專利名稱：重組靶向促血小板生成的融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有靶向促巨核細(xì)胞增殖—血小板生成作用的TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素融合蛋白的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由造血功能障礙而引起的原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥在臨床上較為常見，有效地保護(hù)和促進(jìn)血小板恢復(fù)是一個(gè)重要的科學(xué)難題。在眾多升血小板方案中，造血生長(zhǎng)因子的效果最佳，其中升血小板作用最顯著的是血小板生成素(TPO)和白細(xì)胞介素-11(IL-11)。TPO又稱巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子(MGDF)或血小板生長(zhǎng)因子(TSF)，人TPO由332個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為38KD。TPO通過與其受體(c-Mpl)結(jié)合而刺激巨核系祖細(xì)胞的增殖、分化，并促進(jìn)血小板的生成和釋放。但由于TPO在試用過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的中和性抗體，至今一直未批準(zhǔn)進(jìn)入臨床。重組人IL-11(rhIL-11)雖然在1997年就已經(jīng)獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，但由于經(jīng)常出現(xiàn)浮腫、心律失常、頭暈、骨膜炎等副反應(yīng)，以及昂貴的價(jià)錢，使得其應(yīng)用受到了一定的限制。
TPO模擬肽(TMP)是經(jīng)過噬菌體表面展示技術(shù)篩選到的一種與天然TPO生物活性相似的短肽，總共只有14個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸序列與TPO完全不同源(Cwirla et al，1997)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該短肽與TPO受體卻有著很高的親和力，并能夠刺激TPO細(xì)胞依賴株(Ba/F3/c-Mpl)增殖與分化。但該短肽分子量太小，進(jìn)入體內(nèi)后很容易被降解，同時(shí)也很難通過基因工程方法進(jìn)行制備，因而其體內(nèi)應(yīng)用效果并不理想。
人生長(zhǎng)激素(hGH)是由垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，共由191個(gè)氨基酸組成，分子量約為22KD。hGH主要的生理作用是促進(jìn)蛋白質(zhì)與核酸的合成，對(duì)人體幾乎所有組織細(xì)胞(神經(jīng)組織除外)都有顯著促生長(zhǎng)作用。經(jīng)基因工程獲得的重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)有著與天然hGH相同的生理功能，在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療發(fā)育障礙、免疫調(diào)節(jié)及創(chuàng)傷后的組織修復(fù)等。此外，rhGH也能夠促進(jìn)骨髓及脾臟各系造血祖細(xì)胞的增殖。近年來(lái)，包括我們?cè)趦?nèi)的一些國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用rhGH可以顯著促進(jìn)腫瘤放、化療及再生障礙性貧血等病人的造血重建過程，尤其在促巨核細(xì)胞增殖和血小板生成方面有著一定的療效。然而，由于hGH廣譜的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，當(dāng)被應(yīng)用到體內(nèi)后，它會(huì)廣泛地作用全身各處的組織細(xì)胞，要想使其對(duì)某一特定組織或細(xì)胞具有突出的作用，如提高促巨核細(xì)胞增殖和血小板生成能力，必須要加大使用量。如此，不僅會(huì)增加其使用成本，而且還會(huì)給人體帶來(lái)其它不利反應(yīng)。解決此問題最好的辦法是使hGH選擇性地作用于靶組織或細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種重組靶向促血小板生成的融合蛋白。它由TPO模擬肽區(qū)和人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)組成。
本發(fā)明的TMP與hGH的融合蛋白包括兩個(gè)主體部分，一個(gè)是含有14個(gè)氨基酸殘基的TMP(序列表SEQ ID NO1)；另一個(gè)是含有191個(gè)氨基酸殘基的hGH(序列表SEQ ID NO2)，其氨基酸序列與天然人生長(zhǎng)激素的氨基酸序列相同。
為了使融合蛋白的兩個(gè)主體部分保持各自完整的結(jié)構(gòu)，使TMP能有效地結(jié)合巨核細(xì)胞表面的TPO受體，所述TMP與hGH之間用橋接肽連接。優(yōu)選地，所述TMP與hGH之間設(shè)有0到15個(gè)氨基酸組成的橋接肽，更優(yōu)選地，以由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 5個(gè)氨基酸組成的短肽。
本發(fā)明的融合蛋白包括兩種形式，一種形式是TMP位于融合蛋白的N-末端，hGH位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO3)；另一種形式是hGH位于融合蛋白的N-末端，TMP位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO4)，優(yōu)選的是前一種形式。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ IDNO5和6)和攜帶該DNA序列的重組表達(dá)載體。
編碼hGH的多聚核苷酸可以用PCR、RT-PCR及人工合成的方法獲得。用作PCR模板的cDNA可以從人胎肝cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech Laboratories Inc.USA)獲得，用作RT-PCR的mRNA模板可以來(lái)源于人垂體組織。通過人工合成方法獲得時(shí)，為了提高融合蛋白的表達(dá)量，可以選用宿主偏愛的密碼子。編碼TMP和橋接肽的多聚核苷酸可以通過人工合成而加載在hGH基因PCR引物的5′端，在PCR擴(kuò)增hGH基因同時(shí)獲得與其融合的TMP DNA片段。
