別I的MBL的量為0-5摩爾％，級別II的MBL的量為15-30摩爾％，級別III的MBL的量為20-50摩爾％，和級別IV的MBL的量為15-30摩爾％、如級別I的MBL的量為0-5摩爾％，級別II的MBL的量為20-30摩爾％，級別III的MBL的量為20-50摩爾％，和級別IV的MBL的量為20-30摩爾％、如級別I的MBL的量為0-5摩爾％，級別II的MBL的量為20-30摩爾％，級別III的MBL的量為30-50摩爾％，和級別IV的MBL的量為20-30摩爾％。
對于上述組合物，級別I的MBL可以不存在和存在量為例如0.1摩爾％、如0.2摩爾％、如0.4摩爾％、如約1摩爾％、如約2摩爾％、如約3摩爾％、如約4摩爾％?！凹s”應(yīng)被理解為指級別I的MBL量的任何低于5％、如2％、如1％、如0.5％、如小于0.1％的誤差。
在優(yōu)選實(shí)施方案中對級別的定義如下級別I的分子量范圍為200kDa至260kDa，級別II的分子量范圍為270kDa至300kDa，級別III的分子量范圍為310kDa至390kDa，和級別IV的分子量范圍為400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE測定，測定級別I至IV每一級的MBL的百分比是通過如前述測定比率R的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種獲得包含選自高分子量MBL和低分子量MBL的組合物的方法，其中所述組合物包含少于20摩爾％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于300kDa。
因此，本發(fā)明還涉及包含高分子量MBL和低分子量MBL的組合物，其中所述組合物包含少于20摩爾％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于300kDa。
因此，本發(fā)明還提供了上述的方法和組合物，其中低分子量MBL的含量少于10摩爾％、如少于5摩爾％、如小于2摩爾％、如小于1摩爾％、如小于0.1摩爾％、如小于0.01摩爾％、如小于0.001摩爾％；以及任一前述組合物，其中所述低分子量MBL優(yōu)選地具有小于300kDa的分子量、如小于290kDa、如小于285kDa、如小于280kDa、如小于275kDa、如小于270kDa、如小于265kDa、如小于260kDa、如小于255kDa、如小于250kDa、如小于245kDa、如小于240kDa、如小于235kDa、如小于230kDa、如小于225kDa、如小于220kDa、如小于215kDa、如小于210kDa、如小于205kDa、如小于200kDa。
通過按照本發(fā)明生產(chǎn)MBL組合物，該MBL組合物基本上不含在任何當(dāng)在天然宿主生物如血漿MBL中產(chǎn)生時(shí)與MBL天然相關(guān)聯(lián)的雜質(zhì)。
本發(fā)明可用于從任何MBL來源如任何哺乳動(dòng)物重組MBL中，生產(chǎn)高分子量MBL組合物。但是優(yōu)選地，組合物的MBL為人源的，其中MBL亞基由三個(gè)肽序列構(gòu)成，所述序列包含如PCT申請WO00/70043中SEQ ID NO1所示的序列或其功能等效體。
在本發(fā)明的一個(gè)更進(jìn)一步的方面，高及低分子量MBL的兩個(gè)純化部分，可分別以任意每一分級組分所需比率而被合并。
重組生產(chǎn)雖然本方法可應(yīng)用于任何含有低和高分子量MBL的MBL起始物質(zhì)，但其特別適用于從重組生產(chǎn)的制品中生產(chǎn)高分子量MBL。
因此MBL制劑優(yōu)選為重組制品，其中MBL制劑獲自-制備編碼人MBL肽或其功能等效體的基因表達(dá)構(gòu)建體，-將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，-在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而使所述多肽表達(dá)并將其分泌到培養(yǎng)基中，-獲得包含多種MBL分子的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，MBL基因序列可來自人MBL基因或來自其它動(dòng)物種類的MBL基因，其中該動(dòng)物的免疫系統(tǒng)行為在這個(gè)方面與人類免疫系統(tǒng)相似。根據(jù)本發(fā)明的重組MBL制劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例已經(jīng)公開于PCT申請WO00/70043的實(shí)施方案1中，此處引用該申請作為參考。在實(shí)例中，通過利用含人MBL基因序列的表達(dá)載體來制備該重組MBL。
本發(fā)明還涉及表達(dá)載體的應(yīng)用，該載體包含人MBL基因序列的功能性衍生序列。所述功能性衍生序列是指包含不導(dǎo)致或基本上不導(dǎo)致表達(dá)載體功能差異的堿基對變化的序列，并且這種方式制備的MBL的功能與用含沒有變化的人MBL基因序列的表達(dá)載體所制備的MBL相當(dāng)。
除了純化方法以外，優(yōu)選基因表達(dá)構(gòu)建體和宿主細(xì)胞也有利于產(chǎn)生較高寡聚體。因此，基因表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選包含人MBL基因或其功能等效體的至少一個(gè)內(nèi)含子序列。而且所述基因表達(dá)構(gòu)建體可以包含人MBL基因或其功能等效體的至少兩個(gè)外顯子序列。更優(yōu)選基因表達(dá)構(gòu)建體包含人MBL基因或其功能等效體的至少三個(gè)外顯子序列。當(dāng)包含多于一個(gè)外顯子的時(shí)候，外顯子序列的排列優(yōu)選與人MBL基因中的相同。
雖然優(yōu)選在該序列中包含內(nèi)含子序列，但表達(dá)構(gòu)建體包括編碼MBL亞單位或其功能等效體的cDNA序列，對于一些應(yīng)用可能是方便的。
本發(fā)明的特點(diǎn)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中應(yīng)用MBL基因表達(dá)構(gòu)建體而不是MBL cDNA構(gòu)建體來表達(dá)rMBL，獲得在非變性和變性條件下具有與天然人MBL基本上相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的重組MBL?！爸亟M人MBL”是指由基因工程化核酸表達(dá)的人MBL，而“MBL基因表達(dá)構(gòu)建體”是指適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的表達(dá)載體，其包含人MBL基因或其它動(dòng)物MBL基因的外顯子序列和至少一個(gè)內(nèi)含子序列，所述其它動(dòng)物包括但不限于黑像猩猩和恒河猴(rhesus monkeys)。
