專利名稱：用于防止血小板粘附的蛋白的制作方法
發(fā)明概述本發(fā)明描述了一種從藥用水蛭(-)醫(yī)用水蛭(Hirudomedicinalis)唾液中分離的天然蛋白，這種蛋白可與膠原蛋白強(qiáng)烈結(jié)合，從而可作為與膠原蛋白粘附的血小板的抑制劑。此蛋白的分子量約為12000，具有酸性等電點(diǎn)，并且含有六個(gè)半胱氨酸。對此蛋白進(jìn)行了測序，并且從醫(yī)用水蛭的cDNA文庫中克隆到了它的基因。通過重組技術(shù)制備這種蛋白的方法已經(jīng)公開。此重組體和天然蛋白是膠原蛋白依賴性血小板粘附的有效抑制劑，因此對于治療循環(huán)系統(tǒng)疾病和與頑固疾病相關(guān)的病況的治療很有效。進(jìn)一步，此蛋白可有效的包被天然或人工膠原蛋白的表面，從而防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞的活化。
在血小板粘附到暴露于鞏膜損傷(Van der Rest M.etal.；FASEBJournal，1991，5，2814-23)中的膠原質(zhì)并且進(jìn)一步開始形成阻塞的生理過程中，這一正常的的生理反應(yīng)是相當(dāng)重要的。依賴于隱藏位點(diǎn)及其程度，嚴(yán)重的并發(fā)癥如心肌梗塞、中風(fēng)、炎癥或肺部栓塞可造成嚴(yán)重的后果。
肝素是一種可直接作用的抗血栓形成的藥劑，它可阻斷凝血酶的活性從而防止富纖維蛋白血栓癥的形成，因而肝素是現(xiàn)今用于抗血栓的最著名的藥物。肝素的廣泛應(yīng)用表明有如不穩(wěn)定的咽痛和急性心肌梗塞。然而，盡管它有如此廣泛的應(yīng)用，它仍有一些缺點(diǎn)，如靜脈內(nèi)應(yīng)用、要求抗凝血酶III作為協(xié)同因子、由與凝塊相結(jié)合的凝血酶引起的親和性降低、幾種質(zhì)膜蛋白引起的失活、偶然誘導(dǎo)的血小板減少以及其生物異質(zhì)性仍然有待解決。因而肝素在臨床應(yīng)用上至今仍沒有取得壓倒性的結(jié)果。
最近低分子量肝素的發(fā)展有助于可用于皮下應(yīng)用的藥劑，然而其治療效果與標(biāo)準(zhǔn)肝素相比提高不大。不幸的是它同樣作用于那些直接作用的抗凝血酶如水蛭素、Hirulog及芐丙酮香豆素。這表明一個(gè)主要問題可能與在應(yīng)用抗血栓治療的情況下凝血酶的產(chǎn)量增加有關(guān)(Rao，A.D et al.，Circulation，1996，94，389-2395)。
因此最近針對它的策略聚焦在凝血素活化的過程上，而此活化是由Xa因子推動(dòng)的。主要的問題是設(shè)計(jì)直接作用于此因子的適當(dāng)抑制劑。因此，本發(fā)明的發(fā)明總結(jié)認(rèn)為人們并沒有意識到這種類型的發(fā)明的全部治療潛力。
另一系列的治療法是以溶解血栓的養(yǎng)生法為代表，其焦點(diǎn)集中在開發(fā)葡萄球菌激酶、鏈激酶、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑、組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑及anisoylated-血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶激活劑復(fù)合體。對每一種溶解血栓的藥劑來講，在誘導(dǎo)重灌注上有顯著不同，然而在降低整體的死亡率上效果是相同的。此外，血栓重阻塞和延長的流血是常見的并發(fā)癥。這可歸因于其對纖維蛋白相對較低的特異性以及這些化合物的短質(zhì)膜半衰期?，F(xiàn)今為了克服溶解血栓的治療中的缺陷，已經(jīng)檢測了多種養(yǎng)生法的應(yīng)用及不同血溶蛋白溶解原理的結(jié)合應(yīng)用。然而期望得到的改進(jìn)卻相當(dāng)微小。
最近出現(xiàn)了一組新病人，它們的問題為如急性血栓阻塞以及歸因于一些技術(shù)如血管成形術(shù)、動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)、動(dòng)脈嫁接或血管壁斯滕特印模等技術(shù)的晚期再狹窄?？赡艿慕槿胫委煱寡“濉⒖寡把ㄈ芙獠呗?。其它多種藥劑如鹽酸氯芐吡啶可用做ADP拮抗劑或鈣離子載體A-23187、另外阿司匹林可直接影響血小板的功能，因而已經(jīng)建議將其用于或已經(jīng)用于防止或減少血小板聚合。按照本發(fā)明，新的抗血小板粘附物質(zhì)當(dāng)用于外科手術(shù)時(shí)也可有助于克服那些臨床上的并發(fā)癥。
如果人工表面與血液相接觸，然后通過激活血小板和/或誘導(dǎo)凝結(jié)，血栓阻塞的可能性就增加了，這種情況下就產(chǎn)生了這樣一種與主題相關(guān)的另一并發(fā)癥。這些作用可導(dǎo)致血管嫁接、心臟閥、壁斯滕特印模、導(dǎo)尿管或其它與血液相接觸的裝置或物質(zhì)的失敗。此處公開的蛋白有能產(chǎn)生非形成血栓表面的能力，因此可通過將這種蛋白固定化到上述裝置上來進(jìn)一步利用這種蛋白。這樣一種處理方法可給予這些物質(zhì)或裝置生物適應(yīng)性和血栓形成抗性。
由于與可得的抗血栓形成藥劑相關(guān)的多種局限性，因而實(shí)際上有對新的替代策略和治療藥物的實(shí)際需求。
幾種可防止血小板粘附的新穎抑制劑是直接作用于vWF的單克隆抗體。這也表明糖蛋白IIb/IIIa抑制劑可有助于抑制血小板粘附。這些抑制劑中的一些如單克隆抗體c7E3已經(jīng)進(jìn)行臨床檢測，而另外的如KGD-和RGDF-抑制劑仍在研究之中。然而，大多數(shù)新抑制劑的特異性沒有好好的研究，因而應(yīng)用這些抑制劑而誘導(dǎo)的副作用譜仍然空白，有待于仔細(xì)研究。