由于hGH的第53位與第165位和第182位與189位之間有兩個(gè)二硫鍵形成，為保證重組融合蛋白能形成正確的空間構(gòu)像，所表達(dá)的重組融合蛋白最好是以可溶性形式存在。本發(fā)明的融合蛋白的重組表達(dá)載體包括pMAL/TMP-hGH及pPIC9K/TMP-hGH質(zhì)粒等。
表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主可以是細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，優(yōu)選地，原核表達(dá)的宿主是大腸桿菌，真核表達(dá)的宿主是畢赤酵母。
本發(fā)明的又一個(gè)目的，是提供制備重組靶向促血小板生成的融合蛋白的方法。將攜帶編碼重組靶向促血小板生成融合蛋白DNA序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，分離、純化所述重組靶向促血小板生成的融合蛋白。
對(duì)于重組表達(dá)的本發(fā)明融合蛋白可以通過多種方法從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行提取、純化，這些方法包括粗提、鹽析及液相層析等本領(lǐng)域常用的技術(shù)，其中液相層析又包括了離子交換、親和、疏水等層析技術(shù)。
因此，制備本融合蛋白的方法，包括以下步驟1.hGH的克??；2.TMP與hGH融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；3.TMP-hGH融合蛋白的純化。
本發(fā)明的融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑進(jìn)行使用，這些藥物載體包括水、鹽水、糖類等。由本發(fā)明融合蛋白制成的藥物制劑優(yōu)選的是含水液體制劑和含水量低于10％或不含水的凍干制劑，這些藥物制劑可以通過靜脈輸注或注射(包括皮下和肌肉注射)進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的融合蛋白及其藥物制劑可用于治療多種原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥等疾病，這些疾病包括再生障礙性貧血、白血病、淋巴瘤、原發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性腎病、急性放射病、腫瘤放/化療引起的血小板減少等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明重組靶向促血小板生成融合蛋白，是具TMP和hGH活性的融合蛋白。它使TMP和hGH在促巨核細(xì)胞增殖—血小板生成方面的作用得到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。一方面，TMP通過與hGH融合而變得更加穩(wěn)定，半衰期也被顯著延長(zhǎng)，同時(shí)還能夠與hGH一起通過基因工程方法進(jìn)行重組制備；另一方面，hGH通過與TMP融合，即可借助TMP識(shí)別和結(jié)合巨核細(xì)胞表面的TPO受體而靶向地刺激巨核細(xì)胞增殖、分化，顯著提高h(yuǎn)GH在促血小板生成方面的生物利用度，減少其使用劑量。此外，本發(fā)明的融合蛋白還能夠通過TPO受體途徑(由TMP介導(dǎo))和非TPO受體途徑(由hGH介導(dǎo))兩種不同的路徑同時(shí)作用于巨核細(xì)胞，使得促巨核細(xì)胞增殖—血小板生成的作用得到協(xié)同與加強(qiáng)。因此，本發(fā)明融合蛋白能夠靶向性地刺激巨核細(xì)胞增殖與分化，具有高效低毒的升血小板作用，適用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥等疾病，效果良好。


圖1為pMAL/TMP-hGH重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖2為pPIC9K/TMP-hGH重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖3為TMP-hGH融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。
圖4為TMP-hGH融合蛋白的升血小板活性分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
材料1Pyrobest TM DNA Polymerase PCR試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)2.pMD18-T載體克隆試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)3.T4DNA連接酶(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)4.EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、Sac I、XmnI等內(nèi)切酶(New EnglandBioLabs公司產(chǎn)品，美國(guó))5.質(zhì)粒載體pMAL-c2x(New England BioLabs公司產(chǎn)品，美國(guó))6.質(zhì)粒載體pPIC9K(Invitrogen公司產(chǎn)品，美國(guó))7.胎肝cDNA文庫(kù)(Clontech公司產(chǎn)品，美國(guó))8.Amylose resin柱(New England BioLabs公司產(chǎn)品，美國(guó))9.大腸桿菌DH5α(本室保存)10.大腸桿菌YZ2000(Gene Bridges公司產(chǎn)品，德國(guó))11.酵母菌GS115(Invitrogen公司產(chǎn)品，美國(guó))12.G418、氨芐青霉素(Roche公司產(chǎn)品，德國(guó))13Supdex 200層析柱(Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品，英國(guó))14.酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、無(wú)氨基酸酵母氮源(Oxford公司產(chǎn)品，美國(guó))15.LB培養(yǎng)基酵母提取物5g胰蛋白胨 10gNaCl10g溶于1000ml去離子水中，并用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，高壓蒸氣滅菌。
