專利名稱：Dna和rna的測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的堿基測序測定方法。
現(xiàn)今，脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的堿基測序在生物技術(shù)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷及其他應(yīng)用領(lǐng)域是最重要的分析技術(shù)。生物基因組的破譯為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供了可能，以及為對人類基因組進(jìn)行目標(biāo)修飾從而產(chǎn)生具有修飾特征的有機(jī)體提供了可能。為能利用這些潛力，需要能足夠快速測序的方法。
按照Sanger等(Proceedings of the National Academy of Science，USA，74，5463-7；1977)及Maxam和Gilbert(Proceedings of the NationalAcademy of Science，USA，74，560-564；1977)的經(jīng)典測序法，至今仍為標(biāo)準(zhǔn)測序方法的基礎(chǔ)。測定200個核苷酸，該法需1-3天。對于人類基因組的約3×109個堿基對，用此方法測序，顯得太慢。
新近嘗試加快測序的方法集中于使用熒光光譜來檢測單個核苷酸的方法。U.S.專利4962037公開了一測序方法，根據(jù)該方法，在一單鏈上合成互補(bǔ)核酸鏈，其中代表堿基的熒光顏料分子與每個堿基共價結(jié)合。該熒光標(biāo)記的核酸分子與一粒子表面結(jié)合，并以單個粒子保存，例如以液體流保存在微注射吸管中。利用核酸外切酶逐一從此熒光標(biāo)記了的核酸鏈切下每一熒光標(biāo)記的堿基，并在液體流中被激光束聚焦，并在激發(fā)后檢測對堿基特異的熒光。理論上該方法的測序速度只受外切酶的酶切速度的限制，因此估計測速可達(dá)100-1000個堿基/秒。
實(shí)施美國專利4962037已公開方法的先決條件是只有一個核酸分子保持在一個微粒上。然而，此操作，即將單個微粒與單個核苷酸分子結(jié)合，在技術(shù)上很困難、復(fù)雜，并且已證實(shí)其并不適用于實(shí)際應(yīng)用。此外，外切酶的使用是必需的，所述外切酶能切割顏料標(biāo)記了的核苷酸。這使該方法的發(fā)展復(fù)雜化，此外，對修飾了的外切酶的使用通常情況下導(dǎo)致堿基序列測定出現(xiàn)較高的誤差。
因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于DNA或RNA堿基測序的方法，該方法利用了如上現(xiàn)有技術(shù)中所述單分子檢測測序方法的高速率的優(yōu)點(diǎn)，并同時克服了如前所述的缺點(diǎn)。
為實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，本發(fā)明提供第一種DNA或RNA測序方法，包括如下步驟(1)將DNA或RNA單鏈固定于表面上；(2)將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上；(3)通過加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的混合物或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸的混合物和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈，其中3a)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸這四種核苷酸中的至少兩種或腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸這四種核苷酸中的至少兩種用不同的發(fā)光標(biāo)記物進(jìn)行了部分或全部標(biāo)記，3b)插入到互補(bǔ)鏈中的每一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記了的核苷酸用單分子檢測器進(jìn)行檢測，和3c)在下一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸插入之前對前一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的發(fā)光信號進(jìn)行檢測。
本發(fā)明還提供第二種DNA或RNA堿基測序方法，包括如下步驟(1)將DNA或RNA單鏈固定于表面上；(2)將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上；(3′)通過按續(xù)加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一種或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一種和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈，其中3a′)上述溶液中所含的核苷酸被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記；3b)每一個插入到互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸用單分子檢測器檢測；3c)當(dāng)檢測到插入互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸時，對該被插入的核苷酸的發(fā)光信號進(jìn)行檢測，并且3d′)每加入下一種溶液前進(jìn)行漂洗。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“單鏈DNA或RNA”是指未雜交的DNA或RNA分子。這樣一條單鏈可直接從生物體中分離提取，例如用基因技術(shù)法以及用限制性酶對所述分子進(jìn)行處理后而獲得。寡核苷酸、PCR產(chǎn)物、c-DNA可算作這種單鏈。