專利名稱：突變的2,5二酮基－d－葡萄糖酸還原酶及其基因工程表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種突變的2,5二酮基-D-葡萄糖酸(2,5DKG)還原酶及其基因工程表達系統(tǒng)，適用于改進葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)生2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。
2-KLG工業(yè)上目前多采用“萊氏法”和“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)，這兩種方法均以山梨醇為原料，工業(yè)上以葡萄糖高壓加氫制得山梨醇。這樣制備既不安全又浪費，使整個工藝比較復雜。70年代中后期發(fā)明了從葡萄糖發(fā)酵生成中間體2,5-DKG，然后再發(fā)酵生成2-KLG的“二步串聯(lián)發(fā)酵法”。但是串聯(lián)發(fā)酵法的第二步棒狀桿菌發(fā)酵利用底物2,5-DKG的濃度受到限制，總轉(zhuǎn)化率不高，發(fā)酵液中最終2-KLG濃度只能達到15mg/ml左右。而且仍然要分兩個步驟完成。
葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵的第二步發(fā)酵原理是棒狀桿菌中的小分子量單鏈蛋白2,5-DKG還原酶催化2,5-DKG生成2-KLG的過程。它能在C-5位置立體專一地將2,5-DKG還原為2-KLG。利用重組DNA技術(shù)，把棒狀桿菌中的2,5-DKG還原酶基因克隆表達到歐文氏菌中，構(gòu)建一個基因工程菌，將實現(xiàn)葡萄糖一步發(fā)酵產(chǎn)生2-KLG。Anderson等人首先采用篩選基因文庫的方法從棒狀桿菌克隆到了一個2,5-DKG還原酶基因，并且構(gòu)建了利用葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生2-KLG的基因工程歐文氏菌。此后另一個2,5-DKG還原酶基因也被Hardy等人用類似的方法從棒狀桿菌克隆得到。但是表達量和酶活較低，難以在工業(yè)上應用。
本發(fā)明的目的是建立一項實用的生物合成2,5DKG還原酶的技術(shù)，為構(gòu)建成功利用葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生2-KLG的基因工程菌和改進葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵工藝奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明主要通過聚合酶鏈反應(PCR)方法從棒狀桿菌SCB3058(本實驗室篩選)克隆獲得突變的2,5-DKG還原酶Ⅰ，并高效表達在大腸桿菌和最終表達在歐文氏菌SCB125(本實驗室篩選)來實現(xiàn)發(fā)明目的。利用PCR技術(shù)，以基因組DNA為模板，優(yōu)化PCR反應條件，經(jīng)擴增得到含有2,5-DKG還原酶Ⅰ基因的片段，定向連接到克隆載體PGEM3Zf(+)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選得到陽性克隆PGEM813。序列分析結(jié)果表明，片段全長1107bp，含有一個834bp的開放閱讀框架，編碼產(chǎn)生由278個氨基酸組成的分子量為34kD的蛋白，證實為2,5-DKG還原酶Ⅰ基因。將且的基因的調(diào)控序列進行缺失突變后，克隆到原核表達載體pBL上獲得表達質(zhì)粒pBL4，通過溫度誘導，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析有明顯的表達條帶，約占菌體總體蛋白的20％，并且表達的蛋白具有較高的酶活力。