16.YPD培養(yǎng)基酵母提取物2g胰蛋白胨 4g溶于180ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml經(jīng)濾器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml濃度為100mg/ml的氨芐青霉素。
17.磷酸鹽緩沖液NaCl8gKCl 0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g溶于水1000ml，并用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，高壓滅菌。
18.BMGY培養(yǎng)基酵母提取物2g胰蛋白胨 4g溶于140ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml濾器除菌后濃度為13.4％的無(wú)氨基酸酵母氮源貯存液、20ml 1mol/L磷酸鹽緩沖液、20ml 10％甘油、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨芐青霉素。
19.BMMY培養(yǎng)基酵母提取物 2g胰蛋白胨 4g溶于140ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml濾器除菌后濃度為13.4％的無(wú)氨基酸酵母氮源貯存液、20ml 1mol/L磷酸鹽緩沖液、20ml 5％甲醇、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨芐青霉素。
20.重組人IL-11(Genetics Institute公司產(chǎn)品，美國(guó))實(shí)施例1hGH的克隆從胎肝cDNA文庫(kù)中通過PCR方法獲得hGH基因的cDNA序列，擴(kuò)增所用的PCR上、下游引物分別為GH1和GH2。GH1和GH2的堿基序列如下GH-15′-ATG TTC CCA ACT ATT CCA CTG-3′GH-25′-TTA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′PCR的反應(yīng)體系為100ul，其中含引物GH-1和GH-2各100pmol，20nmol的dNTP，1ul胎肝cDNA文庫(kù)，10×PCR反應(yīng)緩沖液10ul，高保真的Pyrobest DNA聚合酶5U。PCR的反應(yīng)條件為第一階段95℃預(yù)變性5分鐘；第二階段94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)32次；第三階段72℃延伸5分鐘，10℃放置10分鐘。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)可見約600bp大小電泳帶，將PCR產(chǎn)物回收、純化后與pMD18-T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選后，挑取LB平板上的克隆于LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩過夜，次日提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，對(duì)于有600bp大小DNA片段出現(xiàn)的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明陽(yáng)性重組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中插入的DNA片段即是完整的hGH cDNA，該重組質(zhì)粒命名為pMD-hGH。
實(shí)施例2TMP與hGH融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定為使TMP能與hGH形成融合蛋白，首先設(shè)計(jì)合成以下兩條PCR引物MH-15′-ACTGAT ATCGAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCACGT GCT GGT TCT GGT TCT GGT TTC CCA ACT ATT CCA CTG AG-3′MH-25′-AGTAAG CTTTTA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′在MH-1中下畫線部分為內(nèi)切酶EcoRV的識(shí)別位點(diǎn)，黑體部分為編碼TMP(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，斜體部分為編碼橋接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly的核苷酸序列。在MH-2中下畫線部分為內(nèi)切酶Hind III的識(shí)別位點(diǎn)。
如圖1所示，以pMD-hGH質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增hGH基因，PCR的擴(kuò)增條件同上。所獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)為650bp左右，回收PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行EcoR V和Hind III雙酶切。酶切后的PCR產(chǎn)物與經(jīng)Xmn I和Hind III雙酶切后的質(zhì)粒載體pMAL-c2x進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑菌并過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Sac I和Hind III雙酶切后可見700bp左右DNA片段出現(xiàn)。對(duì)此重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明在pMAL-c2x質(zhì)粒的Xmn I和Hind III位點(diǎn)之間插入有與序列信息表SEQ IDNO5堿基序列一致的DNA片段。該重組質(zhì)粒命名為pMAL/TMP-hGH1，其表達(dá)的融合蛋白N端為TMP，C端為hGH，在TMP與hGH之間有Gly-Ser-Gly-Ser-Gly進(jìn)行連接。
同理，將PCR引物MH-1和MH-2更換為MH-3和MH-4，采用相同的方法獲得重組質(zhì)粒pMAL/TMP-hGH2。該重組質(zhì)粒的Xmn I和Hind III位點(diǎn)之間插入有與序列信息表SEQ ID NO6堿基序列一致的DNA片段，其表達(dá)的融合蛋白N端為hGH，C端為TMP，中間是橋接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly。