從雙鏈產(chǎn)生單鏈的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是已知的，例如，參見J.Sambrook等‘Molecular Cloning’(分子克隆)第二版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室手冊。限制性酶切處理可直接在固定之前進(jìn)行，這導(dǎo)致具有不同的堿基序列分子的固定。此單鏈最好為5-2000個堿基對，更好是100-1000堿基對。然而，原則上，堿基長度至100千堿基對也在考慮范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(1)，固定單鏈DNA或RNA于表面上。所述表面優(yōu)選是平面支持物的表面，最好是光學(xué)上透明的，這是如下所描述單分子檢測所必需的。最好是玻璃支持物，尤其是石英玻璃支持物更好。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述支持物的表面最好是用一Langmuir-Blodgett膜進(jìn)行化學(xué)修飾，單鏈即固定在所述表面上。纖維素衍生物的Langmuir-Blodgett膜是特別優(yōu)選的，尤其是三甲基硅烷基醚纖維素肉桂酸酯(TMSCC)和氨基烷基三甲基硅烷基醚纖維素(ATMSC)。
通過共價結(jié)合及通過凈化劑分子，單鏈可通過吸附固定在表面上。凈化劑分子是特殊的被固定在表面上的核苷酸寡聚體，并可通過雜交結(jié)合單鏈。寡聚體于表面上的固定可通過吸附或通過與化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)共價結(jié)合固定在表面上。這種固定優(yōu)先選用(鏈霉素-)抗生物素蛋白-生物素技術(shù)，寡聚體為生物素衍生物并與(鏈霉素-)抗生物素蛋白分子結(jié)合而固定在表面上。(鏈霉素-)抗生物素蛋白分子的固定是不受限制的。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，(鏈霉素-)抗生物素蛋白分子通過纖維素衍生物制成的Langmuir-Blodgett膜而固定在表面上。特別優(yōu)選的是此表面首先涂上1-8層單層氨基烷基三甲基硅烷基醚纖維素(ATMSC)，之后涂上1-8層單層三甲基硅烷基醚纖維素肉桂酸酯(TMSCC)。為共價連接(鏈霉素-)抗生物素蛋白分子，TMSCC的肉桂?；S后被氧化成醛基。此外，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)先使用5’-氨基修飾的寡聚核苷酸作凈化劑分子，其可直接與醛基結(jié)合，如按上述方法獲得的在Langrnuir-Blodgett膜上的醛基。
而且，優(yōu)選在步驟(1)中將單鏈DNA或RNA固定在表面上以使DNA或RNA單鏈的表面的密度為≤1分子/um2。
表面密度的調(diào)節(jié)優(yōu)選通過調(diào)節(jié)共價結(jié)合位點(diǎn)的表面密度來進(jìn)行。這樣做的一種可能性是通過可光交聯(lián)的Langrnuir-Blodgett膜，例如，如前所述的TMSCC膜實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)UV光輻照的時間在所述膜的表面上形式反應(yīng)活性基團(tuán)。這些反應(yīng)活性基團(tuán)可用于與單鏈DNA或RNA、寡核苷酸、(鏈霉素-)抗生物素蛋白分子共價結(jié)合。單鏈的表面密度還可通過預(yù)被固定的單鏈濃度或通過預(yù)被固定的寡聚體的濃度來調(diào)節(jié)。此濃度取決于支撐物的表面積以及取決于被固定的單鏈或被固定的寡聚體溶液的體積。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(2)，一激光束聚焦于單個被固定的單鏈上。激光的選擇取決于堿基的發(fā)光標(biāo)記物，下面將作進(jìn)一步描述。在步驟(2)中，為了將激光聚焦在單鏈上，優(yōu)選使(a)發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸寡聚體與單鏈雜交；(b)雜交的核苷酸寡聚體位置通過激光束在固定了單鏈的表面掃描而確定；(c)此后檢測雜交的核苷酸寡聚體的發(fā)光信號。步驟(a)可在單鏈固定之前或之后進(jìn)行。選擇核苷酸寡聚體的發(fā)光標(biāo)記物和激光束，以在步驟(b)中激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物進(jìn)行發(fā)光。激光束對表面的掃描在步驟(b)中用常規(guī)的柵極或掃描裝置進(jìn)行，如在激光掃描顯微鏡中應(yīng)用的那些。步驟(c)中發(fā)光信號的消除可通過切除發(fā)光標(biāo)記物(特別是光-裂解法切除)或通過光-漂白。
在本發(fā)明第一種方法步驟(3)中，通過加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶四種核苷酸的混合物或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶四種核苷酸的混合物和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈。堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶和/或腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的多聚體產(chǎn)物也可被轉(zhuǎn)化成合成的核苷酸，換言之，這樣的核酸不含磷酸酯骨架，但是，例如，是一肽骨架(肽核酸)。根據(jù)本發(fā)明，四種堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的至少兩種或四種堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的至少兩種被不同的發(fā)光標(biāo)記物部分或全部標(biāo)記。尤其優(yōu)選所有四種堿基包含不同的發(fā)光標(biāo)記物。這使通過簡單地產(chǎn)生互補(bǔ)鏈確定堿基順序成為可能。假如四種堿基中只有兩種被不同的發(fā)光物標(biāo)記，為獲得一完整的序列，生產(chǎn)互補(bǔ)鏈必須重復(fù)五次，每次重復(fù)中采用標(biāo)記堿基的不同組合。當(dāng)用三種標(biāo)記堿基時，互補(bǔ)鏈的生產(chǎn)必須重復(fù)三次，每次采用一種不同的標(biāo)記堿基組合。
