專利名稱：血小板生成素/粒、巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品，及該產(chǎn)品的用途，具體地說涉及重組人血小板生成素/粒、巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白(recombinant humanthrombopoietin/granulocyte-macrophage colony-stimulating factor fusion protein,rhTPO/GM-CSF)，及其對各類造血組織損傷的治療作用。
人類各類惡性腫瘤的治療，除手術(shù)外以放療及化療最為常用。然而有效的放療及化療常常造成機體造血組織的嚴重損傷，引起阻礙治療進一步進行的貧血、感染及出血癥狀，甚至死亡。目前臨床上除了血液制品的支持治療外，已應(yīng)用了紅細胞生長因子(erythropoietin EPO)、粒、巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor GM-CSF)及血小板生成素(thrombopoietin TPO)等生物因子來治療繼發(fā)性全血細胞減少，并收到了良好的效果。TPO單獨使用時可刺激紅細胞系及巨核細胞系造血，不能刺激粒細胞系的造血(Molineux G,et al.Stem Cell.1997,15:43-49)；GM-CSF單獨使用時可刺激粒細胞系的造血，不能刺激紅細胞系及巨核細胞系造血(Broxmeyer HE,et al,Exp Hematol.1988,16:594-602)。近年來，隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們不但研究單一的天然生物因子，而且為了不同的目的構(gòu)建融合的生物活性因子。自1986年日本的Masahata等在大腸桿菌中表達了人干擾素γ(IFN-γ)/白細胞介素2(IL-2)的融合蛋白以來，迄今國內(nèi)外已有了PLXY321、IFN-γ/腫瘤壞死因子(TNF)、IL-2/IL-6、IL-3/EPO及CH925等具不同作用的融合蛋白因子的研究報道(白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途專利申請?zhí)?93100115.3)。目前尚未見到TPO和GM-CSF融合蛋白的報道。
本發(fā)明的目的是獲得一個具有能同時促進機體紅細胞系、粒細胞系及巨核細胞系造血的生物細胞因子，以治療臨床上各類造血組織損傷綜合癥。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)將編碼hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段利用酶切及連接的方法，融合于完整的127個氨基酸的hGM-CSF成熟蛋白編碼序列N-端，獲得編碼hTPO/GM-CSF的融合基因。將融合基因插入合適的表達質(zhì)粒pBV220，并轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞JM101，表達融合基因編碼的融合蛋白。該融合蛋白N-端含hTPO分子第1-174位氨基酸序列，C-端為hGM-CSF成熟蛋白的127個氨基酸序列，在原核細胞中表達的融合蛋白以包涵體形式存在。將包涵體用2％Triton X100和1％脫氧膽酸洗滌后得到純度為70％的包涵體。將包涵體溶于6M鹽酸胍20mMDTT溶液中溶解后，在含1.4M鹽酸胍的復性液中復性。復性產(chǎn)物經(jīng)過Q-SepharoseFF陰離子交換柱層析純化和透析，得到高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白。高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白也可用SDS-PAGE電泳幾ZnSO4負染法直接從凝膠上分離純化獲得。以純化的、1∶10至1∶10000倍比稀釋的rhTPO/GM-CSF融合蛋白培養(yǎng)小鼠骨髓造血祖細胞，結(jié)果各個濃度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白對小鼠骨髓造血祖細胞的CFU-E,BFU-E,CFU-Meg與CFU-GM均有明顯的刺激作用。說明rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有與TPO相同的刺激小鼠骨髓紅細胞系、巨核細胞系的作用，又有與GM-CSF相同的刺激粒細胞系的作用，具備了TPO和GM-CSF雙重的生物活性。在對Co60照射所致小鼠造血組織損傷模型的治療中可見，hTPO/GM-CSF融合蛋白可促進受照小鼠血像的早期恢復。說明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一個具有TPO和GM-CSF雙重生物活性的新的生物因子，對骨髓紅細胞系、粒細胞系及巨核細胞系三系造血均有明顯的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治療電離輻射，化學藥物及生物病源體等因素造成的紅細胞，白細胞及血小板減少和缺乏引起的貧血、感染和出血等癥狀。本發(fā)明的主要內(nèi)容是在獲取hTPO/GM-CSF融合蛋白cDNA，并成功構(gòu)建高效表達菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導表達、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復性工藝，以獲得rhTPO/GM-CSF融合蛋白純品，并對rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物學性能進行了描述，表明了rhTPO/GM-CSF融合蛋白能同時促進機體紅細胞系、粒細胞系及巨核細胞系三系造血，可用于治療放、化療等各種原因造成的造血組織損傷綜合癥。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實施方法如下圖1為rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的鹼基序列(bp)。
圖2為rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖中1是pUC18-TPO:2是pUC18-GM-CSF；3是TPO基因片段；4是GM-CSF基因片段；5是pBV220；6是pBV220-TPO/GM-CSF。