用于篩選可干預(yù)膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板粘附的新化合物的豐富資源存在于吮血?jiǎng)游锏奶烊晃镔|(zhì)中。已經(jīng)從天然物質(zhì)中分離到幾種抑制劑，如文獻(xiàn)所述從醫(yī)用水蛭中分離的一種叫做Calin的65KD蛋白(US5,587,360，WO 92/07005)(Munro，R.，et al.，Blood Coagulationand Fibrinolysis，1991，2，179-184)和從水蛭醫(yī)用水蛭唾液腺中分離到的一種16KD蛋白(LAPP)(US 5,324,715)。這兩種蛋白都描述為聚合抑制劑，這已經(jīng)在對依賴膠原蛋白的血小板聚合的靜態(tài)化驗(yàn)中檢測到了。
盡管已經(jīng)證明體內(nèi)有活性的LAPP不能在幾種公認(rèn)的體外模型中發(fā)揮作用(Schaffer L.W.et al.；Arterioscler.Thromb.，1993，13，1593-1601)and Connolly T.M.et al.；Thromb.Haemostas.，1993，69，589。但軟蜱(soft tick)，Ornithodoros moubata也含有一種抗血小板蛋白(Moubatin)，這種蛋白在防止膠原蛋白刺激的血小板聚合方面有活性(Waxman，L.et al.；J.Biol.Chem.，1993，268，5445-49)。另一種從吮血臭蟲中分離到的抗血小板聚合的蛋白在Noeske-Jungblut C.等、Smith等的專利WO 9309137中有公開。已經(jīng)從蛇毒液中分離到一種50 kDa蛋白，另外從一種吮血臭蟲Triatomapallidipennis的唾液中分離到一種19 kDa的蛋白。發(fā)現(xiàn)在這些蛋白中含有一種特異的抑制膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板聚合的因子。這種命名為pallidipin的19 kDa蛋白可抑制質(zhì)膜上膠原蛋白介導(dǎo)的血小板聚合。但沒有探測到它對由其它效應(yīng)物(ADP、凝血酶、凝血噁烷A2模擬物U46619、佛波醇酯)刺激產(chǎn)生的聚合有抑制作用。Pallidipin對血小板與膠原蛋白的粘附?jīng)]有作用，但它可抑制從血小板中釋放ATP。它可與血小板反向相互作用，并且它與膠原蛋白在血小板上有共同的靶。這種蛋白的具體作用機(jī)制機(jī)及其治療效益正在研究之中。Gan等將Echistatin描述為一種可結(jié)合到纖維蛋白原受體GP IIa/IIIb上的抑制劑(J.Biol.Chen，1988，263，19827-32)。
盡管有這些令人心動(dòng)的發(fā)展，但進(jìn)一步提供抗凝血?jiǎng)┖涂鼓傅男枨笕匀淮嬖冢@些抗凝血?jiǎng)┖涂鼓钢改切┚哂性谝种颇龎K形成、vWF-誘導(dǎo)的激活或內(nèi)皮細(xì)胞激活方面有提高的效率的抗凝血?jiǎng)┖涂鼓福约澳切┛捎米鏊幬?、又可生產(chǎn)商業(yè)上可行的量的抗凝血?jiǎng)┖涂鼓浮?br> 鑒于至今描述過的已知蛋白中沒有一種能發(fā)展成為具有理想治療效果的化合物，本發(fā)明的發(fā)明者決定提出一種新篩選策略，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)蛋白。
目前為止，文獻(xiàn)中沒有肯定的示例來表明利用能從天然化合物中排除聚合抑制劑和細(xì)胞溶解酶蛋白的篩選方法來發(fā)現(xiàn)新的抗粘附機(jī)制或化合物。然而在本發(fā)明中應(yīng)用了這種策略。鑒于已知在膠原蛋白粘附中至少涉及六種不同的血小板表面糖蛋白，此外還涉及幾種已經(jīng)證明可作為膠原蛋白—血小板粘附的間接介質(zhì)的血小板衍生化合物如vWF、纖連蛋白及血小板反應(yīng)蛋白，開始時(shí)對于發(fā)現(xiàn)一種新的粘附抑制劑的可能性是不樂觀的。
然而，并不全部排除與有記載的或未知的vWF相關(guān)的抑制劑或那些可直接作用于血小板受體的化合物，在這種情況下，我們將這種方法用于對醫(yī)用水蛭唾液的篩選。篩選結(jié)果非常令人吃驚從經(jīng)過仔細(xì)研究的屬醫(yī)用水蛭種的水蛭的分泌物和組織中分離到一種對血小板具抗粘附活性的新蛋白，命名為Saratin。
本發(fā)明包括從醫(yī)用水蛭中分離到的活性多肽Saratin。這種蛋白是從其唾液中分離到的，分離步驟包括加壓透析、至少經(jīng)一步色譜如陰離子交換層析，以及至少一步反向高效液相色譜(RP-HPLC)。在從唾液中分離Saratin時(shí)，加壓透析絕對重要，因?yàn)橥僖旱膹?qiáng)濃縮有助于克服具生物活性的Saratin的大量損失。這種分離的Saratin與多種膠原蛋白有強(qiáng)結(jié)合，從而以一種劑量依賴的方式阻止了這些表面包被的膠原蛋白與血小板的粘附。
為了優(yōu)化篩選級聯(lián)，目前已有的技術(shù)已發(fā)展來區(qū)分血小板粘附與血小板聚合血小板減緩或停止血液流經(jīng)纖維、血小板對體內(nèi)凝塊形成的貢獻(xiàn)、玻璃珠粘附實(shí)驗(yàn)、或在可調(diào)壓力梯度下全血流經(jīng)濾膜或抗富含血小板的質(zhì)膜對含有玻璃纖維或膠原蛋白的濾膜的粘附。
此蛋白(命名為Saratin)特征于其序列(SEQ.ID.NO.2)中的氨基酸序列，此序列由103個(gè)氨基酸組成，其理論上的相對分子量為12068道爾頓±1KD。此蛋白含有與其它前述序列沒有顯著相似的、特有的一級結(jié)構(gòu)。此蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，這使得其通過IEF-PAGE測得的等電點(diǎn)較低，為pH3.7±0.5.
