專利名稱：來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串聯(lián)表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)基因重組合成的制藥領(lǐng)域，尤其是一種來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是一種由艾滋病病毒，即人體免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多種不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致被感染者死亡的一種嚴重傳染病。它主要通過血液、性接觸、母嬰傳播等途徑在人群中迅速蔓延，但又缺乏有效的預(yù)防疫苗與治療藥物，被認為是21世紀的瘟疫。最新的研究發(fā)現(xiàn)，中國人比白人和黑人更容易感染HIV病毒，使我們面臨更大的挑戰(zhàn)。
雖然近年AIDS治療的臨床療效明顯提高，但由于HIV的高度變異性、化療藥物不能完全清除病毒且毒副作用極大、艾滋病治療費用高昂等因素，市場上尚未有十分有效的治療藥物出現(xiàn)，現(xiàn)有公布的研究成果存在毒副作用大、耐藥性以及作用機制等諸多問題，離真正的新藥上市還有漫長的距離。
病毒巨嗜細胞炎性蛋白-II(virus macrophage inflammatory protein-II，vMIP-II)是由人皰疹病毒8的K4基因編碼的一種病毒趨化因子，與人CC類趨化因子有較大的同源性，是人趨化因子的類似物。vMIP-II的全基因編碼95個氨基酸，前二十三個為信號肽序列，最后的一個精氨酸也在蛋白折疊完成后被去除，最后發(fā)揮功能的蛋白具有71個氨基酸殘基，此蛋白與人的MIP同源性高達41％。vMIP-II與趨化因子受體結(jié)合后不引起胞內(nèi)Ca2+迅速內(nèi)流，故不引起信號傳導(dǎo)，從而對趨化因子與相應(yīng)受體的結(jié)合起到拮抗作用。vMIP-II和CC、CXC趨化因子受體都能結(jié)合，所以對趨化因子有廣譜的拮抗作用。vMIP-II不同于其他趨化因子的一個獨特特點是它能夠拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等在內(nèi)的多種趨化因子受體，特別是對CCR5和CXCR4有較高的親和力。
由于趨化因子與其受體的相互作用控制著各種免疫細胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間定向遷移，使之到達感染、創(chuàng)傷和異常增殖部位，執(zhí)行清除感染源、促進創(chuàng)傷愈合和消滅異常增殖細胞、維持組織細胞平衡的功能。因此趨化因子系統(tǒng)在免疫系統(tǒng)功能行使的各個環(huán)節(jié)中處于關(guān)鍵地位，并由此在病原體的清除、炎癥反應(yīng)、病原體感染、細胞及器官的發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤形成及其轉(zhuǎn)移、移植免疫排斥等方面都起著重要的作用；具有以趨化因子及其受體分子為藥物靶點，通過激活或拮抗趨化因子受體的信號傳導(dǎo)來調(diào)控趨化因子系統(tǒng)的功能。在預(yù)防和治療艾滋病方面具有光明的前景。所以近年來來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II成為國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點。然而來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽在治療艾滋病的相關(guān)報道至目前還沒有出現(xiàn)過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程技術(shù)來獲得具有預(yù)防和治療艾滋病的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的新的方法—基因工程串聯(lián)表達方法以及其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的基因表達方法是以病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽為目標對象，建立一種利用真核表達系統(tǒng)獲得該段短肽的新方法——基因工程串聯(lián)表達方法，即合成一段基因其中包含若干個該15肽基因，他們之間通過蛋白酶酶切序列基因連接起來，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位點，通過基因重組的方法將該基因連接到質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)化酵母菌，進行篩選，表達和目的蛋白純化，純化后的蛋白再經(jīng)過蛋白酶的酶切，分離純化得到目標肽。
所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的基因表達方法可以利用原核、真核及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以凝血酶酶切位點序列作為中間連接的串聯(lián)表達病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽單肽；基因重組序列可以設(shè)計為
CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac agacca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggtgct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGAGGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tacTTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tggcac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCCttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTCCCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG其中，N端15肽優(yōu)化后核酸序列ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac凝血酶酶切核酸優(yōu)化后序列TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的基因表達方法可以利用原核、真核及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以多個病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)為單位以凝血酶酶切位點序列作為中間連接的串聯(lián)表達；基因重組序列可以設(shè)計為CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cacaga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt tgcaag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTG GTC CCA AGA GGT TCCttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTGGTC CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG其中，反向氨基酸序列的核酸序列tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cactgg tcc gct ggt ttg
Linker(序列為4個組氨酸)核酸序列為gct gct gct gct。