MH-3和MH-4的堿基序列如下MH-35′-ACTGAA GGA TTT CAT TCC CAA CTA TTC CAC TGA G-3′MH-45′-AGTAAG CTTTTA AGC ACG TGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGTCGG ACC TTC GAT CCA AGA CCA AGA CCA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′在MH-3中下畫線部分為內(nèi)切酶Xmn I的識(shí)別位點(diǎn)。在MH-4中下畫線部分為內(nèi)切酶Hind III的識(shí)別位點(diǎn)，黑體部分為編碼TMP(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，斜體部分為編碼橋接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly的核苷酸序列。
將上述所獲得的重組質(zhì)粒pMAL/TMP-hGH1和pMAL/TMP-hGH2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1感受態(tài)細(xì)胞，并從中隨機(jī)各挑選10個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)條件選擇終濃度為0.5mM的IPTG 37℃誘導(dǎo)4小時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12％的SDS-PAGE電泳。TMP-hGH融合蛋白的分子量應(yīng)在24KD左右，在重組質(zhì)粒pMAL/TMP-hGH1和pMAL/TMP-hGH2中該蛋白會(huì)與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP進(jìn)行融合表達(dá)，所以最終形成的目的蛋白分子量約為66.5KD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示每個(gè)克隆菌中均有分子量約為66.5KD的蛋白表達(dá)，其中各有5個(gè)克隆菌表達(dá)最高，蛋白表達(dá)量達(dá)40％左右。進(jìn)一步經(jīng)過Amylose resin柱純化和Xa因子切除MBP(42.5KD)，可見有24KD左右蛋白釋放出來(lái)，其分子大小與TMP-hGH融合蛋白一致。由于90％以上的目的蛋白都在上清中，表明TMP與hGH的融合蛋白主要是以可溶性形式表達(dá)。
在得到TMP-hGH融合蛋白的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pMAL/TMP-hGH1后，又設(shè)計(jì)合成以下兩條寡核苷酸序列MH-55′-GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT ATCGAA GGT CCG ACT CTG CGT C-3′MH-65′-CCA ACT TGA ACT GAG GAA CAG TCA TGT CTA AGG CGA ATT AGAAGC CAC ACG ACC CTT C-3′其中MH-5中斜體部分為pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)之前的50個(gè)堿基的序列，MH-6中斜體部分為pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)之后的50個(gè)堿基的序列。
如圖2所示，以pMAL/TMP-hGH1質(zhì)粒DNA為模板，以MH-5和MH-6為引物，PCR擴(kuò)增TMP-hGH1的基因序列，PCR方法同前所述。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)可見730bp左右DNA片段，取1ug該P(yáng)CR產(chǎn)物與1ug經(jīng)EcoR I酶切線性化后的pPIC9K質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)化YZ2000大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(該細(xì)胞具有Red/ET同源重組功能)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂于氨芐青霉素LB平板，挑取菌落，以MH-5和MH-6為引物進(jìn)行菌落PCR。菌落PCR條件如下反應(yīng)體系為15ul，其中加入MH-5和MH-6各15pmol、dNTP 4nmol、菌落與LB的混合液1ul、1.5ul的10×PCR反應(yīng)緩沖液和1U的Taq DNA聚合酶；PCR反應(yīng)條件同前。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)有730bp DNA片段出現(xiàn)的菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明在pPIC9K質(zhì)粒中的Ste13蛋白酶切位點(diǎn)后面連有與序列信息表SEQ IDNO5完全一致的DNA序列。該重組質(zhì)粒命名為pPIC9K/TMP-hGH1。
同樣方法，以MH-7和MH-8為引物，以pMAL/TMP-hGH2質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼TMP-hGH2的DNA片段，經(jīng)Red/ET同源重組獲得pPIC9K/TMP-hGH2表達(dá)質(zhì)粒。MH-7和MH-8的堿基序列如下
MH-75′-GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT TTCCCA ACT ATT CCA CTG AG-3′MH-85′-CCA ACT TGA ACT GAG GAA CAG TCA TGT CTA AGG CGA ATT AAGCAC GTG CAG CCA GCC AC-3′其中MH-7中斜體部分為pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)之前的50個(gè)堿基的序列，MH-8中斜體部分為pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)之后的50個(gè)堿基的序列。