將能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達棒狀桿菌2,5-DKG還原酶Ⅰ基因的質(zhì)粒pBL4改造成為具有鏈霉素抗性的質(zhì)粒pBLS，采用改進的感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將pBLS導入能夠利用葡萄糖高產(chǎn)2,5-DKG的歐文氏菌SCB125中，通過提高溫度誘導，經(jīng)SDS-PAGE分析2,5-DKG還原酶獲得了高效表達，不形成包涵體。同時體外酶活測定結(jié)果表明表達的酶具有很高的活力。因此有很大的應用前景。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步描述。


圖1是2,5 DKG還原酶Ⅰ基因序列及編碼蛋白序列圖，圖中有下劃線的區(qū)域為突變區(qū)。
圖2是表達在大腸桿菌DH5α中的SDS-PAGE圖譜，M為分子量Marker,lane1為含表達質(zhì)粒的大腸桿菌，lane2為含表達酸性磷酸酯酶(pho4)質(zhì)粒的對照大腸桿菌。
圖3是重組表達載體PBLS結(jié)構(gòu)示意圖，圖中EcoRⅠ,XhoⅠ,BamHⅠ,HindⅢ為酶切位點，str為鏈霉素抗性基因，amp為氨芐青霉素素抗性基因，ori為復制起始區(qū)，Pl為啟動子，CIts856m為Pl啟動子的抑制蛋白基因，2,5DKGRI為2,5-DKG還原酶Ⅰ基因。
圖4是表達在歐文氏菌SCB125中的SDS-PAGE圖譜。Marker同圖2,lane1為含表達質(zhì)粒的歐文氏菌，lane2為不含表達質(zhì)粒的對照歐文氏菌。
1．染色體DNA提取方法是由哺乳動物細胞染色體DNA提取方法改進而來。對提取到的棒狀桿菌DNA電泳檢測，所抽提到的DNA分子大小為23kb左右。2．引物合成與PCR擴增根據(jù)文獻報道的2,5-DKG還原酶基因全序列，用PC/GENE軟件中PCR引物設(shè)計程序，設(shè)計了PCR反應的引物，合成時在5’端加上酶切位點和保護堿基可以方便地進行克隆5’端引物5’TCTGAATTCGCGCCTACCCTGGAAGACATGACAG 3’EcoRⅠ3’端引物5’TCTAAGCTTATCCTCGAAGCTCTCCCGTGCCATC 3’HindⅢ5’端突變引物5’CGCCTACCCTGGAATTCATGACAG 3’EcoRⅠ以棒狀桿菌SCB3058全基因組DNA為模板，按所設(shè)計的優(yōu)化反應條件進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查為單一條帶，長約1.1Kb，大小與預期值完全一致；為了鑒定PCR反應的產(chǎn)物是否正確，從產(chǎn)物的酶切結(jié)果方面進行了初步判別，BamHⅠ、XhoⅠ等內(nèi)切酶消化位點與理論值符合。擴增產(chǎn)物用Wizard PCR回收試劑盒純化。3.PCR擴增產(chǎn)物的克隆與鑒定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，定向克隆到pGEM3Zf(+)中。通過藍白斑變化和小規(guī)模抽質(zhì)粒鑒定篩選陽性菌落。增大的重組克隆用EcoRⅠ、HindⅢ和基因內(nèi)部酶切位點進行酶切初步鑒定。所得質(zhì)粒PGEM813通過酶切圖譜鑒定后，采用Sanger雙脫氧末端終止法進行核酸序列分析，直接以重組質(zhì)粒PGEM813雙鏈DNA為模板，采用M13正向通用引物和中間合成的引物測出兩端的序列，中間部分采用SalⅠ-PstⅠ亞克隆后測序(參見圖1)，將全序列與發(fā)表的2,5-DKG還原酶基因順序進行比較在基因編碼區(qū)434位是G而不是A,734位是C而不是T，從而導致了兩個氨基酸差異，145位His變成Arg,245位Val變成Ala。4．表達載體構(gòu)建將2,5-DKG還原酶Ⅰ基因直接從EcoRⅠ和HindⅢ位點克隆到原核表達載體pBL中，利用棒狀桿菌的翻譯信號進行翻譯，構(gòu)建成大腸桿菌表達載體pBL1028，經(jīng)過SDS-PAGE分析未能實現(xiàn)高效表達。推測為pBL上的SD序列與起始密碼子ATG之間距離太長(26bp)，大大影響了翻譯效率。因而合成了新的5’端突變引物，在ATG前面突變兩個堿基，構(gòu)建出一個新的EcoRⅠ酶切位點，序列分析證實了產(chǎn)生的新片段缺失掉了棒狀桿菌2,5-DKG還原酶Ⅰ基因原來的5’端調(diào)控序列，全部用表達載體pBL上的Pl啟動子、SD序列等調(diào)控基因表達，SD序列與ATG起始密碼子之間間距變?yōu)?bp，接近文獻報道的最佳距離。構(gòu)建出大腸桿菌高效表達載體pBL4。