SDS-PAGE分析表明在電泳之前還原蛋白質(zhì)，遷移率有一強(qiáng)推移，這暗示翻譯后修飾。多肽測序已經(jīng)證明有六個(gè)半胱氨酸分子存在，正是它們造成了蛋白的翻譯后修飾。Saratin的電噴射質(zhì)譜顯示起實(shí)際分子量為12061，這表明至多有三個(gè)二硫鍵參與蛋白天然形式的次級結(jié)構(gòu)的形成。
按照本發(fā)明的粘附抑制劑是新的，這是因?yàn)樗c已知的從水蛭、尤其是從Calin中分離的聚合抑制劑或LAPP在分子量、等電點(diǎn)及氨基酸序列和生物活性上都不同。
本發(fā)明也提供了分離的DNA序列，這種DNA序列編碼源于水蛭的血小板粘附抑制劑，而這些抑制劑含有序列表中所示的蛋白的氨基酸序列。表示cDNA克隆的核苷序列在SEO.ID.NO.1中有示，1-63位核苷序列代表公認(rèn)的前導(dǎo)序列，64-372位核苷序列含有可編碼103氨基酸殘基的多肽和SEQ.ID.NO.2中的成熟蛋白的氨基酸序列的開放閱讀框架。
本發(fā)明還涉及到重組載體，這些載體包括編碼本發(fā)明中的、源于水蛭的血小板粘附抑制劑的合成基因、以及含有重組載體的宿主細(xì)胞。獲得和分離已表達(dá)的蛋白的方法是基于標(biāo)記技術(shù)或由應(yīng)用于天然Saratin的純化方法改編而來。依賴在經(jīng)合適載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、幼齡倉鼠腎細(xì)胞及大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的單個(gè)方案，利用專業(yè)人士熟知的技術(shù)對從上清液或沉淀中獲得重組蛋白的步驟作了變動(dòng)。在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)非常好，此處插入的一種pelB前導(dǎo)序列有助于其周質(zhì)表達(dá)。在滲透作用和離心后，從大腸桿菌(E.coli)中回收產(chǎn)品(大約5mg/l)。在平行實(shí)驗(yàn)中采用的是含有其它酵母所攜帶的載體的釀酒酵母(S.cerevisiae)(＞10mg/l培養(yǎng)液)。對分泌物進(jìn)行離心分離。通過交叉流過濾和離子交換層析進(jìn)行純化。在另一種表達(dá)方法中，利用COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞，產(chǎn)物表達(dá)大約為750ng/ml。通過電泳和色譜分析的方法對純化的重組物質(zhì)的純度和均一性進(jìn)行證明，事實(shí)證明在氨基酸測序和分子量確定下證明其與源于唾液的Saratin完全相同。
本發(fā)明還包含從水蛭唾液粗提物中純化活性蛋白以及通過靜態(tài)或動(dòng)態(tài)檢測測定其抗血小板的活力的方法，以及這些方法在分離重組蛋白中的應(yīng)用。
生產(chǎn)Saratin的技術(shù)，包括示例6、7、8和13，但應(yīng)用的表達(dá)方法并不局限于這些示例。例如轉(zhuǎn)基因鼠或其它生物體，包括其它哺乳動(dòng)物，也可用于表達(dá)Saratin。
本發(fā)明中的蛋白包括保持著公開序列的變體，它包括保持有活性的片段或亞基、天然變體、等位基因變體、隨機(jī)產(chǎn)生的人工突變體及有目的的序列變更如添加。片段或亞基指含有比完整蛋白少的氨基酸的部分序列，例如排除完整蛋白的N-和/或C-末端的部分序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括雜種蛋白，例如融合蛋白或在表達(dá)載體中的多基因表達(dá)產(chǎn)物，以及可通過肽鍵與另一種多肽交聯(lián)、又具有已公開的蛋白的特異活性的多肽。值得注意的是本發(fā)明的蛋白的其它變體，它們包括，尤其是那些與僅僅通過保守氨基酸替代而得到的分離蛋白不同的變體。這樣的保守氨基酸替代在Taylor等的J.Mol.Biol.，1986，188，233中有定義。
本發(fā)明還包括利用蛋白來抑制膠原蛋白—血小板相互作用，進(jìn)而防止或延遲血小板活化。本發(fā)明中的蛋白在防止、預(yù)防、治療和處理血栓疾病方面是有效用的。與前述的其它作用于多種血小板表面蛋白的蛋白不同，本發(fā)明的蛋白具有獨(dú)特的作用機(jī)制。它緊緊結(jié)合到膠原蛋白的表面，此作用機(jī)制就是通過覆蓋特異膠原蛋白的側(cè)面，使其不能與血小板相互作用和結(jié)合。這類新機(jī)制具有很大的優(yōu)點(diǎn)在使用這種蛋白的過程中，血小板保持功能性上的完整，因而這種處理方法可能有非常低的流血，甚至沒有流血。
另一重要的應(yīng)用方面就是利用本發(fā)明中的蛋白來處理多種表面，從而使得它們與血小板不具粘合性，因而就可創(chuàng)造一種生物適應(yīng)性的裝置。
如上文所表明的，本發(fā)明中的多肽適合于用做多種藥物化合物中用作藥物的有效成分及適于這些藥物化合物的結(jié)合使用。
按照本發(fā)明，藥物制劑可含有額外的活性成分如阿司匹林、抗凝血?jiǎng)┤缢嗡鼗蚋嗡?，或溶解血栓的藥劑如血纖維蛋白溶酶原激活劑或鏈激酶。
按照本發(fā)明，新穎的多肽可與非毒性的、有機(jī)的或無機(jī)酸形成藥物上可接受的鹽。無機(jī)酸有，如鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸，以及酸性金屬鹽例如正磷酸氫氧化鈉，亞硫酸氫鉀。有機(jī)酸的例子有單、二或三羧酸如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、谷氨酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、安息香酸、羥基安息香酸、苯基乳酸、苯乙烯酸、水楊酸和磺酸如甲基磺酸。羧基末端氨基酸鹽包括與合適的無機(jī)或有機(jī)堿基形成的非毒性鹽。這些鹽包括，如與堿金屬如鈉和鉀，堿土元素如鈣和鎂，IIIA族輕金屬包括鋁、以及有機(jī)伯、仲和叔有機(jī)胺如三烷基胺包括三乙基胺、普魯卡因、二芐胺、1-乙烯胺(ethenamine)、N，N’-二芐基亞乙基-二胺、dihydroabietylamine及N-烷基哌啶。
此處所用的名詞“藥物學(xué)上可接受的載體”指一種惰性的、非毒性的固體或液體填充物、稀釋液或膠囊包被物，它們不逆向與活性化合物或病人發(fā)生作用。在本領(lǐng)域中熟知的、合適的、優(yōu)選的液體載體有如無菌水、堿金屬鹽、水性葡萄糖、糖溶液、乙醇、乙二醇及油類，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成的油類如花生油、大豆油和礦物油。
按照本發(fā)明，其制劑可以含有傳統(tǒng)的非毒性藥物學(xué)可接受載體、稀釋液、助劑或典型的用于腸胃外給藥的載體的單位劑量來給藥。
名詞“腸胃外”包括此處的皮下、靜脈、關(guān)節(jié)內(nèi)和氣管內(nèi)注射，以及灌輸技術(shù)。另外其它的給藥如口服給藥和局部給藥也是合適的。腸胃外給藥的組合物和結(jié)合物最優(yōu)選的給藥方式是靜脈給藥，可將藥物制成大丸藥形式，或按照已知方法進(jìn)行持續(xù)融合。
口服用藥片和膠囊含有傳統(tǒng)的賦形劑如結(jié)合因子、填充物、稀釋液、成片因子、潤滑劑、分散劑、以及潤濕因子。片劑可按照本領(lǐng)域中熟知的的方法進(jìn)行包被。
口服液體制劑可以水性或油性懸浮液、溶液、乳狀液、糖漿或酏劑的形式存在，或可以干制品形式存在，只需在使用前添加水或其它合適載體。這些液體制劑可含有傳統(tǒng)的添加劑如懸浮因子、乳化因子、非水性載體和防腐劑。