由于pPIC9K/TMP-hGH1和pPIC9K/TMP-hGH2質(zhì)粒中融合蛋白與Ste13蛋白酶切位點(diǎn)之間沒有多余的堿基序列存在，所以由該重組質(zhì)粒表達(dá)的TMP與hGH融合蛋白的N端就不會(huì)有任何多余的氨基酸存在。將測(cè)序正確的pPIC9K/TMP-hGH1和PIC9K/TMP-hGH2質(zhì)粒DNA線性化后轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂于氨芐青霉素抗性的YPD固體培養(yǎng)基平板，菌落PCR鑒定TMP-hGH融合基因DNA片段的存在(方法同前)，對(duì)于陽(yáng)性克隆按常規(guī)方法再次進(jìn)行Mut表型鑒定和抗性篩選后，對(duì)Mut陽(yáng)性、可耐受高濃度G418的陽(yáng)性菌落，接種培養(yǎng)后于-70℃保存菌種。
實(shí)施例3工程酵母的發(fā)酵及TMP-hGH融合蛋白的純化取-70℃保存的含有pPIC9K/TMP-hGH的酵母工程菌種接種于YPD平板活化，挑取外觀優(yōu)良的單個(gè)菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，28℃～30℃恒溫?fù)u床280rpm振蕩培養(yǎng)16～18小時(shí)至OD600≈4，以此菌液為種子液。然后將種子液接種于裝有2.5L BMMY培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐(B.Braun公司，德國(guó))進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵溫度控制在30℃，溶氧大于20％飽和度，pH值在5.0左右，培養(yǎng)至OD600≈150時(shí)開始補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)，使甲醇的終濃度始終保持在1％左右。誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后離心取上清，加入20％硫酸胺，混勻，4℃放置過夜，離心取沉淀。所得沉淀用pH值為7.0的0.025mol/L Tris-HCL溶解，然后過Supdex 2001.6×100cm柱進(jìn)行層析分離，收集并獲得純化的融合蛋白。上述純化所得融合蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE電泳檢測(cè)可見大小為24KD的單一蛋白帶(圖3)。HPLC顯示為單一蛋白峰，純度大于99％。
純化后的TMP-hGH融合蛋白經(jīng)Lowry法測(cè)定蛋白濃度后，用0.15mol/L NaCL、20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋并無(wú)菌過濾，可制成水針；加入2.5％甘露醇后則可進(jìn)行凍干并制成白色粉針。
實(shí)施例4重組TMP-hGH融合蛋白的體內(nèi)分布與代謝用同位素125I標(biāo)記純化后的重組TMP-hGH融合蛋白。按1.7mg/kg劑量給小鼠口服(灌胃)碘化鉀以抑制125I與甲狀腺的結(jié)合，24h后再給小鼠靜脈注射上述125I標(biāo)記的重組MP-hGH融合蛋白，在此之后的3h、6h、12h、24h和48h活殺動(dòng)物，分別取血液、心、肝、肺、腎、骨髓等臟器，用放免計(jì)數(shù)儀進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)(cpm/mg)。
如表1所示靜脈注入后3h以內(nèi)，除血液和胃組織外，重組TMP-hGH融合蛋白均勻分布于全身各組織；之后該融合蛋白主要聚集在骨髓組織中，并于6h左右達(dá)最高峰，而它在其它組織中的含量則顯著降低。分解代謝結(jié)果顯示該融合蛋白在骨髓中的半衰期約為42小時(shí)。
表125I標(biāo)記TMP-hGH融合蛋白在小鼠不同臟器組織中的放射性計(jì)數(shù)(cpm/mg)時(shí)間(h) 血液 心臟肝 腎 大腦肺 胃 小腸肌肉 骨髓股骨3 38.161.521.262.250.552.2713.973.801.24.721.736 15.481.401.192.020.402.173.82 1.301.02 5.751.9412 1.80 0.650.590.990.290.902.72 0.650.89 4.001.4924 1.30 0.650.560.830.190.961.80 0.720.41 3.140.7948 0.67 0.570.580.410.160.490.53 0.290.58 2.850.55實(shí)施例5重組TMP-hGH融合蛋白的升血小板活性測(cè)定以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，60Coγ射線5Gy全身一次性照射實(shí)驗(yàn)小鼠，復(fù)制輻射損傷致血小板減少癥動(dòng)物模型(這種情況常見于急性放射病和腫瘤放療所致的血小板減少癥)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分三組第一組照射后給予重組TMP-hGH融合蛋白治療，100ug/kg/d，皮下注射，連續(xù)用14天；第二組照射后給予目前臨床上用于治療血小板減少癥的特效藥重組人IL-11治療，50ug/kg/d，皮下注射，連續(xù)用14天；第三組為生理鹽水對(duì)照組。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖4所示應(yīng)用本發(fā)明的TMP-hGH融合蛋白可以顯著抑制受照射小鼠外周血血小板的減少，顯示出較強(qiáng)的升血小板活性，其效果甚至優(yōu)于重組人IL-11。
結(jié)論由于輻射損傷致血小板減少在血小板減少癥疾病中具有很強(qiáng)的代表性，因此，從實(shí)施例5的結(jié)果可以表明，重組TMP-hGH融合蛋白用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥疾病，效果良好。同樣，重組TMP-hGH融合蛋白用于治療其它的原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥疾病，可以達(dá)到本發(fā)明同樣的效果。
本發(fā)明為采用重組靶向促血小板生成的融合蛋白在臨床上治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥疾病提供了新的途徑。
SEQUENCE LISTING(序列信息表)<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>一種重組靶向促血小板生成的融合蛋白及其制備<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>14<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>TPO模擬肽的氨基酸序列<400>1Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala1 510<210>2<211>191<211>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr50 55 60Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu65 70 75Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val80 85 90