含有重組表達載體pBL4的大腸桿菌DH5α經(jīng)過42℃熱誘導，產(chǎn)生了對照所沒有的明顯表達產(chǎn)物，在SDS-PAGE凝膠上可見明顯的表達產(chǎn)物條帶(參見圖2)，測得分子量約為34kD，與理論值完全一致，灰度掃描結(jié)果表明，表達的重組蛋白約占菌體總蛋白的20％。
按酶活力測定方法測定表達在大腸桿菌中的2,5-DKG還原酶Ⅰ活力，結(jié)果表明表達的2,5-DKG還原酶Ⅰ具有很高的生物學活性，達到了1660U/mg，比報道的酶活力有較大的提高。4．表達載體的改造將約2Kb的鏈霉素抗性基因片段插入到pBL4上的2,5-DKG還原酶Ⅰ基因片段后面，得到質(zhì)粒pBLS(參見圖3)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化歐文氏菌SCB125用改進的CaCl2法進行?；蚬こ叹M行2,5-DKG還原酶Ⅰ表達分析主要通過SDS-PAGE分析和2,5-DKG還原酶Ⅰ比活測定，結(jié)果轉(zhuǎn)基因歐文氏菌有明顯表達條帶(見附圖4)，比活力3572U/mg，是對照菌的10倍。
以下為本發(fā)明實施例實施例1以棒狀桿菌基因組DNA為模板，在50ul PCR反應混合液含10×Buffer(Mg2+free)5ul,5mol/l dNTP 2ul,20pmol/ul引物各2ul，模板1ul,Taq DNA Polymerase 0.5ul，根據(jù)需要加入25mmol/lMgCl2，甘油等若干，用無菌水調(diào)整至50ul。循環(huán)參數(shù)95℃變性1min；50℃復性1min；72℃延伸3min；35個循環(huán)，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢查為單一條帶，長約1.1Kb。
實施例2挑取含pBL4的DH5α菌種接種于AmpLB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，次日接種新鮮AmpLB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3-4h(A600約0.4)，升溫至42℃誘導繼續(xù)培養(yǎng)。離心收集菌體，懸浮于無菌水，加等體積上樣緩沖液，煮沸，離心后取上清進行SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍染色，灰度掃描測定表達產(chǎn)物含量。在SDS-PAGE凝膠上可見明顯的表達產(chǎn)物條帶，測得分子量約為34kD，灰度掃描結(jié)果表明，表達的重組蛋白約占菌體總蛋白的20％。
離心收集表達的菌體，用Buf A 0.1M Tris-Cl(pH7.0)洗滌，重懸浮于一定體積的Buf A中，用超聲波破碎菌體，離心取上清作為測定用的酶液。在30℃，100ul酶液加到2.7ml Buf A中，再加100ul濃度為3-5mM的NADPH溶液及100ul過量底物2,5-DKG，測定A340的變化，根據(jù)標準曲線換算成NADPH濃度變化，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化1umol NADPH所需的酶量。蛋白濃度采用考馬斯亮藍染色法以牛血清白蛋白為標準測定，計算酶的比活力。通過不同的溫度誘導，結(jié)果雖然42℃誘導能夠得到高得多的表達量，但表達的酶蛋白主要存在于沉淀中，上清中酶的比活力仍保持基本相同的水平。
