專利名稱：宏基因組提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提取宏基因組的方法，具體地涉及降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的方法。
背景技術(shù)：
宏基因組是出現(xiàn)在某一環(huán)境樣品中的所有遺傳物質(zhì)，包括許多個(gè)體物種的基因組。宏基因組學(xué)是指直接從環(huán)境樣品中獲得遺傳物質(zhì)，對(duì)宏基因組進(jìn)行研究的科學(xué)。隨著高通量DNA測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，宏基因組學(xué)的應(yīng)用價(jià)值不斷提升。通過分析宏基因組文庫(kù)，可發(fā)現(xiàn)某環(huán)境中微生物的群體特征及相互作用規(guī)律，探討微生物與環(huán)境的相互影響。對(duì)微生物群體DNA的測(cè)序，可篩選具有特定功能的基因，獲得特殊功能的蛋白。人呼吸道每天接觸到大量的病毒和細(xì)菌等微生物，對(duì)呼吸道宏基因組的研究能有效地了解各微生物群體的特征，從而幫助臨床診斷和治療。在呼吸道宏基因組中，相對(duì)于宿主人的基因組含量，病原體基因組含量一般比較小。因此，在呼吸道宏基因組測(cè)序中，為達(dá)到病原體基因組足夠的序列覆蓋度，消除宿主基因組的影響是非常重要的。人呼吸道樣品中總DNA的質(zhì)量是宏基因組測(cè)序成功與否的關(guān)鍵。對(duì)傳染病樣品，處理DNA污染的方法需要花費(fèi)比較多的時(shí)間，或者收集樣品時(shí)需要特殊的處理方法。一般提取DNA時(shí)，需要利用去垢劑SDS或者溶菌酶、蛋白酶K等裂解細(xì)胞，然后利用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀DNA。在提取宏基因組DNA時(shí)，由于細(xì)胞類型的多樣性以及存在宿主DNA的干擾，所以需要更有效的純化方法用于DNA的提取。人Alu 重復(fù)序列屬于短散在序列(short interspersed elements, SINEs)家族。每個(gè)Alu序列的長(zhǎng)度約280bp，具有可變的多聚A(poly-A)尾巴。Alu重復(fù)序列超過一百萬條，約占人基因組的10%，已經(jīng)被用于人類某些遺傳疾病的分析。Alu重復(fù)序列是不同的，可被分為幾個(gè)亞家族，是極好的標(biāo)志物，可被用于檢測(cè)人類基因組。Alu作為特異的探針，使用PCR技術(shù)，可以定量人基因組DNA。在人類基因組中，許多新的Alu序列被發(fā)現(xiàn)，并且大部分序列在其他靈長(zhǎng)類基因組中不存在，因此依據(jù)特異Alu重復(fù)序列的分析可作為人類DNA鑒定和定量的有利方法。鏈霉親和素包被的磁珠，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物素化核酸、抗體或其他生物素化配體及靶分子分離和處理。直徑為2. 8 μ m的超順磁珠，具有共價(jià)連接到表面并另外用BSA封閉的單層重組鏈霉親和素。由于具有單層的鏈霉親和素，絕大多數(shù)生物素結(jié)合位點(diǎn)在空間上不僅可以結(jié)合游離生物素，而且還可以結(jié)合生物素化的配體。它們顯示出快速液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性，并且形狀確定的特異性表面便于進(jìn)行高效捕獲、分離和下游操作。實(shí)時(shí)突光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱 Real-timePCR,也被稱為 quantitative Real-time polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱 Q-PCR),是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR)的分子生物學(xué)技術(shù),該技術(shù)可以對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用特異的探針序列或者引物，隨著擴(kuò)增過程中DNA模板量的增加，釋放出的熒光強(qiáng)度也在增加，因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以利用較少的樣品，動(dòng)態(tài)檢測(cè)初始目標(biāo)DNA的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種提取人類宏基因組的方法，該方法利用探針雜交消減法，能夠有效降低宿主宏基因組中宿主DNA背景干擾。本發(fā)明第一方面，提供了一種宏基因組提取方法，其特征在于利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的影響。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述探針與所述宿主基因組DNA樣品雜交后與所述磁珠偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了一種宏基因組提取方法，包括步驟