實施例一．rhTPO/GM-CSF融合基因的構(gòu)建圖1為rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的鹼基序列。提取pUC18/hTPO及pUC18/hGM-CSF質(zhì)粒DNA，純化。以EcoRⅠ及SacⅠ酶切取編碼hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段，以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切取編碼hGM-CSF127個氨基酸成熟蛋白的DNA片段，以T4連接酶將hTPO的DNA片段融合于hGM-CSF的DNA片段的N-端，獲得編碼hTPO/GM-CSF的融合基因。將融合基因插入原核表達質(zhì)粒pBV220的多克隆酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ之間，如圖2所示，并轉(zhuǎn)入原核宿主細胞大腸桿菌JM101，經(jīng)篩選得到了含重組質(zhì)粒pBV220/TPO/GM-CSF的陽性克隆。
實施例二．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表達及小量制備1rhTPO/GM-CSF融合蛋白在大腸桿菌JM101中的表達挑取轉(zhuǎn)化陽性的大腸桿菌JM101菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接2％于新鮮LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)至OD600達0.4，調(diào)溫至42℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)4小時。離心收菌，以PBS緩沖液洗滌后超聲破碎，離心收集包涵體。行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。結(jié)果表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳見一個分子量為34KDa的新的蛋白條帶，其分子量大小與預算一致。經(jīng)激光密度掃描測定表達量約占菌體總蛋白量的18.22％，占包涵體蛋白的51.82％。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白的小量制備以咪唑-SDS-硫酸鋅負染凝膠，切下負染的SDS-PAGE電泳凝膠上的rhTPO/GM-CSF融合蛋白條帶，以50mmol/L PBS浸出蛋白因子。經(jīng)50-20mmol/L的PBS緩沖液4℃透析、復性72小時。最后離心除雜質(zhì)，過濾除菌，收集rhTPO/GM-CSF融合蛋白。以紫外分光光度計測得蛋白濃度為102.1ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附測定顯示，rhTPO/GM-CSF融合蛋白與hGM-CSF的單克隆抗體呈陽性反應(yīng)，說明本發(fā)明所構(gòu)建的rhTPO/GM-CSF基因的閱讀框架正確，所表達的融合蛋白確為hTPO/GM-CSF。
實施例三．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的高效表達及大量制備1．rhTPO/GM-CSF在大腸桿菌JM101中的高效表達挑取JM101(pBV/TPO/GM-CSF)工程菌單菌落，接種于10ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50ug/ml),200轉(zhuǎn)/分振搖，30℃培養(yǎng)過夜。次日接種1％過夜菌于1升LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50ug/ml),30℃振搖培養(yǎng)4小時。在4℃,3000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體。
2．包涵體的制備及洗滌將收集的菌體懸于50ml裂解緩沖液(50mM Tris-Hcl pH8.0,1MNacl,,0.5mg/ml溶菌酶)，室溫孵育30分鐘。超聲破碎細菌，然后加入2％Triton X100,12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10分鐘，收集沉淀。用1％脫氧膽酸洗滌一次，再用蒸餾水洗滌一次。
3．包涵體的溶解及復性將包涵體溶于8ml 6M鹽酸胍，50mM Tris-Hcl pH8.0,20mMDTT溶液，37℃孵育1小時。4℃離心10分鐘，收集上清，棄去不溶性沉淀。將溶解后的包涵體按1∶10(V/V)稀釋于復性液，25℃復性36小時，復性液含50mMTris-Hcl pH8.0,1mM EDTA,4mM GSH,2mM GSSH,1.4M鹽酸胍。將復性液對10升50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA透析緩沖液徹底透析。12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10分鐘，去除沉淀。
4．純化將透析液按0.5ml/分鐘流速上樣于用50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA平衡緩沖液平衡的(Q-Sepharose FF)陰離子交換層析柱。用平衡緩沖液洗脫未吸附雜蛋白。然后用含0-500mM Nacl的平衡緩沖液進行梯度洗脫，分步收集洗脫峰，將活性蛋白峰合并于0.9％的生理鹽水徹底透析。