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95 100 105Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly110 115 120Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125 130 135Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser140 145 150His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155 160 165Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val170 175 180Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe185 190<210>3<211>210<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素融合蛋白-1的氨基酸序列，其中TPO模擬肽區(qū)位于融合蛋白的N-末端，人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)位于融合蛋白的C-末端，兩者之間由橋接肽“GSGSG”進(jìn)行連接<400>3Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp20 25 30Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp35 40 45Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys50 55 60Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu65 70 75Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser80 85 90Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp95 100 105
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu110 115 120Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp125 130 135Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly140 145 150Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe155 160 165Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly170 175 180Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe185 190 195Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe200 205 210<210>4<211>210<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素融合蛋白-2的氨基酸序列，其中TPO模擬肽區(qū)位于融合蛋白的C-末端，人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)位于融合蛋白的N-末端，兩者之間有橋接肽“GSGSG”進(jìn)行連接<400>4Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr50 55 60Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu65 70 75Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val80 85 90Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95 100 105
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly110 115 120Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125 130 135Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser140 145 150His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155 160 165Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val170 175 180Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly Ser Gly Ser185 190 195Gly Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala200 205 210<210>5<211>630<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>編碼TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素融合蛋白-1的DNA序列<400>5atcgaaggtc cgactctgcg tcagtggctg gctgcacgtg ctggttctgg ttctggtttc 60ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 120caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 180tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 240tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 300ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 360gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 420cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 480acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 540ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 600tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc 630