1)將標(biāo)記有生物素的所述探針與提取的所述宿主宏基因組DNA樣品進(jìn)行雜交；
2)用包被有鏈霉親和素的所述磁珠捕獲探針與所述宿主DNA的復(fù)合體，并用磁力架分離磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物；
3)將去除所述磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物的雜交液以及雜交后的磁珠清洗液進(jìn)行純化回收DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述探針與所述磁珠偶聯(lián)后與所述宿主基因組的雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種宏基因組提取方法，包括步驟
1)利用包被有鏈霉親和素的所述磁珠與標(biāo)記生物素的所述探針偶聯(lián)；
2)將偶聯(lián)好的復(fù)合物與所述宿主宏基因組DNA樣品雜交；
3)去除磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物，對(duì)雜交液和雜交清洗液進(jìn)行純化回收DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述的宏基因組提取方法中，在偶聯(lián)溫度下使用多種正反向探針。使用多種正反向探針，可擴(kuò)大探針與宿主DNA雜交時(shí)結(jié)合的范圍，同時(shí)可以充分飽和磁珠上的鏈霉親和素位點(diǎn)，提高磁珠的利用效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述的宏基因組提取方法中，在雜交完成之后，對(duì)所述磁珠-探針-DNA復(fù)合物進(jìn)行加熱或者氫氧化鈉法變性，回收偶聯(lián)有探針的磁珠。回收回收偶聯(lián)有探針的磁珠，可降低實(shí)驗(yàn)成本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，針對(duì)人基因組Alu重復(fù)序列家族設(shè)計(jì)探針，通過這些探針雜交消減，達(dá)到減少人體DNA在樣品中比例的目的。其中探針以多種Alu重復(fù)序列家族以及其兩端的保守序列為模板，雙向設(shè)計(jì)探針，探針長(zhǎng)度在4(T70nt之間，且5’端修飾有生物素。探針序列可選自序列表SEQ ID NO:1 139的人Alu序列。利用人特異的Alu序列，消除呼吸道樣品中宿主人基因組的影響，對(duì)高通量宏基因組測(cè)序有非常顯著的幫助。本發(fā)明第四方面提供了呼吸道樣品處理方法，針對(duì)不同取樣方法、樣品物理性質(zhì)，采用稀釋液化、離心收集等方法，最大效率富集樣品中的細(xì)胞。

該方法不僅適用于用于人呼吸道宏基因組學(xué)研究，也適用于人體其他部位例如口腔、消化道、皮膚、生殖道宏基因組學(xué)研究，可以有效降低人DNA的高背景干擾，從而有效富集微生物DNA，減少宿主DNA背景引起的測(cè)序數(shù)據(jù)浪費(fèi)，提高有效數(shù)據(jù)的產(chǎn)出量，更深入的挖掘宏基因組中微生物信息。


圖1為支氣管及肺泡灌洗液與氣道分泌物總DNA凝膠電泳圖。圖2為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為實(shí)施例1中混合樣品原液、雜交液回收液以及磁珠清洗液中質(zhì)粒qPCR絕對(duì)定量擴(kuò)增曲線。3組曲線簇自左至右分別代表模擬混合DNA原樣，雜交液BW，清洗液W，橫線表示閾值線。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)例支氣管肺泡灌洗液(BAL)、氣道分泌物以及全血總DNA提取 一、支氣管肺泡灌洗
對(duì)彌漫性間質(zhì)性肺疾病選擇右肺中葉(B4或B5)或左肺舌段，局限性肺病變則在相應(yīng)支氣管肺段進(jìn)行灌洗。首先在要灌洗的肺段經(jīng)活檢孔通過細(xì)硅膠管注入2%利多卡因f 2ml，做灌洗肺段局部麻醉；然后將纖支鏡頂端緊密楔入段或亞段支氣管開口處，再經(jīng)活檢孔通過硅膠管快速注入37°C滅菌生理鹽水。每次25 50ml，總量10(T250ml，一般不超過300ml ;立即用5(Tl00mmHg負(fù)壓吸引回收灌洗液，通?；厥章蕿?0%飛0% ;將回收液體立即用雙層無菌紗布過濾除去粘液，并記錄總量；裝入硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細(xì)胞粘附)，置于含有冰塊的保溫瓶中。二、氣道分泌物吸引