局部給藥時(shí)可以水性或油狀懸浮液、溶液、乳狀液、果子凍，優(yōu)選乳狀油膏的形式。
按照本發(fā)明，本發(fā)明中的單位劑量可含有本發(fā)明中蛋白的日常所需量，或構(gòu)成所需劑量的蛋白的Submultiple量。對一個(gè)給定病人(哺乳動(dòng)物，包括人)來講，最佳的治療上可接受的劑量和服藥頻率依賴于多種因素，如服用的特定活性物質(zhì)的活性、年齡、體重、身體狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥方式、去除率、處理的目的，也即治療和預(yù)防、以及待處理的血栓疾病的性質(zhì)、抗血小板或抗凝血?jiǎng)┗钚浴?br> 因此，在對于治療的病人(體內(nèi))有效的抗血栓組合物和結(jié)合物中，本發(fā)明中的肽段在藥物學(xué)上的日常有效劑量是0.01-100mg/kg體重，優(yōu)選0.1-10mglkg體重。按照本發(fā)明，每一分離劑量的給藥可含有0.5-10mg凝血酶抑制劑。為了在體外血液中收到抗凝血?jiǎng)┑男Ч?，本發(fā)明的肽段的藥物學(xué)有效劑量為0.2-150mg/l體外血液，優(yōu)選劑量為1-20mg/l體外血液。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供可植入的或可體外治療的裝置來與體液接觸，從而給予此裝置表面基本的血栓抗性，在其表面包被一層上文所講的和權(quán)利要求中提及的固定的多肽。按照本發(fā)明，此多肽是固定在醫(yī)療裝置上的，這樣就可給予裝置表面生物適應(yīng)性和血栓抗性。這樣的裝置有時(shí)含有典型誘導(dǎo)血小板聚合的表面性質(zhì)，這是與血液或其它體液接觸的可植入或體外裝置在其有目的應(yīng)用中的一個(gè)缺陷。這些裝置的示例一般是用塑料物質(zhì)和合成纖維制作的，它們可用做protheses、人造器官、眼鏡鏡片、縫合用線、人造脈管片段、導(dǎo)尿管、透析器、裝血液用的試管和容器。
盡管現(xiàn)代的外科技術(shù)和鏡片應(yīng)用在治療程序中，后被膜渾濁化(PCO)是cateract extraxtion后的常見并發(fā)癥。PCO是由晶狀體上皮細(xì)胞增殖或遷移過后被膜而造成視覺敏銳度降低造成的。已經(jīng)有人提出物理學(xué)處理的和化學(xué)修飾的晶狀體可減少PCO的形成。已經(jīng)用肝素晶狀體包被或局部肝素眼藥水來減少PCO的形成，這表明抗血栓機(jī)制也與PCO的形成有關(guān)。
已經(jīng)證明Saratin較肝素在防止和阻止血栓形成方面有顯著的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明的另一特征就是提供了含有Saratin的一種包被，這種包被可降低晶狀體物質(zhì)的血栓形成，而這些晶狀體物質(zhì)可用于折射那些通過外科手術(shù)植入眼睛的前腔或后腔植入物。這一新型包被避免了由細(xì)胞生長刺激產(chǎn)生的問題。與其它，例如可使細(xì)胞死亡藥劑結(jié)合使用，Saratin可有助于完全征服后被膜渾濁化。圖表簡述圖表的細(xì)節(jié)在示例1-10中有闡釋。


圖1唾液組分的分離。Seratin的洗脫以*表示，a)顯示了唾液經(jīng)DEAE陰離子交換之后的分離情況。Saratin片段從峰3來收集(例2)。
b)顯示了經(jīng)過收集的級分在Mono Q HR5/5上的反向?qū)游?。樣品從主要峰的后部收集，如條形圖所示(例2)。
c)顯示了在Saratin陽性片段的半制備分析RP-HPLC上的最后色譜步驟，此片段從Mono Q HR5/5上收集(例2)?；钚許aratin從主峰(第3峰)收集。
圖2
從RP-HPLC收集的SDS-PAGE級分。Saratin陽性片段用※標(biāo)記(例2和3)。
圖3Saratin的大腸桿菌表達(dá)載體(例7)圖4Saratin的Baculo供體質(zhì)粒(例8)圖5將全血暴露于人造膠原蛋白表面，通過染色就可用觀察到血小板粘附。Saratin用做抑制劑(蛋白#607)例9圖6shere條件下，在膠原蛋白類型III包被的蓋玻片上的血小板粘附的抑制。唾液與Saratin的對比。例9圖7shere條件下，Saratin表現(xiàn)出對血小板與膠原蛋白類型III包被的蓋玻片的結(jié)合粘附的抑制。例9圖8Saratin的酵母表達(dá)載體(例13)發(fā)明詳述例1篩選粘附抑制劑血小板與膠原蛋白的粘附是篩選唾液組分的功能性背景。此外，目前已有四種可用于評估各種抗血栓藥物功能的檢測方法，如AZOCOLL檢測、酰胺酶活性檢測、vWillebrand依賴性結(jié)合檢測及血小板聚合檢測，這些方法已經(jīng)用于排除那些與粘附抑制劑沒有理想的聯(lián)系的功能特性。雖然此處所用的絕大多數(shù)檢測法是標(biāo)準(zhǔn)檢測法，但仍不得不對血小板粘附檢測進(jìn)行改變來適應(yīng)我們的特定需求。簡而言之利用濃度為20ug/ml的酸化膠原蛋白將Horm膠原蛋白(Nycomed)包被到96孔的平皿上，培育過夜。用PBS沖洗平皿三次，平皿的表面剩余物用1％BSA來阻斷。將通過層析柱步驟得到的片段與從新鮮citronylated血液中分離到的血小板同時(shí)加入其中。在TBS中，在二價(jià)鎂氧離子存在下，在使用前培育血小板從而使其進(jìn)行必需的預(yù)活化。配制總蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為200ug/ml粗唾液，將其作為基準(zhǔn)物來對抑制活力進(jìn)行對比。血小板檢測結(jié)果證明其極易受緩沖液變化和鹽濃度增加的影響。由于所有的樣品都是經(jīng)離子交換層析來處理，在抑制檢測中對這些片段的直接檢測結(jié)果較復(fù)雜和不可信。因此，待檢測的所有樣品通過基于Centricon的濃縮步驟，這樣檢測前可同時(shí)降低離子強(qiáng)度及增加其濃度。
例2天然抑制劑的純化本發(fā)明應(yīng)用從醫(yī)用水蛭收集的唾液，已知其中含有大量生物活性蛋白如水蛭素、彈性蛋白酶抑制劑、膠原酶，以及血小板聚合抑制劑如calin(Munro，R.et al..；Blood Coagulation and Fibrinolysis，1991，2，179-184)和LAPP(Schaffer，L.W.et al.；Arterioscler.Thromb.，1993，13，1593-1601)。除了這種特征蛋白之外，通過SDS-PAGE檢測到的大約有8種蛋白的主要蛋白仍然是未知的。在本發(fā)明中，應(yīng)用了例1中所述的片段化唾液及篩選策略，以此來篩選可直接干預(yù)血小板-膠原蛋白相互作用的新穎蛋白。
從粗唾液中分離一種粘附抑制劑是一項(xiàng)關(guān)鍵的任務(wù)，主要是因?yàn)樵诘谝徊缴V步驟中絕大多數(shù)粘附抑制活力有不可恢復(fù)的損失。Munro，R.等建議使用的添加劑如12％乙醇和二價(jià)陽離子也不能改善這種情況。然而唾液中的高鹽濃度及低總蛋白濃度(190-250ug/ml)使得進(jìn)行起始濃縮或緩沖液交換成為必須的。因此，試驗(yàn)了幾種富集、濃縮或緩沖液交換方法。傳統(tǒng)的透析方法使活力全部損失。絕大多數(shù)其它的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如離子交換、親和柱層析、分子排阻(填充樹脂造成的損失可不計(jì))都不成功，而這些方法不受分離技術(shù)性質(zhì)、所用的緩沖液和添加劑的限制。但令人吃驚的是對500ml唾液進(jìn)行增壓透析證明是一種成功的唾液蛋白濃縮方法(約30-40倍)，并且同時(shí)去除了不需要的緩沖成分。意想不到的是通過這種方法處理的唾液粗物質(zhì)是進(jìn)一步純化的理想出發(fā)物質(zhì)，從唾液中回收有生物活性的抗粘附組分不再成為一個(gè)問題。由于陽離子交換劑或親和層析在純化過程中是一不充分的步驟，因而使用了快速DEAE或EMD-DEAE Fractogel作為填料。對12％乙醇和二價(jià)陽離子進(jìn)行了檢測，然而結(jié)果與添加劑相似或沒有添加劑時(shí)相同。進(jìn)一步優(yōu)化色譜步驟，最終的步驟為DEAE柱、Mono Q-柱，最后一步是反向RP18柱。利用Pharmacia.的分析柱在BiaCore色譜體系中優(yōu)化色譜條件。在DEAE-柱、Mono Q-柱及RP18柱上操作時(shí)的濃度梯度在
