一種抗vegf的單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗體工程領(lǐng)域，具體涉及一種識(shí)別人血管內(nèi)皮生長因子（huVEGF)表位 的鼠單克隆抗體，更具體的，設(shè)計(jì)該單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)氨基酸 序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 1971年Folkman首先觀察到當(dāng)腫瘤體積超過l-2mm3,需要新血管的形成來維持生 長，從而最早提出腫瘤生長是血管依賴性的，并指出抗血管生成是控制腫瘤生長的新途徑。 已有研究表明，幾乎所有實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤新血管的生成。
[0003] 1989 年 Ferrara N 發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)，后來被證明是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管形成因子之一，在腫瘤的血管生長 中發(fā)揮著重要作用。對(duì)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有重要影響，在腫瘤的血管發(fā)生過程中發(fā)揮極其 重要的作用。VEGF既可以用于腫瘤治療的理想靶點(diǎn)，也可以作為進(jìn)行腫瘤診斷和判斷預(yù)后 的標(biāo)志物。
[0004] VEGF是相對(duì)分子質(zhì)量34000-42000的高度糖基化堿性同源二聚體糖蛋白，其編碼 基因位于染色體的6q21. 3,全長14kb，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，可形成9種異構(gòu)體， 主要包括VEGF121、VEGF 165、VEGF189和VEGF2tl6。其中多數(shù)組織以表達(dá)VEGF165為主。
[0005] Genetech公司針對(duì)VEGF的人源化單克隆抗體阿瓦斯丁自2004年上市以來被證明 對(duì)于轉(zhuǎn)移性直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等腫瘤均有顯著的抑制效果。2006年，其優(yōu)化后 的抗體片段雷珠被美國FDA批準(zhǔn)用于治療老年黃斑變形，成為治療老年性黃斑病變、糖尿 病引起的眼底病的首選藥。
[0006] 由于VEGF及其受體的多樣性，不同抗原表位或者不同親和力的VEGF抗體可能有 不同的腫瘤生長抑制效果。因此研究不同的VEGF抗體將有助于VEGF抗體藥物的升級(jí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種抗人血管內(nèi)皮生長因子（huVEGF)的單克隆抗體，能夠特 異性的識(shí)別huVEGF，對(duì)huVEGF有很高的親和力。
[0008] 本發(fā)明提供了一種針對(duì)huVEGF的鼠源單克隆抗體。
[0009] 本發(fā)明還提供了優(yōu)選的VEGF抗體重鏈可變區(qū)，其中高變區(qū)具有下列氨基酸序列： CDRHl (SEQ ID NO. I :TYGMS)，CDRH2 (SEQ ID NO. 2 :TISNGGSYTFYPDSVKG)，CDRH3 (SEQ ID NO. 3 :HGSVTTRGFDY)。
[0010] 本發(fā)明還提供了優(yōu)選的VEGF抗體輕鏈可變區(qū)，其中高變區(qū)具有下列氨基酸序列： CDRLl (SEQ ID N0.4:KASQSVSNDW)，CDRL2 (SEQ ID N0.5:YASNRYT)，CDRL3 (SEQ ID NO. 6 ：LQDYSSPFT)〇 toon] 本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗 體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的任何多肽。
【附圖說明】
[0012] 圖1為顯示間接ELISA法測定單克隆抗體的相對(duì)親和力的圖譜；
[0013] 圖2為顯示16-5對(duì)VEGF與其受體VEGFRl結(jié)合的阻抗作用的圖譜；
[0014] 圖3為顯示16-5對(duì)VEGF與其受體VEGFR2結(jié)合的阻抗作用的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。需要說明的是下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本 發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0016] 實(shí)施例1小鼠單克隆抗體的制備和篩選
[0017] (1)小鼠的免疫
[0018] 將VEGF165蛋白溶解在IX PBS，取適量的蛋白溶液與弗氏完全佐劑（Sigma)混勻乳 化，取8周齡的BALB/c雌鼠，皮下多點(diǎn)注射抗原。2周后，取適量的蛋自溶液與弗氏不完全 佐劑（Sigma)混勻乳化，在小鼠的皮下，進(jìn)行第二次免疫。以后每隔3周，進(jìn)行第三、四次免 疫。第四次免疫后3天，取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0019] (2)細(xì)胞融合
[0020] 從免疫小鼠內(nèi)收獲脾細(xì)胞，將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞分別與該脾細(xì)胞懸 液按1:10-100比例混合，加入聚乙二醇使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴 加培養(yǎng)液，以HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