所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的基因表達方法可以是多個病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽串聯(lián)并且與自斷裂序列相連接的表達；基因重組序列可以設(shè)計為CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggttac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tccgct ggt ttg CTCGAGGAC….tag自斷裂的病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽或自斷裂的病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽 tag CTAGCTAGC ttg ggt gcttcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct ttg ggtgct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct tacggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg CTCGAGGAC。
所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽與病毒巨噬細胞炎性蛋白II具有相同的CXCR4趨化因子受體結(jié)合活性，可以用于預(yù)防和治療艾滋病。
本發(fā)明病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽具有對CXCR4具有特異性拮抗作用，可以用于預(yù)防和治療艾滋病。本發(fā)明提供的基因串聯(lián)表達方法為得到該肽開辟了新的方法，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的前景。
具體實施例方式
實施例1首先從成熟病毒巨噬細胞炎性蛋白II基因中找到其N端15肽的基因序列，5’ctg gga gcg tcc tgg cat aga ccg gac aag tgc tgt ctc ggt tac 3’氨基酸序列為LGASWHRPDKCCLGY。
根據(jù)酵母對密碼子的偏好性對其進行優(yōu)化，其優(yōu)化后的序列為，ttg ggt gct tcctgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac，反向氨基酸序列的核酸序列為tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg，反向氨基酸序列YGLCCKDPRHWSAGL。
蛋白酶選用凝血酶，其酶切的氨基酸序列為L-V-P-R↓G-S酶切位點已標明，核酸序列為CTG GTC CCC CGG GGC AGC根據(jù)酵母對密碼子的偏好性對其進行優(yōu)化，其優(yōu)化后的序列為，TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
設(shè)計合成的基因序列為CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga ccagac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gcttcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGTTCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTCCCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga ccagac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gcttcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGTTCC TC TCTAGACTG共416個核苷酸。
利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xba I和T4DNA連接酶進行酶切連接將其連接到中間載體質(zhì)粒PMD-18上，對重組質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。將鑒定后的重組質(zhì)粒PMD-18轉(zhuǎn)化空白大腸桿菌進行質(zhì)粒放大，然后從中提取質(zhì)粒rPMD-18，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xba I將目的基因切下來回收，然后用T4 DNA連接酶將其連接到經(jīng)酶切后的目標載體pPICZ a A上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用含抗生素Zeocin的LB平板進行篩選，對篩選得到的菌體提取質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定，對鑒定陽性的菌體進行保菌。
對上述陽性菌進行放大培養(yǎng)，從中提取重組質(zhì)粒。對質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sac I進行線性化處理，同時制備酵母感受態(tài)。經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌中，利用含Zeocin的YPD平板培養(yǎng)基進行篩選，直至出現(xiàn)單菌落。對單菌落在含有Zeocin的液體培養(yǎng)基中進行放大培養(yǎng)，保存菌種。
利用上述得到的含有重組質(zhì)粒的酵母菌進行小量誘導(dǎo)表達目的蛋白。將菌種接種于5ml YPD培養(yǎng)基中，30℃180rpm振蕩過夜后，按1％體積接種于20mlBMGY培養(yǎng)基，28℃180rpm搖瓶培養(yǎng)過夜，離心抽取菌體沉淀，轉(zhuǎn)移入100mlBMMY中，28℃180rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-3天，并于誘導(dǎo)表達起始后，每隔24h補加100％甲醇，體積為培養(yǎng)基總體積的0.1％。
將誘導(dǎo)表達后的菌液經(jīng)3500rpm，20min離心去除酵母菌，將表達上清用0.45um微膜過濾，然后將濾液再用0.22um的濾膜過濾一次，除大分子物質(zhì)及脂類。應(yīng)用Ni親和層析柱進行純化，Ni親和層析柱純化所用平衡緩沖液為25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，PH 7.4，洗脫緩沖液為25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，350mmol咪唑，PH 7.4，經(jīng)洗脫，收集洗脫峰蛋白。將得到的蛋白溶液再經(jīng)過一次Ni親和層析柱純化，收集蛋白峰，將收集的蛋白溶液進行透析，凍干，得到目的蛋白。
利用蛋白酶對目的蛋白進行酶切，充分酶切后得到多肽溶液，利用Super dex-75分子篩層析柱進行純化，所用緩沖液為25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，PH 7.4，收集蛋白峰溶液，進行SDS-PAGE電泳分析確定目的多肽峰溶液，透析，凍干得到來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽。
實施例2設(shè)計合成基因如下所用質(zhì)粒為pTYB1CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggttac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tccgct ggt ttg CTCGAGGAC….tag(自斷裂)按照上述基因序列合成目的基因，通過基因重組構(gòu)建重組質(zhì)粒pTYB1-target gene，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含有青霉素(100ug/ml)的LB平板進行篩選，對篩選得到的大腸桿菌單菌落進行放大培養(yǎng)，從中提取質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定，篩選陽性克隆。
將陽性菌于LB培養(yǎng)基(含青霉素100ug/ml)中培養(yǎng)，溫度為37℃，當OD值達到0.5～0.8時進行IPTG誘導(dǎo)表達，IPTG終濃度為0.3～0.5Mm，誘導(dǎo)溫度為15～20℃。誘導(dǎo)過夜。