圖1a，b，c中給出。通過FPLC技術(shù)增大了基于BiaCore的分離規(guī)模。除過RP18柱外，其余各柱按照廠家的使用說明使已優(yōu)化的過柱條件直接轉(zhuǎn)化為半制備規(guī)模的過柱條件，而RP18柱仍舊使用BiaCore技術(shù)以減少純化物質(zhì)的損失。利用快速真空離心方法從最后一步RP-色譜回收純化的蛋白。從最后一步RP步收集的樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行回收和分析(圖2)。隨后樣品重新懸浮到PBS中，用來進(jìn)行分析和功能檢測。一般來講從未處理的唾液中可回收到大約750ug/l的Saratin。
例3生物化學(xué)特性按照例1中公開的純化方法可制得基本上純的Saratin蛋白，經(jīng)還原性條件下的SDS-PAGE測得其表觀分子量大約為21KD(圖2)。通過對純化蛋白的前48個(gè)氨基酸直接測序得到其氨基酸序列，并且通過對經(jīng)酶法降解產(chǎn)生的幾個(gè)內(nèi)部肽段進(jìn)行測序得到其完全氨基酸序列。完整的蛋白序列在SEQ.ID.NO.2中已公開。
這種蛋白含有103個(gè)氨基酸，其計(jì)算分子量為12067，9，而從ESI-質(zhì)譜推算的分子量為12061，9。在理論分子量和實(shí)測分子量間的差異表明Saratin中的六個(gè)半胱氨酸全部參與形成二硫橋。這一發(fā)現(xiàn)對在還原性條件下和非還原性條件下利用色譜法分離SDS-PAGE的產(chǎn)物時(shí)的蛋白質(zhì)遷移率變化是一支持。此外，此蛋白富含酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。通過IEF-PAGE(固定)進(jìn)行的等電聚焦技術(shù)證明其等電點(diǎn)為pH 3.7±0.5。在對比研究中，我們利用純化的水蛭蛋白作為參考物，將它與從baculo、酵母及大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物中得到的重組Saratin的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行對比。通過對SDS-PAGE進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(圖2)或銀染色觀察，或通過Western印記分析顯示所有的這三種蛋白在性質(zhì)上完全相同，它們都是均一的，以非糖基化形式存在。
例4mRNA制備和cDNA合成RNA是從醫(yī)用水蛭中制備的；使用的是胍基硫氰酸鹽法。利用“Oligotex mRNA試劑盒”(QIAGEN)從總RNA中純化mRNA。利用“Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒”(CLONTECH)來合成cDNA。按照廠家的使用說明，利用PCR寡核苷引物起始擴(kuò)增編碼Saratin DNA序列。合成完cDNA后，將一種通用連接物連接到cDNA的兩端。這種通用連接物和通用引物AP1或AP2是按照該試劑盒供應(yīng)商提供的使用說明進(jìn)行選擇的。
例5通過PCR擴(kuò)增和分離Saratin簡并引物是基于反向翻譯的Saratin的直接N-末端氨基酸序列合成的。
引物01和引物02是設(shè)計(jì)來與Saratin cDNA的5′-端特異雜交的。引物設(shè)計(jì)是基于通過實(shí)驗(yàn)確定的、已純化的Saratin蛋白的八個(gè)N-末端氨基酸的反向翻譯序列之上的。合成的引物01和引物02保持盡可能低的簡并性，并且在關(guān)鍵的3′-端有與Saratin cDNA完美結(jié)合的八個(gè)延長的堿基對，以此來保證模板DNA的特異的和高效的擴(kuò)增。按照DNA簡并字母(IUPAC密碼)，R＝A或G；M＝A或C；Y＝C或T；及N＝A或G或C或T。
利用引物01和引物02及一種通用引物AP1或AP2的混合物進(jìn)行了3’-RACE PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物克隆到TA克隆載體r pCR2.1或pCRScript SK(+)載體中，并對其進(jìn)行測序。對獲得的幾種3’-RACE PCR片段。進(jìn)行測序后，就得到了除5′-未翻譯區(qū)、信號肽序列和編碼成熟蛋白N-末端幾個(gè)氨基酸的序列外的Saratin基因序列。為了獲得丟失的Saratin cDNA序列信息，就利用從Saratin cDNA中部得到的特異引物和一種通用引物AP1或AP2進(jìn)行了5’-RACE PCR實(shí)驗(yàn)。在對幾種5’-RACE PCR片段進(jìn)行測序之后，就得到了完整的Saratin基因序列。利用從Saratin基因3’-和5’-末端得到的基因特異的、非簡并的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Saratin基因，就得到了全部長度的Saratin基因。
通過多于15種不同的PCR克隆進(jìn)行了DNA測序。然而，僅在一個(gè)克隆里發(fā)現(xiàn)引起氨基酸序列改變的一種顯著改變。極有可能這種改變是由PCR引起的。另外發(fā)現(xiàn)的5個(gè)沉默改變沒有引起氨基酸序列的改變。因此這些改變不大可能是由PCR引起的，因?yàn)樵诓煌目寺≈邪l(fā)現(xiàn)了相同的改變。
Saratin基因ORF有372個(gè)bp，并且含有一個(gè)含有21個(gè)氨基酸的信號序列，以及編碼成熟蛋白的103個(gè)氨基酸。此外發(fā)現(xiàn)從PCR擴(kuò)增得到的氨基酸序列與對從天然唾液得到的蛋白測序得到的氨基酸序列完全相同。
例6在COS細(xì)胞中的表達(dá)以及對表達(dá)蛋白的檢測為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如COS或CHO中表達(dá)Saratin基因，所以利用Xhol+Xbal將Saratin基因從載體pCR Script SK(+)中切割下來，并且將其克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCl-neo(Promega)中。選擇pCl-neo是因?yàn)樗杏糜隗w內(nèi)表達(dá)的T7和T3引物，以及含有可用于G418選擇的抗新霉素基因，并且它可用于在COS和CHO中的表達(dá)。
在信號序列和成熟蛋白序列之外含有插入序列，此插入序列在5’-末端含有有助于高效翻譯的Koz序列，而在3’-末端(C-末端)含有有助于蛋白表達(dá)、純化和濃縮的組胺酸標(biāo)記MRGS(H)6。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)命名為pNC-31。
