一種巨魾魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨魅（Bagariusyarrelli Sykes)屬于鲇形目，姚科，魅屬。俗名"黃魚(yú)"，肉呈黃 色，個(gè)體很大，且食性主要為蝦、泥鰍、小魚(yú)和水生昆蟲(chóng)等。通過(guò)對(duì)其外部形態(tài)，消化系統(tǒng)，繁 殖和生活習(xí)性等多方面的初步研宄，已確定巨魅為底棲肉食性淡水魚(yú)類(lèi)，其消化系統(tǒng)和外 部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征都有較好的適應(yīng)性，巨魅產(chǎn)漂浮性卵，有良好的繁殖特性。在云南省的瀾滄 江、怒江、元江都有巨魅的分布。這些江水含泥沙量很大致使江水十分混濁，但巨魅仍能正 常生活?？梢?jiàn)巨魅對(duì)含泥沙的混濁水質(zhì)適應(yīng)能力強(qiáng)。
[0003] 近年來(lái)，由于漁業(yè)生態(tài)環(huán)境的破壞加劇，水體污染嚴(yán)重和魚(yú)類(lèi)的過(guò)度捕撈，魚(yú)類(lèi)資 源嚴(yán)重遭到破壞。因此利用線粒體基因克隆技術(shù)對(duì)巨魅的遺傳多樣性分析，研宄野生巨魅 魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)，探討群體間的遺傳變異，對(duì)其種質(zhì)資源保護(hù)以及合理開(kāi)發(fā)提供參考。但有關(guān) 線粒體全基因克隆技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種巨魅魚(yú)線粒體全 基因組測(cè)序的方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)出18-20對(duì)引物，并找到合適的退火溫度和反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò) 克隆測(cè)序并經(jīng)過(guò)軟件拼接，即可獲得該巨魅魚(yú)線粒體基因的全長(zhǎng)，本發(fā)明所用方法方便巨 魅魚(yú)的線粒體全長(zhǎng)基因的克隆，為群體遺傳分析提供方便。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法， 包括以下步驟：
[0006] (1)巨魅魚(yú)基因組DNA提取：取0· lg-o. 5g鰭條組織到I. 5ml的離心管中，加入 DNA提取液600 μ1，再加入蛋白酶Κ8-10μ1及5μ1 RNA酶，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻；然后再加 入等體積的體積比25 :24 :1的酚/氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，4°C下12000轉(zhuǎn)/分 離心10分鐘，取上清，然后再加入等體積的體積比為24 :1的氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng) 混勻，4°C下12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；向上清液中加2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，使DNA沉 淀10-25分鐘，70%乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，獲得巨魅魚(yú)基因組DNA，于-20°C保存?zhèn)?用；
[0007] ⑵同源性引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)獲得18對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)，18對(duì)擴(kuò)增引物的序列如Seq ID NO 1~36所示；
[0008] (3)正式PCR擴(kuò)增：反應(yīng)的總體積為50 μ 1，包含IOOng的模板DNA，2 X Taq PCRMaster Mix 25μ1,正向引物2μ1，反向引物2μ1，CldH2O 19yl;PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 4min，然后30個(gè)循環(huán)：94°C預(yù)變性30s，引物退火溫度，72°C延伸2min ;最后72°C延伸 6min ;獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4°C保存；
[0009] (4)目的片段的回收：用TIANGEN試劑公司的凝膠回收試劑盒，按試劑盒說(shuō)明對(duì)步 驟⑶中PCB擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收獲得1000-1500bpDNA目的片段；
[0010] (5)載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆測(cè)序：將步驟⑷中回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克 隆、測(cè)序，將所得的序列與網(wǎng)上的相近種屬的序列用DNAMN軟件進(jìn)行比對(duì)；
[0011] (6)序列拼接：利用DNAMAN軟件或者手動(dòng)將相鄰的引物擴(kuò)增的序列進(jìn)彳丁拼接，最 終獲得全長(zhǎng)巨魅魚(yú)的線粒體基因序列。
[0012] 步驟（3)中所述的引物退火溫度優(yōu)選為：引物對(duì)1的退火溫度范圍為 53 °C -58.6 °C，引物對(duì)2的退火溫度范圍為53 °C -58.6 °C，引物對(duì)3退火溫度范圍為 52. 3 °C -59. 4°C，引物對(duì)4退火溫度范圍為58. 4 °C -62. 7 °C，引物對(duì)5退火溫度范圍為 50-54. 2°C，引物對(duì)6退火溫度范圍為50°C _62°C，引物對(duì)7退火溫度范圍為50°C -61. 5°C， 引物對(duì)8退火溫度范圍為53°C -58. 6°C，引物對(duì)9退火溫度范圍為54. 2°C -60. 8°C，引物 對(duì)10退火溫度范圍為57. 2°C -63. 8°C，引物對(duì)11退火溫度范圍為50. 6-58. 3°C，引物對(duì)12 退火溫度范圍為50 °C -55. 7 °C，引物對(duì)13退火溫度范圍為47 °C -51. 6 °C，引物對(duì)14退火溫 度范圍為55°C -61. 9°C，引物對(duì)15退火溫度范圍為50°C -59. 8°C，引物對(duì)16退火溫度范 圍為55°C -60. 2°C，引物對(duì)17退火溫度范圍為50°C -59. 8°C，引物對(duì)18退火溫度范圍為 50°C -58°C。