實施例3轉(zhuǎn)基因歐文氏菌的28℃培養(yǎng)在含50ug/ml鏈霉素LB的過夜菌以2％接種新鮮含50ug/ml鏈霉素LB，在28℃培養(yǎng)2-6h后，轉(zhuǎn)移到42℃誘導培養(yǎng)若干小時，轉(zhuǎn)速均200rpm。收獲菌體以150D600重懸浮于1mlBufA,-70℃凍融超聲波破菌壁。離心取上清電泳及測酶活，表達分析方法同例2。結(jié)果轉(zhuǎn)基因歐文氏菌SCB125有明顯表達條帶，比活力3572U/mg，是對照歐文氏菌(365U/mg)的10倍，從28℃培養(yǎng)2小時后誘導酶的比活力最高。依次是4小時和6小時開始的誘導。從2小時后誘導酶的比活力可維持12小時不降低。
本發(fā)明所涉及的生物合成2,5DKG還原酶的技術(shù)，克隆到的棒狀桿菌2,5DKG還原酶Ⅰ基因與以往報道的有差別，在構(gòu)建的表達載體導入大腸桿菌DH5α和歐文氏菌SCB125，表達水平都很高，達到或超過目前文獻報道的水平，重組表達的2,5DKG還原酶具有很高的催化活性，適用于改進葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)生維生素C前體2-酮基-L-古龍酸的工藝，具有很大的應用價值。
權(quán)利要求
1．一種突變的2,5二酮基-D-葡萄糖酸還原酶(2,5DKG還原酶Ⅰ)及其基因工程表達系統(tǒng)，其特征是A．在2,5DKG還原酶Ⅰ基因編碼區(qū)中，434位由A突變?yōu)镚,734位由T突變?yōu)镃，從而使相應的2,5 DKG還原酶Ⅰ的145位由His突變?yōu)锳rg,245位由Val突變?yōu)锳la。B．2,5 DKG還原酶Ⅰ基因是采用聚合酶鏈反應技術(shù)(PCR)從棒狀桿菌SCB3058基因組擴增獲得，進而構(gòu)建重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，構(gòu)建成基因工程表達系統(tǒng)。
2．如權(quán)利要求1所述的2,5 DKG還原酶Ⅰ基因工程表達系統(tǒng)，其特征是將2,5DKG還原酶Ⅰ基因的調(diào)控序列進行缺失突變后，置在PL啟動子后面，構(gòu)建成重組表達載體PBL4，其中SD序列與ATG起始密碼子之間間距為8bp。
3．如權(quán)利要求1和2所述的表達系統(tǒng)，其特征是宿主菌為大腸桿菌，重組表達載體是PBL4。
4．如權(quán)利要求1和2所述的表達系統(tǒng)，其特征是宿主菌為歐文氏菌，重組表達載體是PBL4基礎(chǔ)上改造而得的PBLS。
5．如權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征將約2Kb的鏈霉素抗性基因片段插入到pBL4的2,5-DKG還原酶Ⅰ基因片段后面，得到質(zhì)粒pBLS。
6．如權(quán)利要求1所述的表達系統(tǒng)，其特征是設(shè)計合成了PCR反應的5’端突變引物，序列為5’CGCCTACCCTGGAATTCATGACAG 3’。
全文摘要
本發(fā)明為一種生物合成2,5二酮基－D－葡萄糖酸(2,5DKG)還原酶的技術(shù),通過聚合酶鏈反應技術(shù)擴增,克隆到有突變的棒狀桿菌2,5DKG還原酶I基因,構(gòu)建適當?shù)谋磉_載體在大腸桿菌和歐文氏菌高效表達來實現(xiàn)發(fā)明目的。由2,5DKG還原酶I突變基因所表達的2,5DKG還原酶具有很高的催化活性,適用于改進葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)生維生素C前體2－酮基－L－古龍酸(2－KLG)的工藝。
文檔編號C12N9/02GK1221792SQ97125210
公開日1999年7月7日 申請日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者尹光琳, 陳策實 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心