pNC-31質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用PBS沖洗兩遍處于對數(shù)期的COS，將其溶解在PBS中，使其濃度為1×107/ml.。然后將12μg質(zhì)粒DNA(在水中或TE緩沖液中少于50μl加入到0.7-0.8ml COS細(xì)胞懸浮液中，將其混合在電穿孔玻璃小管。在1.9kv、25μFD下電穿孔10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到直徑90mm的平皿中。添加8ml含有10％FCS和抗生素的培養(yǎng)基后，培養(yǎng)3天。上清液和細(xì)胞用于進(jìn)一步的蛋白分離與檢測。利用抗MRGS(H)6抗體進(jìn)行western印記來檢測已表達(dá)的蛋白。利用鏊合劑如固定化在柱基質(zhì)上的NTA或酰亞胺乙酸來純化，以及用金屬離子如Co、Ni或Cu來修飾。
例7構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)由于可變密碼子在不同生物體系中的應(yīng)用，因而一些密碼子在大腸桿菌中很少應(yīng)用。為了在大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化的蛋白，就要按照標(biāo)準(zhǔn)方法將此基因轉(zhuǎn)化為大腸桿菌中使用的密碼子。
利用經(jīng)修飾過的質(zhì)粒pASK75在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，此質(zhì)粒攜帶tet啟動(dòng)子區(qū)(P20，L21-22)。簡而言之通過克隆一個(gè)在Xbal和HindIII位點(diǎn)間的新連接體(圖3)來進(jìn)行修飾。新的連接體含有ompA前導(dǎo)序列、另一個(gè)克隆位點(diǎn)和取代鎖鏈狀球菌標(biāo)記的6x組胺酸標(biāo)記。
要想構(gòu)建Saratin的表達(dá)載體就必須通過PCR導(dǎo)入5’ClaI和3’Eco47III限制性位點(diǎn)。因此引用了5’引物03和3’引物04。PCR產(chǎn)物首先克隆到PCRII載體體系(Invitrogen)中，并且對其進(jìn)行測序。第二步利用5’ClaI和3’Eco47III限制性位點(diǎn)將Saratin基因克隆到修飾過的pASK75載體中。然后在第二個(gè)PCR反應(yīng)中表達(dá)和證明重組Saratin的活力。去除組胺酸標(biāo)記，并且將Saratin基因起始密碼子直接融合到ompA前導(dǎo)序列中。這一步PCR反應(yīng)的5’引物05和3’引物06的序列組成在序列表中已給出。
作為在大腸桿菌中表達(dá)的一個(gè)例子，含有融合到ompA前導(dǎo)序列中的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)載體pRG72(圖3)轉(zhuǎn)化到W310感受態(tài)細(xì)胞中。當(dāng)生長到對數(shù)中期后細(xì)胞就會被激活，一小時(shí)后就可清楚的檢測到重組Saratin的存在。
例8構(gòu)建Baculo供體質(zhì)粒并進(jìn)行表達(dá)為了在Baculo病毒表達(dá)體系中表達(dá)Saratin，我們選用了GibcoLife Technologies的Bac-To-BacTM桿病毒表達(dá)體系。為了得到一種選擇體系，我們將蜜蜂蜂毒肽前導(dǎo)序列融合到Saratin基因中，并且為了導(dǎo)入限制性位點(diǎn)5’BamHl和3’Kpril，因而利用5’引物07和3’引物08進(jìn)行了一個(gè)分離的PCR反應(yīng)。將相應(yīng)的PCR產(chǎn)物克隆到PCRII載體體系(Invitrogen)中，并且對其進(jìn)行測序。利用限制性位點(diǎn)5’BamHl和3’Kpril將蜂毒肽-Saratin融合體克隆到pFastBac載體中形成pTDl3(圖4)。利用Bac-To-Bac表達(dá)體系產(chǎn)生重組桿病毒并表達(dá)Saratin。將供體質(zhì)粒pTDl 3轉(zhuǎn)化到含有具有mini-attTn7靶位點(diǎn)的桿粒及輔助質(zhì)粒的DhlOBac感受態(tài)細(xì)胞中。在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座蛋白存在下，供體質(zhì)粒上的mini-Tn7元件移換到桿粒的mini-attTn7位點(diǎn)上。通過破裂LacZ基因來鑒定含有重組桿粒的克隆。從精選的含有重組桿粒大腸桿菌克隆中制備高分子量mini-prep DNA，然后將此DNA轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中。在表達(dá)試劑盒的使用手冊中有詳細(xì)的描述。
例9血小板在流動(dòng)條件下與膠原蛋白粘附(動(dòng)態(tài)檢測)進(jìn)行血小板粘附檢測時(shí)，人全血流經(jīng)平行流動(dòng)室，以此來檢測血小板與在高剪切流動(dòng)條件下(模擬體內(nèi)動(dòng)脈環(huán)境)包被到蓋玻片膠原蛋白的粘附活性，而這種高剪切流動(dòng)環(huán)境最早是由Sakariassen等描述的(Met k.Enz.，1988，169，37-70)。將人胎盤膠原蛋白類型III(Sigma)溶解在50mmol/L乙酸中，利用潤飾油漆噴霧器將其噴到潔凈的玻璃蓋玻片(18mm×18mm)上。蓋玻片貯存在PBS中4℃過夜。
使用前，將新鮮的人全血(與低分子量肝素結(jié)合抗凝血；20U/ml)37℃預(yù)熱10分鐘。將本發(fā)明中的蛋白制劑吸到蓋玻片上(30ul每蓋玻片)，插入灌注室之前，室溫下將其在濕潤的室中培育10分鐘。然后才可將這些血灌注過此平行流動(dòng)室(37℃下，15分鐘，剪切率為1300s-1)。
隨后，將蓋玻片移出，在PBS中沖洗，然后在0.25％戊二醛中固定30分鐘，然后利用May-Grunwald Giemsa染色。圖9是一典型的例子。在未處理的對照表面能見到經(jīng)染色的血小板的粗放覆蓋。經(jīng)Saratin預(yù)處理過的對照表面上血小板的結(jié)合急劇減少(有80％)。如圖5所示(放大率m×1000)，利用與計(jì)算機(jī)圖象處理器(Leica)相連接的光學(xué)顯微鏡對血小板粘附進(jìn)行定量。結(jié)果以覆蓋有血小板的表面與覆蓋有血小板聚合物表面的百分比來表示。
將唾液的抑制活性與純化蛋白的抑制活性相對比，如圖6所示。與對照相比，在含有粗唾液(#616)的條件下，以1300s-1的剪切率在膠原蛋白類型III包被的蓋玻片上進(jìn)行的血小板粘附有大約48％抑制。標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度的純化蛋白(#607；Saratin)表現(xiàn)出大約能降低81％的血小板粘附。如圖7所示，Saratin誘導(dǎo)的抑制以一種對高濃度純化蛋白劑量依賴的方式增加。
例10免疫和抗體當(dāng)?shù)玫降谝慌呒兲烊坏鞍缀?，我們立刻進(jìn)行了動(dòng)物免疫。在兔體內(nèi)制備免疫血清，并且得到了高效價(jià)的試劑以做進(jìn)一步的篩選。但在得到完整蛋白的肽段序列和合成了三種合成多肽(氨基酸序列83-103、13-30、58-69)后就得到了額外的抗血清，并且通過標(biāo)準(zhǔn)連接體方法將其與KLH偶聯(lián)以便用于動(dòng)物免疫。已經(jīng)確定了指令N-末端肽段的三種血清和特異于C-末端肽段的兩種血清。在得到高效價(jià)的免疫血清的情況下就有可能對天然純化的蛋白和重組蛋白的純度進(jìn)行定量。因而就可以用它替代這種既耗時(shí)、工作量又大的血小板抑制檢測法，而后者就可以僅僅用于確定最終純化蛋白抑制潛力。