優(yōu)選所述DNA序列編碼SEQ ID NO1所示多肽序列或如上限定的其功能等效序列。SEQ ID NO1數(shù)據(jù)庫登記號為P11226的MBL序列。所述等效序列可以通過修飾SEQ ID NO1所示多肽序列而獲得，如具有對應(yīng)于本發(fā)明上述序列的特點(diǎn)，但其中一或多個(gè)氨基酸已被具有相似特性的其它氨基酸替代的序列。功能性等效序列優(yōu)選包括保守替代，即一個(gè)或多個(gè)氨基酸被具有相似特點(diǎn)的氨基酸替代，使蛋白化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)測未改變的蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。適用于保守替代的氨基酸包括那些具有功能上相似的側(cè)鏈的氨基酸。例如，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸等疏水性殘基可以替代另一個(gè)這樣的殘基。同樣，保守替代可以包括親水性殘基(例如精氨酸和賴氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，蘇氨酸和絲氨酸)之間，堿性殘基(賴氨酸、精氨酸和組胺酸)之間和/或酸性殘基(例如天冬氨酸和谷氨酸)之間的互換。只要能保持所述多肽的功能，還(或者)可以通過氨基酸的缺失或插入或者氨基酸的化學(xué)修飾對功能等效序列進(jìn)行修飾。
包括MBL的任何功能等效體的分離的MBL肽，在一個(gè)實(shí)施方案中包括至少80個(gè)氨基酸殘基，如至少100個(gè)氨基酸殘基，如至少150個(gè)氨基酸殘基，如至少200個(gè)氨基酸殘基，如至少220個(gè)氨基酸殘基，如至少250個(gè)氨基酸殘基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)，其包括人MBL基因或其它動(dòng)物MBL基因的外顯子序列和至少一個(gè)內(nèi)含子序列，所述動(dòng)物包括但不限于黑猩猩和恒河猴。在一個(gè)實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中進(jìn)行培養(yǎng)。在本文中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指經(jīng)遺傳修飾而包含并表達(dá)人MBL基因或其片段或其類似物的動(dòng)物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體包括病毒載體，例如DNA病毒載體，RNA病毒載體或嵌合病毒載體。DNA病毒的實(shí)例包括巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、猴病毒40、牛乳頭病毒、腺伴隨病毒、腺病毒、痘苗病毒和Baculo病毒。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在將腺病毒作為表達(dá)載體情況中，可以將本發(fā)明的核酸分子連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合物，例如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列上。然后通過體外和體內(nèi)重組將這個(gè)嵌合基因插入腺病毒基因組。在病毒基因組非必須區(qū)(如E1或E2)中的插入將得到可在被感染的宿主細(xì)胞中存活并表達(dá)MASP-3基因產(chǎn)物的重組病毒(例如參見Logan和Shenk，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)813655-3659，1984)。為了有效翻譯所插入的核酸分子，還需要特異性起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子及鄰近序列。在將包括其本身的起始密碼子及其鄰近序列的整個(gè)基因和cDNA插入到表達(dá)載體的情況中，不需要額外的翻譯調(diào)控信號。然而，在僅插入編碼序列的情況中，必須提供包括如ATG起始子在內(nèi)的外源翻譯調(diào)控信號。而且，起始密碼子必須于目的編碼序列的閱讀框相協(xié)調(diào)，以保證整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源翻譯調(diào)控信號和起始密碼子可以來自各種來源，既可以是天然的也可以是合成的。通過包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等，可以提高表達(dá)效率(參見Bittner等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymol).153516-544，1987)。
RNA病毒的實(shí)例包括塞姆利基(Semliki)森林病毒、新培斯(Sindbis)病毒、Poko病毒、狂犬病病毒、流感病毒、SV5、呼吸道合胞病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、Kunjin病毒、仙臺病毒、水泡性口炎病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
嵌合病毒的實(shí)例包括腺病毒、新培斯(Sindbis)病毒和腺病毒-腺伴隨病毒。
有關(guān)特異性載體參見Makrides，S.C.，“用于基因轉(zhuǎn)移和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體的組成(Components of vectors for Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells)”，在此引入作為參考。
特別利用了Epstein-Barr病毒的復(fù)制起始點(diǎn)或其功能衍生體和類似體，包括pREP9載體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼人MBL的表達(dá)構(gòu)建體，其特點(diǎn)是包含人MBL基因包括其功能衍生序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子序列。另外，它包括選自病毒基因或真核(包括哺乳動(dòng)物和昆蟲)基因的啟動(dòng)子區(qū)。
