基因全片段快速測(cè)序方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了基因全片段(>50kb)快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR條件優(yōu)選96℃～100℃變性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35個(gè)循環(huán)；(2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；(3)制備測(cè)序文庫(kù)；(4)基因測(cè)序。使用本方法可在相同PCR條件下擴(kuò)增不同長(zhǎng)度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火溫度及延伸時(shí)間即可成功擴(kuò)增出目的片段，結(jié)合MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，為長(zhǎng)鏈PCR與新一代基因測(cè)序技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用提供了一種24小時(shí)內(nèi)生成結(jié)果的快速有效的方法。
【專利說(shuō)明】基因全片段快速測(cè)序方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因測(cè)序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因全片段快速測(cè)序方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 為了獲得目的物的類型和是否具有相關(guān)突變等一系列信息，近年來(lái)各國(guó)相繼建立 起病毒變異和耐藥基因序列測(cè)定的方法?；蛐蛄袦y(cè)定分析法同其他方法相比，在技術(shù)上 和經(jīng)濟(jì)上都具有明顯優(yōu)勢(shì)?；蛐蛄袦y(cè)定分析法檢測(cè)的是易突變區(qū)域的完整序列。新一代 的個(gè)人基因組測(cè)序儀，如Illumina的MiSeq和Ion Torrent公司的PGM，已普遍應(yīng)用與科研 和臨床檢測(cè)。這些測(cè)序平臺(tái)的多用性和靈活性更適用于科研周期較快速的小型實(shí)驗(yàn)室的科 研。將測(cè)序與長(zhǎng)鏈PCR結(jié)合可以為遺傳變異檢測(cè)提供更快捷更經(jīng)濟(jì)的方法。
[0003] 自聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)出現(xiàn)以來(lái)，已成為分子生物學(xué)中克隆DNA小片段不可或缺 的方法之一。1992年，Barnes研發(fā)了新的PCR條件可以使擴(kuò)增片段達(dá)5KB,通過(guò)改變酶的 條件，長(zhǎng)鏈PCR的擴(kuò)增片段可以從 3_5KB至超過(guò)30KB。長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)的進(jìn)步使得PCR更快 速、更簡(jiǎn)潔的用于基因組圖譜和測(cè)序，并促進(jìn)分子遺傳學(xué)的研究。然而，傳統(tǒng)的PCR有擴(kuò)增 片段長(zhǎng)度的限制，且在實(shí)驗(yàn)中成功地?cái)U(kuò)增所有擴(kuò)增子，需要改變退火溫度和延伸時(shí)間，這是 因?yàn)閿U(kuò)增子不同的長(zhǎng)度及引物具有不同Tm值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供了基因全片段快速測(cè)序方法，該方法結(jié)合了長(zhǎng)鏈PCR與新 一代基因測(cè)序技術(shù)且PCR擴(kuò)增在相同PCR條件下即可擴(kuò)增目的片段。
[0005] 基因全片段快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR 條件優(yōu)選96°C?100°C變性5?l5sec，66°C?7〇°C退火延伸6?10min，25?35個(gè)循環(huán)；
[0007] (2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；
[0008] (3)制備測(cè)序文庫(kù)；
[0009] (4)基因測(cè)序。
[0010] 本發(fā)明提供的基因全片段快速測(cè)序方法的有益效果是：本發(fā)明在相同PCR條件下 擴(kuò)增不同長(zhǎng)度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火溫度及延伸時(shí)間即可成功擴(kuò)增出目 的片段，并結(jié)合MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，為長(zhǎng)鏈PCR與新一代基因測(cè)序技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用提供了 一種快速有效的方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是擴(kuò)增所得目的片段
[0012]圖2是與遺傳性乳腺癌相關(guān)的致病突變，該突變?yōu)锽RCA2中c. 5946delT
[0013] 圖3是所有樣品中存在的突變，該突變?yōu)锽RCA2中c. 4563A>G
[0014] 圖4是所有樣品中存在的突變，該突變?yōu)閏. 2972A>G
[0015] 圖5是樣品2, 7, 8存在的突變，該突變?yōu)锽RCA1中c. 19410T和c. 1936G>A

【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明提供的基因全片段快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：
[0017] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR 條件優(yōu)選96°C?l〇〇°C變性5?15sec，66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35個(gè)循環(huán)；
[0018] (2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；
[0019] (3)制備測(cè)序文庫(kù)；
[0020] (4)基因測(cè)序。
[0021] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0022] 收集八位對(duì)照組患者和實(shí)驗(yàn)組1例遺傳性乳腺癌患者的外周血，提取DNA用于長(zhǎng) 鏈PCR擴(kuò)增和下一代測(cè)序，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裨谝唤M患者中穩(wěn)定使用并成功地識(shí)別陽(yáng)性突變 位點(diǎn)。
[0023] 乳腺癌易感基因的快速測(cè)序方法步驟如下：
[0024] (1)選用TaKaRa公司的PrimeSTAR GXL DNA酶，采用在同一溫度下退火延伸的 二步法，在相同PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增BRCA1和BRCA2的全基因區(qū)域，BRCA1基因定位為 CHR17:41196312-41279500, GRCh37/hgl9, BRCA1 基因定位為 CHR13:32889617-32973809， GRCh37/hgl9。
[0025] PCR 擴(kuò)增體系：35ng DNA 模板，2·5μηιο?Λ 的引物 3.2yL，5XPrimeSTAR 緩沖液 4 μ L，1· 6 μ L dNTP，0· 4LPrimeSTAR GXL DNA酶，加蒸餾水至反應(yīng)體系總體積20 μ L。所述 引物序列見(jiàn)表1。
[0026] 表1 BRCA1和BRCA2基因引物序列
[0027] ___

【權(quán)利要求】
1. 基因全片段快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：（1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶， 在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR條件優(yōu)選96°C?100°C變性5?15sec， 66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35個(gè)循環(huán)；（2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；（3)制備測(cè)序文庫(kù)； ⑷基因測(cè)序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因全片段快速測(cè)序方法，其特征在于：步驟（1)所述基因 片段為BRCA1和BRCA2基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因全片段快速測(cè)序方法，其特征在于：步驟（2)所述標(biāo)準(zhǔn) 化PCR產(chǎn)物采用Agencourt AMPure XP PCR試劑盒純化目的片段，使用Qubit dsDNA BR Assay試劑盒標(biāo)準(zhǔn)定量DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因全片段快速測(cè)序方法，其特征在于：步驟（3)所述文庫(kù) 制備采用Nextera XT試劑盒進(jìn)行制備。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因全片段快速測(cè)序方法，其特征在于：步驟（4)所述基 因測(cè)序采用Illumina的MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，使用BWA進(jìn)行比對(duì)，GATK軟件分析突變， wANNOVAR網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器注釋分析結(jié)果。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因測(cè)序，其特征在于：IIIUmina的MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序的 測(cè)序參數(shù)為2X250讀長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232761SQ201410429092
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】王凱, 汪鋒, 趙倩, 賈海英 申請(qǐng)人:武漢凱吉盈科技有限公司