根據(jù)本發(fā)明的第二種方法步驟(3’)，通過按續(xù)加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一種或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一種和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈，其中上述溶液中所含的核苷酸被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記。另一方面，作為另一種方式，堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶或堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的多聚體產(chǎn)物也可被轉(zhuǎn)化成合成的核苷酸，換言之，這樣的核酸不含磷酸酯骨架，但是，例如，是一肽骨架(肽核酸)。根據(jù)本發(fā)明的第二種方法，通過相繼添加各自的核苷酸溶液進(jìn)行互補(bǔ)鏈的生產(chǎn)，在添加各自的下一個溶液之前，需漂洗。假如添加核苷酸溶液之后產(chǎn)物信號應(yīng)該產(chǎn)生，通過單分子檢測器，此信號從而可被定位屬于某一堿基。假如，例如，將包含多聚酶以及分別含有腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶中的一種的溶液，添加到被固定的單鏈中，如果信號僅在添加第二種溶液時被檢測到，換言之，與胞嘧啶溶液相符，因此被固定單鏈的相應(yīng)的堿基是鳥嘌呤。假如，另一方面，當(dāng)添加第二種和第三種溶液時檢測到了信號，可發(fā)現(xiàn)在被固定的單鏈上有序列鳥嘌呤胞嘧啶。因此，被固定單鏈的完整序列可通過重復(fù)添加相應(yīng)的溶液而確定。
溶液中所含的聚合酶催化產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。只要能使帶有被顏料標(biāo)記的核苷酸的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生，酶的選擇即不受限制。根據(jù)本發(fā)明，聚合酶可用T4合成酶，天然T7合成酶，大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，Exo III，E.coli pol III全酶，蛇毒磷酸二酯酶和Taq聚合酶。
由聚合酶催化每個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的產(chǎn)生，在互補(bǔ)鏈中根據(jù)本發(fā)明用一單分子檢測器被檢測。根據(jù)本發(fā)明單分子檢測器的使用不受限制，只要它允許對于一定的檢測容量、一定的波長、一定的激光輸出量和一定的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸，單個發(fā)光標(biāo)記的核苷酸分子進(jìn)行檢測即可。對單分子檢測器的敏感度的要求是隨檢測體積的增加和隨激光束輸出量的減小，敏感度提高。基于此原因，最好將檢測體積減至最小，因此激光束聚焦限制在衍射。
激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物的激光光譜優(yōu)選為波長600nm或以上，以盡量減少散射光。特別是，根據(jù)本發(fā)明的方法，在此波長范圍的半導(dǎo)體激光由于較經(jīng)濟(jì)而是優(yōu)選的。如果檢測通過熒光持續(xù)時間的測定而完成，根據(jù)本發(fā)明使用的激光應(yīng)調(diào)節(jié)，最好是脈沖光。
發(fā)光標(biāo)記物既根據(jù)使用的激光又根據(jù)單分子檢測器進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明最好使用熒光基團(tuán)作發(fā)光標(biāo)記物。不考慮檢測種類，選擇一套適宜的熒光基團(tuán)(即一種熒光基團(tuán)與一種相應(yīng)的標(biāo)記核苷酸相對應(yīng))。在顏色(即發(fā)射光子的波長)的檢測和熒光基團(tuán)熒光持續(xù)時間的檢測之間存在差異。用于作熒光發(fā)光時間檢測的顏料樣品被描述于S.Seeger等，在“Ber Bunsenges.Physikal.Chem.”97，1542-1548，1993和M.Sauer等在“熒光雜志”(J.Fluorescence)3，131-139，1993；作顏色檢測的顏料樣品由L.M.Smith等1989年在“自然”(Nature)312，674-670，以及J.M.Prober等1987年在“科學(xué)”(Science)238，336-341述及。例如，顏料JA22，JA66，JA51-DS以及顏料青藍(lán)Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)(公開于Sauer等“熒光雜志”(J.Fluor.)5，247-254，1995)，可用于檢測熒光持續(xù)時間；顏料FAM，JOE，TAMRA和ROX(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)可應(yīng)用于顏色的檢測。根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)明的第一種方法中發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸被不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記的同時，所用顏料可與在第二種方法中的相一致，因?yàn)楹塑账岵顒e的產(chǎn)生可通過各自的不同溶液造成。鑒于簡化的激發(fā)和檢測，根據(jù)本發(fā)明此種方式是優(yōu)選的。