優(yōu)選啟動(dòng)子區(qū)與人MBL啟動(dòng)子不相同，并且為了使MBL產(chǎn)量和MBL寡聚體的大小分布最佳，優(yōu)選所述啟動(dòng)子在所用的載體和宿主細(xì)胞中發(fā)揮最佳功能。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子區(qū)選自勞氏(Rous)肉瘤病毒長末端重復(fù)序列的啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒即早期啟動(dòng)子和延伸因子1α啟動(dòng)子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子區(qū)選自其它病毒、酵母和細(xì)菌等微生物的基因。
為了獲得更高產(chǎn)量的重組MBL，啟動(dòng)子區(qū)可以包括增強(qiáng)子元件，例如小鼠血管內(nèi)皮生長因子基因5′末端非翻譯區(qū)的QBI SP163元件。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得能夠表達(dá)MBL的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選真核細(xì)胞宿主細(xì)胞培養(yǎng)。在本文中真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是指將重組DNA引入所述細(xì)胞。在該方法中使用的表達(dá)構(gòu)建體的特點(diǎn)使具有選自哺乳動(dòng)物基因的MBL編碼區(qū)，所述哺乳動(dòng)物基因包括人的基因和與其非常相似的基因，例如黑猩猩的基因。所應(yīng)用的表達(dá)構(gòu)建體的進(jìn)一步特點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)選自病毒和真核(包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)基因。
根據(jù)本發(fā)明制備重組MBL的方法的特點(diǎn)是，宿主細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選真核細(xì)胞培養(yǎng)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物是人腎細(xì)胞，更優(yōu)選的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物是人胚腎細(xì)胞(HEK細(xì)胞)。本發(fā)明的特點(diǎn)是利用HEK293細(xì)胞系制備重組人MBL?！癏EK 293細(xì)胞系“是指來自人胚腎組織的任何細(xì)胞系，例如(但不限于)在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American TypeCulture Collection)登記號委CRL-1573和CRL-10852的細(xì)胞系。
其它細(xì)胞包括雞胚成纖維細(xì)胞、倉鼠卵巢細(xì)胞、倉鼠幼鼠腎細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞、人腎細(xì)胞、人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞、人腦內(nèi)皮細(xì)胞、人口腔腫瘤細(xì)胞、猴腎細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞、小鼠腎細(xì)胞、小鼠結(jié)締組織細(xì)胞、小鼠少突細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞、小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、小鼠前B細(xì)胞、小鼠B淋巴細(xì)胞、小鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞、小鼠畸胎瘤細(xì)胞、大鼠星形細(xì)胞瘤細(xì)胞、大鼠乳腺上皮細(xì)胞、COS、CHO、BHK，、293、VERO、HeLa、MDCK、W138和NIH 3T3細(xì)胞。
另外，可以選擇可調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或者以所需的特殊方式修飾或加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于蛋白的功能可能是重要的。不同宿主細(xì)胞具有特征性和特異性的蛋白和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾機(jī)制。可以選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞系或宿主系統(tǒng)來確保表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可以應(yīng)用具有對初級轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行正確加工、對基因產(chǎn)物進(jìn)行糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型屬于那些可作為適當(dāng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞。
所述宿主細(xì)胞可以在任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，例如添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基。
純化如前述，本發(fā)明可快速生產(chǎn)MBL。MBL的生產(chǎn)可用下述步驟進(jìn)行發(fā)酵-培養(yǎng)表達(dá)MBL的細(xì)胞分離-進(jìn)行沉淀然后分離沉淀和上清任選的純化因此，可以通過任何適當(dāng)?shù)姆绞郊兓鲋亟MMBL組合物，例如任何物理化學(xué)分離方法，包括但不限于過濾法和層析法，如以大小為基礎(chǔ)的離子交換層析、凝膠滲透層析或親和層析等。
優(yōu)選用親和層析的方法從分離部分中純化重組MBL組合物，例如用甘露糖親和層析。