選擇合適的吸痰管，吸痰管的外徑不應(yīng)超過氣管導(dǎo)管內(nèi)徑1/2 ;檢查吸痰裝置是否完好，吸引負(fù)壓應(yīng)不超過-50mmHg ;清潔口腔之后進(jìn)行純氧膨肺，氣道灌洗。阻斷吸痰管負(fù)壓，將吸痰管插入氣管導(dǎo)管作，吸痰后吸凈口咽部分泌物。，達(dá)到氣管導(dǎo)管末端時(shí)上提O. 5cm開放負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)上提；吸痰動(dòng)作輕柔、迅速，每次吸痰時(shí)間不超過15秒；嚴(yán)格無菌操作。三、儀器與試 劑準(zhǔn)備
ABI 7500 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 儀(Applied Biosystems, Life Technologies 公司)。Qubit 2· O 突光定量?jī)x(Invitrogen, Life Technologies 公司)。蛋白酶K :將100 mg蛋白酶K溶于5 mL雙蒸水,配制成20 mg/ml的溶液，-20°C保存。IL PBS 緩沖液(ρΗ7· 4)
磷酸二氫鉀(KH2PO4)(購(gòu)自北京化工廠)，0.27g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(購(gòu)自西隴化工)，1. 42g 氯化鈉(NaCl)(購(gòu)自西隴化工)，8g 氯化鉀(KCl)(購(gòu)自北京化工廠)，0.2g
加去離子水約800 mL充分?jǐn)嚢枞芙?然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7. 4,最后定容到1L,高
溫高壓滅菌后室溫保存。DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN，貨號(hào) 51306)。四、提取步驟
1、取灌洗液收集l 5ml，13000rpm離心濃縮10分鐘，棄上清，加入等體積PBS稀釋，輔助溶解分散，對(duì)于粘稠的氣道分泌物，需要先用2 3倍體積PBS進(jìn)行稀釋，輕柔混勻進(jìn)行勻質(zhì)化；
2、準(zhǔn)備若干1.5ml離心管，每管加入50μ I蛋白酶K于管中；3、每管加入500μ I稀釋分散后的呼吸道分泌物樣品，不足500 μ I用PBS補(bǔ)足；
4、每管加入500 μ I buffer AL (QIAamp DNA Mini Kit)，輕柔混勻 15 秒后置于 56°C水浴鍋中，孵育10分鐘；
5、取出后,快速離心,將管壁與管蓋上的液滴收集回管內(nèi)，加入500μ I無水乙醇,渦旋混勻15秒，快速離心后，將管內(nèi)全部混合物轉(zhuǎn)移至離心柱中(可分兩次進(jìn)行)，SOOOrpm離心I分鐘，轉(zhuǎn)移離心柱至新離心管中；
6、加入500μ I buffer AW1，8000rpm離心I分鐘，棄掉管內(nèi)液體;
7、加入500μ I buffer AW2，14000rpm離心3分鐘，棄掉管內(nèi)液體后，空甩I分鐘；
8、轉(zhuǎn)移離心柱至1.5ml新離心管中，加入30 μ I雙蒸水，室溫放置2分鐘后，8000rpm離心一分鐘。提取出的總DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1，M DL2000,條帶由大到小為2000bp, IOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0泳道I和泳道2為氣道分泌物提取獲得的DNA，濃度分別為72ng/ μ 1，15ng/ μ I ;泳道3和泳道4為支氣管肺泡灌洗液提取獲得的DNA，濃度均為2Ing/μ I。從圖1可看出基因組DNA條帶完整。 圖2為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品采用BAP質(zhì)粒(2. 6 kbp)5倍梯度稀釋成5個(gè)濃度梯度的樣品，由標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量分析樣品中質(zhì)粒含量。圖中橫坐標(biāo)Log CO表示模板濃度，縱坐標(biāo)Ct表示樣品的Ct值，每個(gè)方形點(diǎn)表示標(biāo)準(zhǔn)樣品。由此進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)中雜交前后樣品中質(zhì)粒的定量。

灌洗液與全血參照上述步驟進(jìn)行總DNA提取。實(shí)施例雜交消減降低宏基因組DNA中宿主DNA背景
本發(fā)明利用Alu序列在人DNA中出現(xiàn)頻率高的特點(diǎn)，針對(duì)Alu家族序列以及兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針，5’端用生物素標(biāo)記，并將不同序列的多種探針配合使用，通過聯(lián)袂親和素包被的磁珠，將雜交復(fù)合DNA捕獲出來，從而減少宿主DNA在宏基因組中的背景干擾。所需試劑及母液配制
20X SSPE :稱取210. 6g NaCl (購(gòu)自西隴化工)，27. 6g NaH2PO4H2O (購(gòu)自北京化工廠)，