實施例四．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物活性1rhTPO/GM-CSF融合蛋白的體外活性測定小鼠骨髓造血祖細胞的體外培養(yǎng)取昆明種正常小鼠骨髓有核細胞，按每體系1×105個有核細胞接種于含有10-4mol/L β-巰基乙醇，3％L-谷氨酰胺，10％馬血清及2.7％甲基纖維素的McCoy′s培養(yǎng)體系中。陽性對照組中每體系加入EPO2u,-IL-340ng,IL-12000u，或GM-CSF100ng。TPO組每體系加入本實驗室制備的真核細胞穩(wěn)定表達的rhTPO因子200ng。陰性對照組中只有培養(yǎng)體系，不含造血因子。實驗組中加入1∶10,1∶100,1∶1000,1∶10000倍比稀釋的rhTPO/GM-CSF融合蛋白。于37℃,5％CO2及一定的濕度下培養(yǎng)7天，在光學顯微鏡下計數(shù)BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成數(shù)，并將BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成數(shù)結(jié)果與陽性及陰性對照相比較。結(jié)果4個濃度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白對小鼠骨髓造血祖細胞的紅細胞系、粒細胞系及巨核細胞系均有明顯的刺激作用，其中以1∶100-1∶1000稀釋度的活性較高，過高或過低的因子濃度將對細胞集落的形成有影響。以析因設(shè)計資料的方差分析，得出實驗組的BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM計數(shù)在統(tǒng)計學上與陽性對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，與陰性對照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。BFU-E及CFU-Meg計數(shù)與單用TPO組比較無明顯差異(P＞0.05)。CFU-GM計數(shù)與單用TPO組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。單用TPO組的BFU-E及CFU-Meg計數(shù)與陽性對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，與陰性對照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。單用TPO組CFU-GM計數(shù)與陰性對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，與陽性對照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。說明單用TPO有刺激紅細胞系及巨核細胞系的作用，但沒有刺激粒細胞系的作用。rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有與TPO相同的刺激小鼠骨髓BFU-E,CFU-Meg的作用，又有與GM-CSF相同的刺激CFU-GM的作用，具備了TPO和GM-CSF雙重的生物活性。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白治療造血組織損傷的活性測定小鼠造血組織損傷模型的建立以5.0Gy Co r射線照射昆明種正常雄性小白鼠為造血組織損傷模型。實驗動物分組分為正常動物及受照動物兩大組。每大組又分為5個組1組正常對照組，腹腔注射生理鹽水；2組實驗組，腹腔注射rhTPO/GM-CSF融合蛋白200ug/Kg/天；3組腹腔注射TPO200ug/Kg/天和GM-CSF50ug/Kg/天混合給藥組；4組腹腔注射TPO200ug/Kg/天單藥組；5組腹腔注射GM-CSF 50ug/Kg/天單藥組。觀察小鼠外周血像及受照后10天小鼠骨髓造血祖細胞培養(yǎng)結(jié)果。結(jié)果，正常動物，給融合蛋白實驗組小鼠骨髓及外周血像較正常對照組有不同程度的升高；Co60照射動物，給融合蛋白實驗組小鼠骨髓及外周血像也較對照組有明顯的升高。說明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一個具有TPO和GM-CSF雙重生物活性的新的生物因子，對骨髓紅細胞系、粒細胞系及巨核細胞系三系造血均有明顯的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治療電離輻射，化學藥物及生物病源體等因素造成的紅細胞，白細胞及血小板減少和缺乏引起的貧血、感染和出血等癥狀。
總之，本發(fā)明公開了利用分子生物學和基因工程技術(shù)將hTPO基因與hGM-CSF基因相融合，構(gòu)建了新的融合蛋白rhTPO/GM-CSF。在用途上，rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有對紅細胞系、巨核細胞系及粒細胞系的刺激作用，可用于臨床治療放、化療等各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
權(quán)利要求
1一種融合蛋白造血因子，其特征在于該融合蛋白由人血小板生成素(hTPO)和人粒、巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)組成。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白N-端為hTPO的序列，C-端為hGM-CSF的序列。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白含有圖1所示的DNA序列。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白包含hTPO功能段的第1-174位氨基酸序列及成熟hGM-CSF的127個氨基酸序列，分子量為34KDa。
5根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白具有對紅細胞系、巨核細胞系及粒細胞系造血的刺激作用，可用于治療各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
全文摘要
一種能刺激全血細胞生長的重組人血小板生成素/粒、巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白(rhTPO/GM－CSF)。屬生物產(chǎn)品及用途領(lǐng)域。將人血小板生成素(hTPO)N－端1—174位氨基酸融合于人粒、巨噬細胞集落刺激因子(hGM－CSF)127個氨基酸的N－端,得到具有TPO及GM－CSF雙重生物活性的融合蛋白,分子量為34KDa。rhTPO/GM－CSF融合蛋白具有對紅細胞系、巨核細胞系及粒細胞系造血的刺激作用,可用于治療各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
文檔編號C12N15/62GK1221754SQ9712573
公開日1999年7月7日 申請日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者曹華, 葛忠良, 崔立斌, 張群偉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所殷小剛