功能性根據(jù)本發(fā)明獲得的重組MBL組合物的功能性優(yōu)選與血漿或血清MBL的功能性相似。在本文中，MBL功能性是指如上文關(guān)于功能等效體所述的激活補(bǔ)體系統(tǒng)的能力?？梢杂肕BL的比活性，例如每ng MBL的MBL的活性單位，表示所述功能性。用比活性表示重組MBL組合物的功能性時(shí)，優(yōu)選其功能性至少為從血清中純化之MBL的比活性的25％，例如至少為從血清純化之MBL的比活性的50％，更優(yōu)選其至少為從血清純化之MBL的比活性的75％。
MBL的功能活性通過其形成可激活補(bǔ)體系統(tǒng)的MBL/MASP復(fù)合物的能力可以得到判斷。當(dāng)C4被MBL/MASP切割時(shí)，活性硫醇酯被暴露并且C4與附近的親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。因而相當(dāng)量的C4b將與包被的塑料孔結(jié)合，并且可以用抗C4抗體進(jìn)行檢測。
針對MBL功能活性的定量TRIFMA由下述步驟組成1)用溶于100ml緩沖液的1mg甘露聚糖包被為微滴定孔；2)用Tween-20封閉；3)加入待測樣品，例如稀釋的MBL制劑；4)加入MBL缺陷型血清(這導(dǎo)致MBL/MASP復(fù)合物的形成)；或者可以在加入到微滴定孔之前將MBL和MBL缺陷型血清混合；5)加入5mg/ml純化的補(bǔ)體因子C4；6)37℃溫育1小時(shí)；7)加入Eu標(biāo)記的抗C4抗體；8)加入增強(qiáng)溶液；和9)通過時(shí)間分辨型熒光測定法(timeresolved fluorometry)讀取Eu。除了步驟8和步驟9之間以外，在每個(gè)步驟之間將平板在室溫下溫育并洗滌。
可以類似地用ELISA進(jìn)行評估，例如在步驟7中加入生物素標(biāo)記的抗C4；8)加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素；9)加入底物；和10)讀取顏色強(qiáng)度。利用一種選定的正常血清的各種稀釋液?？梢詷?gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明使用了下述血清血漿庫(pool)LJ 6.5728/04/97?？梢杂肕BL比活性，例如每ng MBL的MBL活性單位，表示功能。
用于測定MBL功能等價(jià)體的另一種試驗(yàn)是測定與細(xì)胞上一和多種受體結(jié)合的能力。
用細(xì)胞熒光測定法，可以檢測MBL與細(xì)胞上一個(gè)和多種受體的相互作用。1)將濃度50μg/ml的MBL與2×105個(gè)細(xì)胞共溫育。在含有1％FCS和0.1％疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行結(jié)合。2)為了檢測細(xì)胞結(jié)合型MBL，加入生物素化抗MBL抗體；3)隨后加入鏈霉素親和素-FITC和4)用熒光測定法檢測混合物。
藥用組合物獲得的組合物可以用來制備藥用組合物，或在使用之前可以對該組合物進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟。
根據(jù)本發(fā)明獲得的MBL組合物可以用于制備藥用組合物，其用來預(yù)防和/或治療各種疾病或病情。
除了MBL寡聚體，該藥用組合物可以包括可藥用的載體物質(zhì)和/或賦形劑。
尤其可以加入穩(wěn)定劑來穩(wěn)定MBL蛋白質(zhì)。穩(wěn)定劑可以是糖醇、糖、蛋白和/或氨基酸。例如穩(wěn)定劑可以是白蛋白或麥芽糖。
例如，根據(jù)給藥類型，可以向藥用組合物中加入其它傳統(tǒng)的添加劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥用組合物為適合于注射的劑型?？梢允褂玫葷B鹽水等傳統(tǒng)載體物質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該藥用組合物為適合于經(jīng)肺給藥(pulmonaladministration)的途徑，例如用于吸入給藥的粉末狀制劑，或者是適合于局部應(yīng)用的霜?jiǎng)?creme)或洗劑(lotion)。
所述的治療不必是對已診斷的目前需要或可能需要治療的疾病、障礙或病情進(jìn)行治療，而可以用來預(yù)防疾病或病情的發(fā)生。
在本文中治療可以包括對例如人的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)或具有與其相應(yīng)功能單位的動(dòng)物的相應(yīng)系統(tǒng)的疾病進(jìn)行治療和/或預(yù)防。所治療的病情不一定是指目前已知的需要治療的狀態(tài)，而是通常包括任何與當(dāng)前需要和/或預(yù)期需要相關(guān)的狀態(tài)或與正常狀態(tài)的改善相關(guān)的狀態(tài)。該治療尤其是對MBL缺陷狀態(tài)的治療。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種治療藥物的制備方法，該藥物由所述MBL(包括rMBL片段或其類似物)的藥物組合物組成，所述治療包括對人的如免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病或障礙或具有與其相應(yīng)功能單位的動(dòng)物的相應(yīng)系統(tǒng)疾病記進(jìn)行的治療和/或預(yù)防。
需要用本發(fā)明化合物治療的所述疾病、障礙和/或病情包括例如治療MBL缺陷狀態(tài)和與免疫抑制化療相關(guān)的癌癥和感染，尤其包括與癌癥治療期間的狀態(tài)相關(guān)或與生物植入和/或移植相關(guān)的感染。本發(fā)明還包括治療與習(xí)慣性流產(chǎn)相關(guān)的病情。
因而，該藥用組合物尤其可以用于治療和/或預(yù)防選自下組的臨床病情感染，MBL缺陷、癌癥、感染等化療相關(guān)疾病、人免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)疾病、先天性或獲得性免疫缺陷相關(guān)疾病等。更具體而言，包括慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)神經(jīng)炎(C IDP)、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、Eaton-Lambert′s綜合征、視神經(jīng)炎、癲癇；原發(fā)性抗磷脂綜合征；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬皮病、脈管炎、Wegner′s肉芽腫病、Sjgren′s綜合征、幼稚類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫性溶血性貧血、中性粒細(xì)胞減少癥；Crohn′s病、潰瘍性結(jié)腸炎、腹腔疾??；哮喘、敗血性休克綜合征、慢性疲勞綜合征、牛皮癬、中毒性休克、糖尿病、鼻竇炎、擴(kuò)張性心肌炎、心內(nèi)膜炎、動(dòng)脈粥樣硬化。包括常見的可變性免疫缺陷的原發(fā)性低/無丙種免疫球蛋白血癥、Wiskot-Aldrich綜合征和重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和多發(fā)性骨髓瘤患者的次低級/無丙種免疫球蛋白血癥、急性和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、異源骨髓移植(BTM)、Kawasaki′s病和Guillan-Barre′s綜合征。