[0021] (3)陽性克隆的篩選
[0022] 待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第5-10天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培 養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體 的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫 組織化學(xué)原位測定，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株，命名為16-5。
[0023] (4)單克隆抗體可變區(qū)序列的獲得
[0024] 利用Trizol (Invitrogen)法提取雜交瘤細(xì)胞株16-5的總RNA,然后用oligo-dT 引物和 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。經(jīng) PCR 擴(kuò)增 獲得抗體重鏈和輕鏈的DNA片段，連于克隆載體，挑取克隆進(jìn)行測序。
[0025] (5)單克隆抗體的純化
[0026] 單抗16-5采用Hi-Trap protein A HP (GE Healthcare)親和層析柱從雜交瘤細(xì) 胞上清中純化，SDS-PAGE電泳證明所得產(chǎn)物純度大于90%。純化后的16-5直接用于以下實(shí) 驗(yàn)。
[0027] 實(shí)施例2小鼠單克隆抗體特性測定
[0028] (1)單克隆抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定
[0029] 取 16-5 雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清，米用 Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Pierce公司)利用ELISA法測定抗體重鏈、輕鏈類型。經(jīng)鑒定，16-5亞型為IgGa2b/kappa。
[0030] (2)間接ELISA法測定單克隆抗體的相對(duì)親和力
[0031] 用0. 5 μ g/ml的人VEGF標(biāo)準(zhǔn)品包被酶標(biāo)版，每孔100 μ 1。37°C溫育2小時(shí)，用含 l%Tween-20的PBS洗滌后，封閉2小時(shí)。將單抗16-5以起始濃度為1 μ g/ml做三倍稀釋， 以商品化單抗avastin作為比對(duì)，37°C溫育1小時(shí)。5次洗滌后，分別加入100 μ I HRP標(biāo)記 的相應(yīng)二抗，37°C溫育1小時(shí)。5次洗滌后，加入50 μ 1顯色液，37°C溫育15分鐘，50 μ 12Μ 硫酸終止反應(yīng)，OD45c!讀數(shù)。
[0032] 經(jīng)過四參數(shù)擬合后，16-5的EC50為40ρΜ。
[0033] 表1 :間接ELISA法測定單克隆抗體的相對(duì)親和力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，它具有含有如下氨基酸序列的三個(gè)高變區(qū) 的重鏈可變區(qū)：CDRH1 (SEQ ID NO. I :TYGMS)，CDRH2 (SEQ ID NO. 2 :TISNGGSYTFYPDSVKG)， CDRH3 (SEQ ID N0.3:HGSVTTRGFDY)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，它還/或具有含有如下 氨基酸序列的三個(gè)高變區(qū)的輕鏈可變區(qū)：CDRLl (SEQ ID NO. 4:KASQSVSNDVV)，CDRL2 (SEQ ID NO. 5 :YASNRYT)，CDRL3 (SEQ ID NO. 6 :LQDYSSPFT)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗 體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物或同源物，也包 括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 8 所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體的DNA序列，其特征在于，其重鏈核苷酸序列 如SEQ ID NO. 9所示；其輕鏈核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體工程領(lǐng)域，公開了一種新型抗人血管內(nèi)皮生長因子（huVEGF）的單克隆抗體。具體的，本發(fā)明提供了重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。該單克隆抗體具有與人VEGF特異結(jié)合的特性。本發(fā)明還提供了編碼該抗體的DNA分子及該抗體的制備方法。
【IPC分類】C07K16-22
【公開號(hào)】CN104804088
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410036740
【發(fā)明人】張發(fā)明, 席甘
【申請(qǐng)人】中美華世通生物醫(yī)藥科技（武漢）有限公司, 張發(fā)明, 席甘
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2014年1月26日