單分子檢測器包括一目鏡，一隨光子的沖擊而產(chǎn)生電流的裝置以及一計算機(jī)(包括計算電流信號的軟件)。目鏡最好能使發(fā)出的光子與激光束的焦點(diǎn)共焦投影在所述裝置上產(chǎn)生電子信號。此裝置最好是一光敏二極管，特別是單光子計數(shù)雪崩光敏二極管。此外，可用一光電倍增管或一放大CCD相機(jī)。特別是最好建立此根據(jù)本發(fā)明的單分子檢測器，其方式是在激光(gating)激發(fā)一定時間后才開始檢測。Loescher等在“Anal.Chem.”，Vol.70，p.3202-3205，1998發(fā)表了根據(jù)本發(fā)明的單分子檢測器是可應(yīng)用的。為區(qū)分不同的著色，單分子檢測器配以相應(yīng)的濾光片。為測定熒光持續(xù)時間，最好使用以時間相關(guān)單個光子計數(shù)方式的檢測器。此外，需要快速測量電子學(xué)，例如，此可在SL Microtest GmbH，Jena上找到。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單分子檢測器有自動相關(guān)功能，此功能使得從固定核苷鏈的發(fā)光信號中排除混淆的分子并分辨出發(fā)光信號成為可能，從而提高了信噪比。
根據(jù)本發(fā)明，在下一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸插入之前，將已插入的核苷酸的發(fā)光信號刪除，這可以通過將發(fā)光標(biāo)記物裂解，特別是光裂解產(chǎn)生。如果發(fā)光標(biāo)記物通過光敏基團(tuán)，例如WO95/31429中公開的那些基團(tuán)與核苷酸結(jié)合，這是可行的。此時一個短激光脈沖可以導(dǎo)致發(fā)光標(biāo)記物裂解。原則上，用以裂解的激光波長不同于用于激發(fā)的波長，而且，優(yōu)選用光漂白核苷酸的發(fā)光標(biāo)記物來進(jìn)行發(fā)光信號的消除。這可通過，比如，短時光強(qiáng)度上升，即，短激光脈沖來實(shí)現(xiàn)。
因此，發(fā)光信號的消除的速率主要取決于激光脈沖的輸出量以及探測與激光脈沖之間所持續(xù)的時間，這兩個參數(shù)都容易控制。為了保證所插入核苷酸的發(fā)光信號能在下一核苷酸插入之前被消除，這兩個參數(shù)要與互補(bǔ)鏈的產(chǎn)生速率相匹配，互補(bǔ)鏈的產(chǎn)生速率可通過設(shè)置溶液的溫度(對聚合酶活性有決定性影響)和核苷酸濃度來控制。
本發(fā)明的第一種方法中，如果并非所有的核苷酸都被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記，固定化的單鏈上的堿基序列就不能通過產(chǎn)生單一的互補(bǔ)鏈來充分準(zhǔn)確地測出。因此，為了測定完整序列，必須重復(fù)進(jìn)行互補(bǔ)鏈的生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在同一單鏈上進(jìn)行互補(bǔ)鏈的生產(chǎn)。為了達(dá)到此目的，通過升溫，上述DNA或RNA互補(bǔ)鏈被從固定的DNA或RNA的單鏈上切下，并重復(fù)上述方法的步驟(3)。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法可在同一分子上進(jìn)行多次序列測定，即使，只用被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸，這也有利于增加序列測定的精確性。
本發(fā)明的方法，對于固定在支持物上的另一單鏈也可被重復(fù)進(jìn)行。對于具有相同堿基序列的單鏈來說，用此方法可以增加所測序列的準(zhǔn)確性。如果預(yù)被測序的核酸序列在固定之前用限制性酶處理，仍然可以成功地測出經(jīng)限制性酶處理后所產(chǎn)生的單鏈不同片段的順序。因此，在固定前，可用限制性酶直接對同一反應(yīng)容器進(jìn)行處理。
實(shí)施例2在第二種方法中，即在固定之前進(jìn)行雜交步驟，將單鏈、氨基-官能化寡聚核苷酸和染料標(biāo)記的寡核苷酸與1ml緩沖液混合，濃度都為10-7mol/L；最后，溶液被稀釋到10-10并且用于固定；這樣最后也可得到密度大約為1分子復(fù)合物/10μm2。
實(shí)施例32μl10-11M的單核苷酸，用染料Cy5(AmershamPharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)標(biāo)記，將之和3.5U P7測序酶-聚合物一起加入到被固定的單鏈中。用一個輸出功率為400μW和聚焦直徑為2μm的激光來檢測所產(chǎn)生的核苷酸。
權(quán)利要求
1.DNA或RNA堿基序列測定方法，包括以下步驟(1)將DNA或RNA單鏈固定于表面上；(2)將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上；(3)通過加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的混合物或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸的混合物和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈，其中3a)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸這四種核苷酸中的至少兩種或腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸這四種核苷酸中的至少兩種被不同的發(fā)光標(biāo)記物進(jìn)行了部分或全部標(biāo)記，3b)插入到互補(bǔ)鏈中的每一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記了的核苷酸用單分子檢測器進(jìn)行檢測，和3c)在下一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸插入之前對前一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的發(fā)光信號進(jìn)行檢測。