給藥途徑可以是任何適當(dāng)?shù)耐緩?，例如靜脈內(nèi)。肌內(nèi)、皮下和皮內(nèi)給藥。本發(fā)明還考慮了經(jīng)肺或局部給藥。
MBL組合物給藥尤其可以用來預(yù)防和/或治療具有與先天性或獲得性MBL缺陷相關(guān)的臨床癥狀的患者或者有出現(xiàn)所述癥狀的危險(xiǎn)的患者的感染。在MBL缺陷個(gè)體中有各種病情可以導(dǎo)致增加感染的易感性，例如化療或其它細(xì)胞毒性治療、癌癥、AIDS、遺傳傾向、慢性感染和中性粒細(xì)胞減少癥。
由于化療藥物治療對免疫系統(tǒng)細(xì)胞的副作用，經(jīng)化療的癌癥患者大都對感染易感，這是用MBL治療這種病情的基礎(chǔ)。觀察到的低MBL血漿濃度(低于500ng/mL)是對臨床顯著感染的易感性增加的指征，而且通過給藥重組或天然血漿來源的MBL，可以增強(qiáng)這些患者的免疫防御。
因而在化療等開始之前和化療的至少部分階段，可以給藥該藥用組合物一段時(shí)間。
在化療之前，可以將該MBL組合物作為普通的”激發(fā)劑(booster)”，或者它可以給那些僅僅有發(fā)展成MBL缺陷的危險(xiǎn)的患者施用。可以通過在治療前檢測MBL水平確定有此危險(xiǎn)的患者，并且只對那些MBL水平低于預(yù)定水平的患者進(jìn)行治療。對于大部分人群，確定低MBL水平的界限是低于500ng/ml?？梢酝ㄟ^實(shí)施例9、ELISA、RIA或比濁法測定MBL水平MBL給藥的另一個(gè)指征是當(dāng)MBL水平低于正常水平的50％，例如低于300ng/ml、或低于200ng/ml。
該MBL組合物以適當(dāng)?shù)膭┝糠桨附o藥，尤其通常以適當(dāng)?shù)拈g隔給藥，例如化療期間一周一次或兩次。
正常情況下每劑量給藥1-100mg，例如2-10mg，大部分是每劑量5-10mg。大部分情況下給藥約0.1mg/kg體重。
因而本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用MBL(包括rMBL、其片段或類似物)治療癌癥和例如免疫系統(tǒng)或生殖系統(tǒng)的疾病和障礙，該治療包括創(chuàng)建、重建、增加和/或刺激補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)理和/或殺細(xì)菌活性，即增加免疫防御能力來識別并殺傷微生物病原體。
而且，本發(fā)明的一個(gè)方面是應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的重組組合物，該組合物是還包括另一種藥物的試劑盒組件。所述另一種藥物尤其可以是抗微生物藥物，例如抗生素。
關(guān)于流產(chǎn)，已經(jīng)報(bào)道在不明原因的習(xí)慣性流產(chǎn)患者中MBL低血漿水平的頻率增加，這是在這些病例中通過給藥重組MBL以重建MBL水平而降低流產(chǎn)易感性的基礎(chǔ)。
至于本發(fā)明化合物的本性，在多個(gè)方面表明本發(fā)明涉及能夠作為調(diào)理素的化合物，也就是通過該化合物和巨噬細(xì)胞之間直接相互作用或者通過介導(dǎo)補(bǔ)體沉積于靶體表面，可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能。關(guān)于此點(diǎn)的具體實(shí)例是MBL、其片段或類似物。本發(fā)明是以公開重組人MBL的合成為基礎(chǔ)，該MBL比過去獲得的MBL更接近于天然人MBL的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在已經(jīng)在各個(gè)方面并足夠詳細(xì)的解釋和說明了本發(fā)明，但是在下面用圖1-4以及優(yōu)選實(shí)施方案的非限定性實(shí)施例又舉例說明了本發(fā)明。
實(shí)施例1從旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中分離MBL包含MBL的細(xì)胞培養(yǎng)基取自持續(xù)200m旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)按WO 00/70043中實(shí)施例1中的描述所制備的能產(chǎn)出MBL的HEK293細(xì)胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)，維生素C(ICN Biomedicals)和CytoPorel微載體(AP Biotech)的HyQ PF293培養(yǎng)基(HyClone)中培養(yǎng)。
重復(fù)取出160-175mL細(xì)胞培養(yǎng)基，在微孔過濾去除細(xì)胞后，對無細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行沉淀處理。
在pH7-8無細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+濃度之后，得到白色重沉淀。
該沉淀可在pH3.25的含EDTA的溶液中重懸。
透析后，溶解的MBL可用MBL試驗(yàn)(基于甘露聚糖結(jié)合和HYB131-01識別的TRIFMA)和SDS-PAGE(使用HYB131-01的Westerns)進(jìn)行分析。
對重懸沉淀的MBL特異性免疫測定顯示出全部MBL的絕大多量可從沉淀中回收。而且，從沉淀中回收的MBL主要為大于約200kDa的寡聚體(圖1)。
該同一試驗(yàn)還顯示出一些MBL出現(xiàn)在相應(yīng)上清中。而且，從上清中回收的MBL主要為小于約200kDa的寡聚體，如SDS-PAGE所示(圖2)。
實(shí)施例2從培養(yǎng)罐中分離MBL包含MBL的細(xì)胞培養(yǎng)基取自持續(xù)5L罐培養(yǎng)按實(shí)施例1中描述所制備的能產(chǎn)出MBL的HEK293細(xì)胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)，維生素C(ICN Biomedicals)和HySoy(HyClone)的HyQPF293培養(yǎng)基(HyClone)中培養(yǎng)。