<210>6<211>630<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>編碼TPO模擬肽與人生長(zhǎng)激素融合蛋白-2的DNA序列<400>6ttcccaacta ttccactgag tcgcctgttc gataacgcga tgctgcgtgc gcatcgtctg 60caccaactgg ctttcgacac ttaccaggag ttcgaagaag catacatccc gaaagaacag 120aaatacagct tccttcagaa cccacagacc tcgttgtgtt tctctgaaag tatcccgacc 180ccttctaacc gcgaagagac ccagcagaaa tcgaaccttg aactgcttcg tatctcgctg 240cttctcattc agtcgtggct ggagccagta cagttcctgc gttcggtttt cgcaaactca 300ctggtttacg gtgcgtctga cagtaacgtt tacgacctgc tgaaagacct tgaagaaggg 360atccagaccc tgatgggtcg cctggaagat ggttcaccac gcactggtca gatcttcaaa 420cagacttact ccaaattcga tactaactct cataacgatg atgctctgct gaaaaactac 480ggcctgctgt actgtttccg taaagatatg gataaagttg aaactttcct gcgtatcgtt 540cagtgtcgtt ctgttgaagg gtcgtgtggc ttcggttctg gttctggtat cgaaggtccg 600actctgcgtc agtggctggc tgcacgtgct 630
權(quán)利要求
1.一種重組靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于由TPO模擬肽區(qū)和人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模擬肽區(qū)的氨基酸具有SEQ ID NO1序列；人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)的氨基酸與人生長(zhǎng)激素氨基酸殘基序列同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模擬肽區(qū)位于融合蛋白的N-末端，人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)位于融合蛋白的C-末端；或TPO模擬肽區(qū)位于融合蛋白的C-末端，人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)位于融合蛋白N-末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模擬肽區(qū)與人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)之間設(shè)有橋接肽進(jìn)行連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于橋接肽為0到15個(gè)氨基酸組成的橋接肽。
6.編碼權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的重組靶向促血小板生成的融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6序列。
7.包含權(quán)利要求6所述的DNA序列的重組表達(dá)載體。
8.制備重組靶向促血小板生成的融合蛋白的方法，包括將融合蛋白攜帶權(quán)利要求7所述DNA序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，分離、純化所述重組靶向促血小板生成的融合蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備重組靶向促血小板生成的融合蛋白的方法，其特征在于原核表達(dá)的宿主為大腸桿菌，真核表達(dá)的宿主為酵母。
10.重組靶向促血小板生成融合蛋白用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組靶向促血小板生成的融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明公開了一種重組靶向促血小板生成的融合蛋白，它包括TPO模擬肽區(qū)和人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)，在TPO模擬肽區(qū)與人生長(zhǎng)激素多肽區(qū)之間設(shè)有橋接肽。本發(fā)明還公開了重組靶向促血小板生成的融合蛋白制備方法和用途。本發(fā)明不僅能夠使生長(zhǎng)激素靶向性地作用于巨核細(xì)胞，而且還有效延長(zhǎng)了TPO模擬肽的半衰期，使TPO模擬肽和生長(zhǎng)激素在促血小板生成方面的作用得到了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)與加強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明融合蛋白能夠靶向性地刺激巨核細(xì)胞增殖與分化，具有高效低毒的升血小板作用，適用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥等疾病，效果良好。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1737012SQ20051005721
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者王軍平, 粟永萍, 艾國(guó)平, 劉曉宏, 程天民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)