[0013] 步驟（6)中所述的全長(zhǎng)巨魅魚(yú)的線粒體基因序列如Seq ID NO :37所不。
[0014] 巨魅魚(yú)線粒體全基因組的克隆測(cè)序需要設(shè)計(jì)不同的引物，而如果設(shè)計(jì)不好，就有 可能擴(kuò)增不出所需要的目的片段，本發(fā)明就是找到一種方法，設(shè)計(jì)不同的引物序列，找到適 當(dāng)?shù)耐嘶饻囟炔⑶铱寺y(cè)序，最終組裝出巨魅魚(yú)的線粒體全基因組序列。
[0015] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0016] 本發(fā)明只需要設(shè)計(jì)出18對(duì)引物，引物序列如Seq ID NO 1~36所示，并找到合適 的退火溫度和反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序并經(jīng)過(guò)軟件拼接，即可獲得該巨魅魚(yú)線粒體基因的 全長(zhǎng)；方便此類(lèi)魚(yú)的線粒體全長(zhǎng)基因的克隆，為群體遺傳分析提供方便，其適合于在水產(chǎn)動(dòng) 物中實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體基因分子遺傳及群體結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)；本發(fā)明建立巨魅魚(yú)的線粒體全基因的 克隆體系，實(shí)現(xiàn)從分子水平上對(duì)巨魅魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)及進(jìn)化歷史進(jìn)行研宄，從而對(duì)巨魅魚(yú)的 資源保護(hù)提供基礎(chǔ)性資料。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為巨魅魚(yú)基因組的DNA檢測(cè)結(jié)果圖，其中：M代表DNAMarker ;1，2,3,4,5,6分 別代表不同的巨魅魚(yú)個(gè)體。
[0018] 圖2為巨魅魚(yú)線粒體基因組擴(kuò)增引物的梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中：M代表 DNAMarker ;1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12代表不同退火溫度下的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物條帶； 1 為 45°C，2 為 46°C，3 為 47. 3°C，4 為 49. 3°C，5 為 51. 9°C，6 為 54. 4°C，7 為 56. 5°C，8 為 58. 8°C，9 為 61. 3°C，10 為 63. 2°C，11 為 64. 2°C，12 為 65°C。
[0019] 圖3為設(shè)計(jì)的引物在適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认戮搠若~(yú)線粒體基因組片段擴(kuò)增圖，其中：M 代表DNAMarker ;1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11代表不同引物在適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认聰U(kuò)增的？〇? 產(chǎn)物片段條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 一種巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，包括以下步驟：
[0023] (1)巨魅魚(yú)基因組DNA提?。喝?. lg-0. 5g鰭條組織到I. 5ml的離心管中，加入DNA 提取液600 μ 1，再加入蛋白酶K8-10 μ 1及5 μ I RNA酶，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻；然后再加入等 體積的體積比25 :24 :1的酚/氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，4°C下12000轉(zhuǎn)/分離心 10分鐘，取上清，然后再加入等體積的體積比為24 :1的氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻， 4°C下12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；向上清液中加2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀10-25 分鐘，70%乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，獲得巨魅魚(yú)基因組DNA，如圖1所示；于-20°C保 存用于下一步的PCR擴(kuò)增；
[0024] (2)同源性引物的設(shè)計(jì)：從GenBank上面查找與魚(yú)近鄰屬或者科的已有的線粒 體全基因組序列，然后用軟件DNAMN進(jìn)行序列比對(duì)，找到保守序列區(qū)，并在序列保守區(qū)用 PRMER5查找設(shè)計(jì)引物序列；大約800-1400bp的間隔設(shè)計(jì)一對(duì)引物，送試劑公司進(jìn)行合成； 18對(duì)引物序列如表1所示。
[0025] 表1為18對(duì)引物序列