重復(fù)取出200mL細(xì)胞培養(yǎng)基，在離心去除細(xì)胞后，對無細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行沉淀處理。
為利于隨后的沉淀，可加入磷酸鈉以得到大約200mM的磷酸鹽濃度。在富磷酸鹽的無細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+濃度之后，得到白色重沉淀。(參見圖3)。
該沉淀可在pH3.2的含有檸檬酸鹽的溶液中重懸。
實(shí)施例3從SFMII培養(yǎng)基中分離MBL包含MBL的細(xì)胞培養(yǎng)基取自持續(xù)5L罐培養(yǎng)按實(shí)施例1中描述所制備的能產(chǎn)出MBL的HEK293細(xì)胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)和維生素C(ICN Biomedicals)的293 SFMII培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。培養(yǎng)按照規(guī)律沉降和更換培養(yǎng)基的取充程序(draw-fill processs)進(jìn)行。微載體(Microcarriers)(Cytopore 1，AP Biotech)用于支持。
重復(fù)取出2L細(xì)胞培養(yǎng)基，在離心去除細(xì)胞后，對無細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行沉淀處理。
為利于隨后的沉淀，可加入磷酸鈉以得到大約50mM的磷酸鹽濃度。在富磷酸鹽的無細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+濃度之后，得到白色重沉淀。
該沉淀可在pH3.0的含有檸檬酸鹽的溶液中重懸。
實(shí)施例4從非培養(yǎng)基中分離MBL在含MBL的溶液(1.0mg/L)中加入磷酸鈉緩沖液(pH7.4)以得到100mM的磷酸鹽濃度。隨后，加入氯化鈣以得到100mM的鈣濃度。所形成的沉淀包含大部分MBL(＞90％)，如MBL試驗(yàn)(基于甘露聚糖結(jié)合和HYB131-01識別的TRIFMA)和SDS-PAGE(使用HYB131-01的Westerns)所示。
實(shí)施例5MBL的產(chǎn)量甘露聚糖結(jié)合型MBL的產(chǎn)量可用MBL試驗(yàn)(基于甘露糖結(jié)合和HYB131-01識別的TRIFMA)。在兩個(gè)隨后的實(shí)驗(yàn)中，與起始物質(zhì)相關(guān)的獲自實(shí)施例1的重懸沉淀中的MBL的含量分別被測定為72％和68％。
實(shí)施例6比率R的計(jì)算以下三種樣品，使用本發(fā)明前的重組來源的MBL，使用本發(fā)明后的重組來源的MBL(上清)和使用本發(fā)明后的重組來源的MBL(沉淀)用于計(jì)算R值。
進(jìn)行SDS-PAGE免疫印跡(圖.2)，使用MAB131-01(Statens SerumInstitute)，結(jié)合辣根過氧化物酶的兔抗小鼠抗體(P0260，Dako)和SuperSignal West Pico substrate(Pierce)，然后掃描為無壓縮TIFF文件。樣品條帶的像素密度采用Scion Image for Windows 4.0測量，并輸出至Microsoft Excel。
與200kDa相應(yīng)的遷移可用標(biāo)記(Precision Protein Standards，BioRad)的遷移進(jìn)行確定。計(jì)算全部高于200kDa的像素信號，同樣計(jì)算低于200kDa標(biāo)記物的全部像素信號。每一樣品中這些數(shù)據(jù)間的比率即為R-值。
在使用本發(fā)明前的重組來源的MBL的R值估測為R＝6。本發(fā)明的重組來源的MBL的上清的R-值估測為R＝0，而本發(fā)明的重組來源的的MBL的沉淀的R-值估測為R＞＞1000。
實(shí)施例7比率R的計(jì)算重組來源的MBL的R值可用BioAnalyzer系統(tǒng)(Agilent)及蛋白質(zhì)200增強(qiáng)芯片檢測系統(tǒng)(Protein 200 Plus chip detection system)(Agilent))進(jìn)行測定。
樣品走膠嚴(yán)格按照供應(yīng)商的描述(除在走膠前用水稀釋凝膠(1份水對2份凝膠)外)，且不在樣品中加入還原劑。這樣就能在凝膠上看到高分子量形式的MBL。
與200kDa相應(yīng)的遷移可用較高標(biāo)記(分子量為210kDa的肌球蛋白，供應(yīng)商提供的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))的遷移進(jìn)行確定。高于200kDa的全部像素信號用整合程序進(jìn)行整合，同樣整合低于200kDa標(biāo)記物全部像素信號。每一樣品中這些數(shù)據(jù)間的比率即為R-值。
兩個(gè)選定的重組來源的MBL樣品的R值的計(jì)算顯示于圖4中。一個(gè)樣品的R-值為R＝19，而另一樣品的R-值為R＝0.2。
權(quán)利要求
1.一種增加包含多種凝集素分子的組合物比率R的方法，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含低分子量凝集素和高分子量凝集素，所述制劑的比率R＝R0，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出所述沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選地重懸所述沉淀部分，獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
2.一種生產(chǎn)包含多種凝集素分子的組合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有高于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清，從所述上清中分離出所述沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選地重懸所述沉淀部分，獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