2.DNA或RNA堿基序列測定方法，包括以下步驟(1)將DNA或RNA單鏈固定于表面上；(2)將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上；(3′)通過按續(xù)加入含有(i)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一種或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一種和(ii)一種聚合酶的溶液，來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈，其中3a′)上述溶液中所含的核苷酸被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記；3b)每一個插入到互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸用單分子檢測器檢測；3c)當(dāng)檢測到插入互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸時，對該插入的核苷酸的發(fā)光信號進(jìn)行檢測，并且3d′)每加入下一種溶液前進(jìn)行漂洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中對于將DNA或RNA單鏈固定在一個表面上，在步驟(1)中通過將所述單鏈與固定在所述表面上的核苷酸寡聚體進(jìn)行雜交來進(jìn)行固定。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中在將所述DNA或RNA單鏈固定的過程中，在步驟(1)中以≤1分子/μm2的表面密度將將DNA或RNA單鏈固定在一個表面上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，通過調(diào)節(jié)共價結(jié)合位點(diǎn)的表面密度來調(diào)節(jié)所述表面上的單鏈的表面密度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，通過調(diào)節(jié)預(yù)被固定的單鏈濃度或預(yù)被固定的寡聚體的濃度來調(diào)節(jié)單鏈的表面密度。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中為在步驟(2)把激光束聚焦到被固定的單鏈上a)被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸寡聚體與單鏈進(jìn)行雜交；b)用激光束掃描所述的表面，以確定被雜交的核苷酸-寡聚體的位置；c)隨后對被雜交的核苷酸-寡聚體發(fā)光信號進(jìn)行檢測。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(3b)，根據(jù)被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的熒光持續(xù)時間來檢測每一個插入到互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(3b)，根據(jù)被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的顏色來檢測每一個插入到互補(bǔ)鏈中的被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(3b)中的單分子檢測器具有自動相關(guān)功能。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過將被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸裂解來去除步驟(3c)中的發(fā)光信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過光漂白被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸來去除步驟(3c)中的發(fā)光信號。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過調(diào)節(jié)聚合酶活性、激光密度和核苷酸的濃度這些參數(shù)，在步驟(3c)中，在每插入下一個核苷酸之前先將發(fā)光信號去除。
14.一種測定DNA或RNA堿基序列的方法，其中通過升高溫度，使根據(jù)上述權(quán)利要求之一所述方法制備的互補(bǔ)DNA或RNA鏈從所述被固定的DNA或RNA單鏈上裂解下來，并且針對同一條單鏈，重復(fù)上述權(quán)利要求之一所述的方法。
15.一種測定DNA或RNA堿基序列的方法，其中對被固定在表面上的另一條DNA或RNA單鏈，重復(fù)以上權(quán)利要求之一所述的方法。
全文摘要
DNA或RNA堿基序列測定方法,包括步驟:1)將DNA或RNA單鏈固定于平面支持物上;2)將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上;和3)通過加入含有(ⅰ)用于合成DNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶四種核苷酸的混合物或用于合成RNA互補(bǔ)鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶四種核苷酸的混合物和(ⅱ)一種聚合酶的溶液,用來產(chǎn)生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補(bǔ)鏈,插入到互補(bǔ)鏈中的每一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記了的核苷酸用單分子檢測器進(jìn)行檢測,以及在下一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸插入之前對前一個被發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸的發(fā)光信號進(jìn)行檢測。
文檔編號G01N21/78GK1328604SQ99813808
公開日2001年12月26日 申請日期1999年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者斯特凡·澤格 申請人:分子機(jī)械和工業(yè)股份有限公司