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 巨魅魚(yú)基因組DNA提取：取0.lg-O. 5g鰭條組織到I. 5ml的離心管中，加入DNA提 取液600yl，再加入蛋白酶K8-10yl及5ylRNA酶，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻；然后再加入等體 積的體積比25 :24 :1的酚/氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，4°C下12000轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，取上清，然后再加入等體積的體積比為24 :1的氯仿/異戊醇，上下輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，4°C 下12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；向上清液中加2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀10-25 分鐘，70%乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，獲得巨魅魚(yú)基因組DNA，于-20°C保存?zhèn)溆茫? (2) 同源性引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)獲得18對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)，18對(duì)擴(kuò)增引物的序列如SeqIDNO 1~36所示； (3) 正式PCR擴(kuò)增：反應(yīng)的總體積為25y1，包含IOOng的模板DNA，2XTaqPCR MasterMix12.5yl，正向引物Iy1，反向引物Iy1，CldH2O9.5yl;PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C4min，然后30個(gè)循環(huán)：94°C預(yù)變性30s，引物退火溫度，72°C延伸2min;最后72°C延伸 6min;獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4°C保存； (4) 目的片段的回收：用TIANGEN試劑公司的凝膠回收試劑盒，按試劑盒說(shuō)明對(duì)步驟 (3)中PCB擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收獲得1000-1500bpDNA目的片段； (5) 載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆測(cè)序：將步驟⑷中回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè) 序，將所得的序列與網(wǎng)上的相近種屬的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)； (6) 序列拼接：利用DNAMN軟件或者手動(dòng)將相鄰的引物擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接，最終獲 得全長(zhǎng)巨魅魚(yú)的線粒體基因序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，其特征在于：步驟 (3)中所述的引物退火溫度為：引物對(duì)1的退火溫度范圍為53°C-58. 6°C，引物對(duì)2的 退火溫度范圍為53°C-58. 6 °C，引物對(duì)3退火溫度范圍為52. 3°C-59. 4°C，引物對(duì)4退 火溫度范圍為58. 4°C-62. 7 °C，引物對(duì)5退火溫度范圍為50-54. 2 °C，引物對(duì)6退火溫 度范圍為50°C-62°C，引物對(duì)7退火溫度范圍為50°C-61. 5 °C，引物對(duì)8退火溫度范圍 為53°C-58. 6°C，引物對(duì)9退火溫度范圍為54. 2°C-60. 8°C，引物對(duì)10退火溫度范圍 為57. 2°C-63. 8°C，引物對(duì)11退火溫度范圍為50.6-58. 3°C，引物對(duì)12退火溫度范圍 為50°C-55. 7 °C，引物對(duì)13退火溫度范圍為47°C-51.6 °C，引物對(duì)14退火溫度范圍 為55°C-61.9 °C，引物對(duì)15退火溫度范圍為50°C-59. 8 °C，引物對(duì)16退火溫度范圍 為55°C-60. 2°C，引物對(duì)17退火溫度范圍為50°C-59. 8°C，引物對(duì)18退火溫度范圍為 50°C-58°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨魅魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，其特征在于：步驟（6) 中所述的全長(zhǎng)巨魅魚(yú)的線粒體基因序列如SeqIDNO:37所不。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種巨魾魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的巨魾魚(yú)線粒體全基因組測(cè)序的方法，包括以下步驟：巨魾魚(yú)基因組DNA提取，設(shè)計(jì)18對(duì)同源性引物；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序；進(jìn)行序列拼接獲得全長(zhǎng)巨魾魚(yú)的線粒體基因序列。本發(fā)明提供的方法方便巨魾魚(yú)的線粒體全長(zhǎng)基因的克隆，為群體遺傳分析提供方便，其適合于在巨魾魚(yú)中實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體基因分子遺傳及群體結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)；對(duì)巨魾魚(yú)的資源保護(hù)提供基礎(chǔ)性資料。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104726558
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066382
【發(fā)明人】杜民, 劉艷紅, 周傳江, 牛寶珍, 李娜
【申請(qǐng)人】紅河學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年2月7日