例11用于估測Saratin結(jié)合免疫檢測將經(jīng)過酸化處理的Horm膠原蛋白(Nycomed)用于包被96孔微量滴定平皿(Nunc)。用50ul膠原蛋白溶液(20μg/ml)包被過夜。在檢測之前用PBS沖洗三次，然后與BSA溶液(1％)共培育來防止非特異性粘附。50μl Saratin以系列稀釋的形式添加，并且培育1小時(shí)。在進(jìn)行抗Saratin抗體檢測之前將平皿沖洗3次。在額外的1小時(shí)培育步驟結(jié)束后將多余的抗體移出，然后將生物素標(biāo)記的抗體用于檢測。在與底物如ODB-片劑(Dako)進(jìn)行streptavidin-POD催化的顏色反應(yīng)之后，在490nm.下讀數(shù)。
例12篩選抑制劑的競爭性檢測將例7中所述的重組標(biāo)記Saratin(組胺酸標(biāo)記)與未經(jīng)標(biāo)記的天然Saratin在與膠原蛋白才結(jié)合上進(jìn)行對比。包被有經(jīng)過酸化處理的Horm膠原蛋白(Nycomed)已經(jīng)由例11中的方法制備得到。利用兔抗Saratin抗體進(jìn)行檢測。標(biāo)記的和未標(biāo)記的Saratin顯示出相同的結(jié)合特性。另外通過biotinylation(Pierce，biotinylation kit)對未標(biāo)記的Saratin進(jìn)行修飾，并且與未修飾的Saratin進(jìn)行比較。二者與膠原蛋白的結(jié)合特性相同。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)是將生物素化Saratin與未修飾Saratin、肽段、源自唾液的Saratin、完全唾液及直接作用于Saratin的抗體進(jìn)行交叉競爭。利用抗生蛋白鏈菌素-POD共軛物和ODB-底物反應(yīng)來檢測生物素化Saratin的結(jié)合，通過估計(jì)生物素化Saratin的結(jié)合來檢測多種競爭物與膠原蛋白的結(jié)合。含有生物素化Saratin的檢測法一般用于估計(jì)唾液中Saratin的濃度(750ug/1)、繪制直接作用于Saratin的抗原決定簇的圖譜、評價(jià)生物活性Saratin、變異Saratin。為了探究檢測方法的潛在能力，應(yīng)用了利用特異Saratin肽段產(chǎn)生的阻斷和非阻斷抗-Saratin抗體。
例13酵母表達(dá)載體及其表達(dá)Pichia多拷貝表達(dá)體系(invitrogen)是用于酵母表達(dá)的典型例子。酵母表達(dá)載體的構(gòu)建如圖8所示。為了產(chǎn)生Saratin的表達(dá)載體，可應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)來生產(chǎn)與同一適當(dāng)載體(pPIC9K)的連接相適應(yīng)的限制性末端(5’-EcoR1和3’-Not 1)。隨后是5’-引物09和3’-引物10。
在轉(zhuǎn)化Pichia球芽之前，先將表達(dá)載體與Sal.1線性化。對含His+Mut+突變體的菌落進(jìn)行篩選以保證Saratin基因的整合。典型的生長條件是28-30℃，培養(yǎng)至可見光密度是OD2-6。將離心過的細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)基中，添加乙醇至濃度為0.5％，延長時(shí)間保持這樣的條件，一般為24小時(shí)，然后對表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。在經(jīng)歷一般為6天的發(fā)酵之后，將產(chǎn)物從上清液中回收，并進(jìn)行SDS-PAGE和ELISA分析。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>用于防止血小板粘附的蛋白<130>Saratin序列<140><141><160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>375<212>DNA<213>Hirudo medicinalis<214>醫(yī)用水蛭<220><221>CDS<222>(64)..(372)<400>1atgaagtatt tcttgatttc cttcctttgc ctcgcaagct tgctgatctc aactacttct 60tca gaa gaa cgt gaa gat tgt tgg acg ttt tac gcg aac aga aaa tat108Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr1 5 10 15aca gac ttc gat aaa tct ttt aag aag tcc tct gat ctt gac gaa tgc156Thr Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys20 25 30aaa aaa aca tgt ttc aag acg gag tac tgc tac atc gtt ttt gaa gac204Lys Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr Ile Val Phe Glu Asp35 40 45acg gtc aac aag gaa tgt tac tac aat gtc gtt gat ggt gaa gag tta252Thr Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu50 55 60gac caa gaa aaa ttt gtt gtc gac gaa aac ttc acg gaa aat tat ttg300Asp Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu65 70 75aca gac tgc gag ggt aaa gat gca ggt aat gcg gca ggt aca ggt gac348Thr Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp80 85 90 95gag tca gat gaa gtt gat gaa gat taa 375Glu Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp100<210>2<211>103<212>PRT<213>Hirudo medicinalis<214>醫(yī)用水蛭<400>2Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr Thr1 5 10 15Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys Lys20 25 30Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr Ile Val Phe Glu Asp Thr35 40 45Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu Asp50 55 60Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu Thr65 70 75 80Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp Glu85 90 95Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp100<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述簡并引物01<400>3gargarmgng argaytgttg gac23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述簡并引物02<400>4gargarmgng argaytgctg gac23<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物03<400>5gcaccgatgg aagaacgtga agac 24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物04<400>6tagcgctttt gacgtcgtcg tca23<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物05<400>7gaagaatgca aggatgagga ttattg 26<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物06<400>8aagcttctag tcttcgtcaa cttcg 25<210>9<211>94<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物07<400>9cggatccatg aaattcttag tcaacgttgc ccttgttttt atggtcgtat acatttctta60catctatgcg gaagaacgtg aagattgttg gact94<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物08<400>10ggtacctcac atatcttcat caac 24<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物09<400>11gcatgcggcc gcctaatctt catcaacttc 30<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<214>醫(yī)用水蛭<220><223>人工序列描述引物10<400>12gcatgaattc gaagaacgtg aagattg2權(quán)利要求
1.從醫(yī)用水蛭中分離到的一種分子量為12000±1KD的多肽，它具有可作為膠原蛋白依賴性血小板粘附的抑制劑的生物活性。
2.權(quán)利要求1中的多肽，其等電點(diǎn)為pH3.7±0.5。
3.權(quán)利要求1或2中的多肽，它含有6個(gè)可形成二硫鍵的半胱氨酸。
4.權(quán)利要求1中的多肽，它含有SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列。
5.含有權(quán)利要求4中的氨基酸序列的多肽，它與SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列在全部長度上有80％的同一性。
6.編碼權(quán)利要求1-5中的多肽的分離多核苷酸。
7.含有SEQ.ID.NO.2 DNA序列或含有與該DNA序列互補(bǔ)的的DNA序列的分離多核苷酸，此處所指的該核苷酸可編碼權(quán)利要求1-5之一中的多肽。
8.權(quán)利要求7中的多核苷酸，此處該核苷酸含有的DNA序列與SEQ.ID.NO.1在全部長度上至少有80％的同一性。
9.含有權(quán)利要求6-8的DNA序列的表達(dá)載體。
10.含有權(quán)利要求9的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
11.含有權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞的表達(dá)體系。
12.制備權(quán)利要求1-5之任一中的多肽的方法，它包含權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，也包括在可充分制備該多肽并從培養(yǎng)上清液或細(xì)胞殘留中回收該多肽的條件下培養(yǎng)該宿主。
13.權(quán)利要求1-5之任一中的多肽的免疫特異性抗體。
14.一種藥用制劑，它含有權(quán)利要求1-5之任一中的多肽及藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
15.權(quán)利要求14的可用于血栓栓塞疾病治療的藥物活性因子。
16.權(quán)利要求14或15中的藥物制劑，它含有額外添加的藥物，此處的額外添加藥物選自阿司匹林、肝素或鏈激酶，或其組合。
17.權(quán)利要求1-5之一中的多肽在制備可用于治療血栓栓塞疾病中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求1-5之一中的多肽在包被人造表面中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求1-5之一中的多肽來修飾眼內(nèi)晶狀體，從而緩解晶狀體物質(zhì)的血栓產(chǎn)生中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求1-5之一中的多肽在與晶狀體表面接觸中的應(yīng)用。
21.權(quán)利要求1-5之一中的多肽在共價(jià)交聯(lián)以修飾該晶狀體物質(zhì)中的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求13中的抗體和權(quán)利要求1-5之一中的多肽在檢測源自權(quán)利要求12或待治療對象的樣品中的應(yīng)用。
23.通過觀察結(jié)合或?qū)δ苄苑磻?yīng)的刺激或抑制來鑒定化合物的方法，而這樣的化合物可抑制(拮抗)或激動(dòng)權(quán)利要求1-5中的多肽。
24.利用權(quán)利要求23中的方法鑒定的一種激動(dòng)劑。
25.利用權(quán)利要求23中的方法鑒定的一種拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種從醫(yī)用水蛭的唾液中分離的天然蛋白,這種蛋白可與膠原蛋白強(qiáng)烈結(jié)合,從而可作為與膠原蛋白粘附的血小板的抑制劑。此蛋白的分子量約為12000,具有酸性等電點(diǎn),并且含有六個(gè)半胱氨酸。對此蛋白進(jìn)行了測序,并且從醫(yī)用水蛭的cDNA文庫中克隆到了它的基因。通過重組技術(shù)制備這種蛋白的方法已經(jīng)公開。此重組體和天然蛋白是依賴膠原蛋白的血小板粘附的有效抑制劑,因此對于治療循環(huán)系統(tǒng)疾病和頑固疾病相關(guān)的病況的治療很有效。進(jìn)一步,此蛋白可有效的包被天然于人工膠原蛋白的表面,從而防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞的活化。
文檔編號C12N15/12GK1344318SQ00805211
公開日2002年4月10日 申請日期2000年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月18日
發(fā)明者W·斯特里特馬特, D·居索, U·霍夫曼, J·赫姆貝爾格, Z·福特夫, B·舍伊布勒 申請人:默克專利股份公司