3.一種從包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的凝集素制劑中，分離包含多種凝集素分子的組合物的方法，其中基本上所有凝集素分子全部具有高于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，所述方法包括，獲得所述凝集素制劑，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清，從所述上清中分離出所述沉淀，獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任選地獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選地重懸所述沉淀部分，獲得含有沉淀部分凝集素分子的組合物。
4.一種生產(chǎn)包含多種凝集素分子的組合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有低于或等于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子，所述制劑的比率R＝R0，其中R為分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度與分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子的濃度的比率，在所述制劑中加入沉淀劑，使之產(chǎn)生沉淀和上清從所述上清中分離出所述沉淀，獲得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任選地獲得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，獲得含有上清部分凝集素分子的組合物。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中凝集素為甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述組合物中至少50摩爾％的MBL具有高于200kDa的分子量，如高于225kDa，如高于250kDa，如高于300kDa。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述MBL包含具有如下級別分子量的MBL分子，級別I的分子量范圍為200kDa至270kDa，級別II的分子量范圍為270kDa至300kDa，級別III的分子量范圍為300kDa至400kDa，和級別IV的分子量范圍為400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE測定，其中級別I的MBL占組合物中MBL總量的0-20摩爾％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，所述組合物包含至少三個(gè)分子量級別的MBL分子，其中級別I的MBL占組合物中MBL總量的0-20摩爾％。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在獲得包含高分子量MBL的所述組合物之前重懸所述沉淀。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中低分子量MBL包含分子量低于200kDa的MBL。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中沉淀劑選自低分子量沉淀劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中沉淀劑選自陽離子沉淀劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中沉淀劑選自，CaCl2，氯化鈣(CaCl2，CaCl2·H2O，CaCl2·2H2O，CaCl2·6H2O)，硝酸鈣(Ca(NO3)2，Ca(NO3)2·3H2O，Ca(NO3)2·4H2O)，亞硝酸鈣(Ca(NO2)2·H2O，Ca(NO2)2·4H2O)，碘化鈣(CaI2，CaI2·6H2O)，溴化鈣(CaBr2，CaBr2·6H2O)，溴酸鹽(Ca(BrO3)2·H2O)，氯酸鈣(Ca(ClO3)2，Ca(ClO3)2·2H2O，(Ca(ClO4)2)，鉻酸鈣(CaCrO4·2H2O)，高錳酸鈣(Ca(MnO4)2·5H2O)，次磷酸鈣(Ca(H2PO2)2)，鈣鐵氰化物(Ca3[Fe(CN)6]2·12H2O，Ca2Fe(CN)6·12H2O)，硫代硫酸鈣(CaS2O3·6H2O)，以及如低溶解含鈣劑，如甲酸鈣(Ca(CHO2)2)，乙酸鈣(Ca(C2H3O2)2，Ca(C2H3O2)2·H2O，Ca(C2H3O2)2·2H2O)，丙酸鈣(Ca(C3H5O2)2·H2O)，乳酸鈣(Ca(C3H5O3)2·5H2O)，馬來酸鈣(CaC4H2O4·H2O)，戊酸鈣(Ca(C5H9O2)2)，和枸櫞酸鈣(Ca3(C6H5O7)2·4H2O)。
14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中沉淀劑選自陰離子沉淀劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中沉淀劑選自磷酸鹽、碳酸鹽和硫酸鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溶劑包含陰離子，如選自硫酸鹽(SO42-)，磷酸鹽(PO43-)和乙酸鹽(CH2COO-)。
17.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中分離通過對制劑進(jìn)行離心來實(shí)施。
18.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中MBL制劑為重組MBL制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中MBL制劑獲自如下步驟-制備編碼人MBL肽或其功能等效體的基因表達(dá)構(gòu)建體，-將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，-在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而使所述多肽表達(dá)并將其分泌到培養(yǎng)基中，-獲得包含多種MBL分子的制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中制劑包含溶劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述溶劑為培養(yǎng)基。