誘導(dǎo)表達后5000g離心10min得到菌體，用柱平衡緩沖液[20mMTris-Cl(PH6.0～8.5)，500mM NaCl，1mM EDTA]重懸菌體，進行超聲破碎細胞，然后將破碎后混懸液上chitin親和柱。
用至少10倍柱平衡緩沖液進行洗脫，直至非特異性結(jié)合蛋白全部被洗脫。然后用3倍的自斷裂緩沖液[20mM Tris-Cl(PH8.0)，500mM NaCl，1mM EDTA，50mMDTT或半胱氨酸]快速平衡親和柱，停止洗脫，在4℃～23℃的環(huán)境下誘導(dǎo)自斷裂16～40小時。
誘導(dǎo)自斷裂后，用柱平衡緩沖液繼續(xù)洗脫，收集蛋白峰，即為目的蛋白，進行SDS-PAGE分析，透析，凍干即得來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽。
以上方法得到的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽可以通過趨化抑制實驗檢測其活性。通過大量的實驗證明，通過基因工程串聯(lián)方法得到的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽與病毒巨噬細胞炎性蛋白II一樣具有良好的預(yù)防和治療艾滋病的功效，將在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的前景。
權(quán)利要求
1.一種來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法，其特征在于以病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽為目標對象，利用真核表達系統(tǒng)獲得合成一段基因其中包含若干個該15肽基因，他們之間通過蛋白酶酶切序列基因連接起來，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位點，通過基因重組的方法將該基因連接到質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)化酵母菌，進行篩選，表達和目的蛋白純化，純化后的蛋白再經(jīng)過蛋白酶的酶切，分離純化而得到目標肽的基因工程串聯(lián)表達方法。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法，其特征在于利用原核、真核及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以凝血酶酶切位點序列作為中間連接的串聯(lián)表達病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽單肽，基因重組序列設(shè)計為CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac agacca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggtgct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGAGGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tacTTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tggcac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCCttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTCCCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG其中，N端15肽優(yōu)化后核酸序列ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac凝血酶酶切核酸優(yōu)化后序列TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
3.如權(quán)利要求1所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法，其特征在于利用原核、真核及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以多個病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)為單位以凝血酶酶切位點序列作為中間連接的串聯(lián)表達；基因重組序列設(shè)計為TCTCTAGACTG TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tggcac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgttgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTG GTC CCA AGA GGTTCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttgTTG GTC CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG其中，反向氨基酸序列的核酸序列tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cactgg tcc gct ggt ttg4個組氨酸核酸的Linker序列為gct gct gct gct。
4.如權(quán)利要求1所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法，其特征在于多個病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽串聯(lián)并且與自斷裂序列相連接的表達；基因重組序列設(shè)計為CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggttac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tccgct ggt ttg CTCGAGGAC tag自斷裂的病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽或自斷裂的病毒巨噬細胞炎性蛋白 II N端 15 肽tag CTAGCTAGC ttg ggtgct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct ttgggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gcttac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg CTCGAGGAC…。
5.如權(quán)利要求1，2，3或4所述的來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法所得的短肽在預(yù)防和治療艾滋病的應(yīng)用。
全文摘要
一種來源于病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽的串聯(lián)表達方法是以病毒巨噬細胞炎性蛋白II N端15肽為目標對象，利用真核表達系統(tǒng)合成一段基因其中包含若干個該15肽基因，他們之間通過蛋白酶酶切序列基因連接起來，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位點，通過基因重組的方法將該基因連接到質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)化酵母菌，進行篩選，表達和目的蛋白純化，純化后的蛋白再經(jīng)過蛋白酶的酶切，分離純化得到目標肽的基因工程串聯(lián)表達方法。該多肽是特異性拮抗CXCR4的15肽，對預(yù)防和治療艾滋病具有良好的功效，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的前景。
文檔編號A61K38/17GK1928088SQ200610036429
公開日2007年3月14日 申請日期2006年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日
發(fā)明者葉石敦, 趙寶梅 申請人:廣州法蕊仕藥業(yè)科技有限公司