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中基因表達(dá)構(gòu)建體包含至少一個(gè)來自人MBL基因或其功能等效體的內(nèi)含子序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中基因表達(dá)構(gòu)建體包含至少兩個(gè)來自人MBL基因或其功能等效體的外顯子序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中基因表達(dá)構(gòu)建體包含編碼MBL亞基或其功能等效體的cDNA序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中宿主細(xì)胞培養(yǎng)物為體外培養(yǎng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中宿主細(xì)胞培養(yǎng)物為真核宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中宿主細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。
28.根據(jù)通過權(quán)利要求2所述的方法獲得的組合物，所述組合物包含高分子量MBL和低分子量MBL，其中所述組合物包含低于5摩爾％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于200kDa。
29.具有至少兩個(gè)分子量級別的MBL分子的重組人類MBL組合物，所述級別選自級別I的分子量范圍為200kDa至270kDa，級別II的分子量范圍為270kDa至300kDa，級別III的分子量范圍為300kDa至400kDa，和級別IV的分子量范圍為400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE測定，其中級別I的MBL占組合物中MBL總量的0-20摩爾％。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，所述組合物包含至少三個(gè)分子量級別的MBL分子，其中級別I的MBL占組合物中MBL總量的0-20摩爾％。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，所述組合物包含四個(gè)分子量級別的MBL分子。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中基本上不含在任何當(dāng)在天然宿主生物中產(chǎn)生時(shí)與MBL天然相關(guān)聯(lián)的雜質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求29-32任一項(xiàng)所述的組合物，其中分子量通過SDS-PAGE和/或Western雜交測定。
34.根據(jù)權(quán)利要求29-33任一項(xiàng)所述的組合物，其處于非變性狀態(tài)。
35.根據(jù)權(quán)利要求29-33任一項(xiàng)所述的組合物，其處于變性狀態(tài)。
36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中MBL亞基由三個(gè)相同肽序列構(gòu)成。
37.包含權(quán)利要求29-36任一項(xiàng)所述的人類重組MBL組合物的藥用組合物，任選地更進(jìn)一步包含藥物可接受載體物質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其為注射適用劑型。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中載體物質(zhì)為鹽水、人血清白蛋白或甘露糖。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其為適用經(jīng)肺施用的劑型。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其為吸入粉劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其為局部施用的霜?jiǎng)┗蛳磩?br> 43.根據(jù)權(quán)利要求29-36所述的人類重組MBL組合物制備藥用組合物的用途。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的組合物，以制備用于治療個(gè)體的臨床癥狀的藥用組合物的用途，所述臨床癥狀選自感染、MBL缺陷狀態(tài)、癌癥、化療相關(guān)癥狀、流產(chǎn)、嗜中性白血球減少癥相關(guān)癥狀和人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其中藥用組合物的施用途徑為靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其中藥用組合物為經(jīng)肺的施用途徑。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其中藥用組合物的施用途徑為局部使用。
48.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其中藥用組合物的施用途徑為在化療起始或其它細(xì)胞毒性治療前的預(yù)防性使用。
49.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其中MBL組合物的施用量為1-100mg/劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備高分子量凝集素組合物的方法，特別包括甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)，適于使用重組制備的凝集素作為起始物，高分子量凝集素組合物，及包含其的藥用組合物，以及所制備的組合物在制備治療多種病情和疾病的藥用組合物中的用途。本發(fā)明一方面提供了一種制備含有多種凝集素分子的組合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部都具有高于二聚體凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，獲得凝集素制劑，該制劑包含分子量高于二聚體凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚體凝集素分子量的凝集素分子，所述制劑的比率R＝R
文檔編號A61P37/04GK1549823SQ02817175
公開日2004年11月24日 申請日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月23日
發(fā)明者芬恩·馬西森, 芬恩 馬西森 申請人:納蒂芒公司