5.845g EDTA(購(gòu)自西隴化工)，去離子水溶解，調(diào)整pH至7. 7，定容至1L，過濾除菌分裝，4°C保存。100XDenhardtJ s regent 溶液稱取 2g 聚鹿糖(Ficoll,400 型，購(gòu)自 Sigma), 2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，購(gòu)自Sigma，P_3004)，2g BSA (購(gòu)自索寶來生物科技)，加水至總體積為100ml。過濾除菌，分裝成小份，_20°C貯存。20 X SSC :稱取88. 2g檸檬酸鈉(購(gòu)自西隴化工)，175. 3g NaCl，加900ml水溶解，用NaOH (購(gòu)自北京化工廠)調(diào)節(jié)pH至7.0，去離子水定容至1L，過濾除菌。 10%SDS溶液取IOgSDS (購(gòu)自北京全新拓達(dá)科技),去離子水溶解,定容至100ml。IM Tris-HCl ;稱取72. 66gTris_base (購(gòu)自北京全新拓達(dá)科技),加入500ml去離子水，用HCl (購(gòu)自北京化工廠)調(diào)節(jié)pH至7. 5，定容至600ml。50mM EDTA溶液稱取1. 86gEDTA溶于IOOml去離子水。4M NaCl溶液稱取23. 376gNa0H溶于IOOml去離子水。以上母液均用過濾法除菌。雜交液50ml2 X B&ff buffer 取 O. 5ml IM Tris-HCl (pH 7. 5)，Iml 50mMEDTA, 25ml 4M NaCl，加水至 50ml。50ml 2X 雜交液 HYB buffer :取 25ml 20X SSPE 溶液，5ml 100XDenhardtJ s 溶液，IOml 50mM EDTA, Iml 10% SDS，加水至 50ml。50ml 磁珠清洗液 wash buffer :取 2. 5ml 20 X SSC, 0. 5ml 10%SDS,加水至 50ml探針變性磁珠回收液(0. 15M NaOH):稱取O. 6gNa0H，溶于IOOml去離子水中，分裝保存。實(shí)施例1對(duì)模擬混合樣品進(jìn)行探針雜交消減(先雜交后偶聯(lián))
1、模擬混合DNA取20μ l (按人全血DNA與2815bp質(zhì)粒按照納克量9 1混合，總量約100ng/μ l)于200 μ I管中，置于PCR儀中95°C預(yù)熱5分鐘，65°C 5分鐘；取27 μ l 2X雜交液HYB置于PCR儀中65°C預(yù)熱5分鐘；
2、取序列號(hào)為SEQID NO Γ70的探針各O.1 μ 1，約70pmol，65°C預(yù)熱2分鐘；
3、混合上述體系共54μ1，65°C，雜交1小時(shí)；
4、取磁珠M-280 (invitrogen) 30 μ l,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，棄上清，用 54 μ l2XB&W重懸；
5、將雜交體系(54μ l)加入磁珠中，混勻，室溫下(20°C 25°C)孵育15分鐘，期間輕彈
管壁，混勻；
6、磁珠結(jié)合過程結(jié)束之后，將1.5ml離心管置于磁力架上，室溫放置廣2分鐘，待磁珠吸附到管壁之后，吸取上清保留，標(biāo)記為BW ；
7、用100μ lwash buffer，輕輕吹打清洗磁珠，然后置于磁力架上靜止，上清吸出保留標(biāo)記為W，再重復(fù)2次；
8、用ΙΟΟμΙwash buffer,輕輕吹打清洗磁珠,然后置于磁力架上靜止,上清吸出保留標(biāo)記為W，再重復(fù)2次；將回收回來的雜交液BW與wash buffer清洗之后的回收液W用Qiagen PCR 純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit，QIAGEN，貨號(hào) 28106)柱回收DNA，5μl洗脫0嫩。磁珠可按如下的方法保存20μ I O. 15Μ NaOH溶液重懸磁珠，室溫下孵育10分鐘，置于磁力架上廣2分鐘后去除上清，加30μ I 1 X B&ff buffer溶液，4 °C保存磁珠。磁珠用50 μ l1 X SSC溶液清洗之后，加入50 μ L 1 X SSC重懸磁珠，95°C孵育5分鐘，置于磁力架上靜置廣2分鐘后，移除上清，加入30 μ L 1XB&W溶液保存。實(shí)施例2對(duì)呼吸道灌洗液樣品總DNA進(jìn)行探針雜交消減(先雜交后偶聯(lián))
除了在實(shí)施例1步驟I中，選用人呼吸道灌洗液樣品DNA、取2Χ雜交液HYB 32μ1、步
驟2中取序列號(hào)為SEQ ID NO Γ4的探針各3 μ I(約120pmol )、步驟4中用64 μ I 2 XB&ff重懸以外，以與實(shí)施例1中相同的方法和條件進(jìn)行先雜交后偶聯(lián)探針雜交消減。實(shí)施例3對(duì)模擬混合樣品進(jìn)行探針雜交消減(先偶聯(lián)后雜交)
1、取磁珠M_280(invitrogen)30 μ I,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，棄上清，加入 15 μ I2 X B&ff buffer重懸磁珠；
2、向重懸的磁珠中加入序列號(hào)為SEQID NO 7Γ139的探針各O.1 μ I (約70pmol)以及8 μ I ddH20，室溫下孵育15分鐘，期間輕旋混勻；置于磁力架室溫放置f 2分鐘，去上清；
3、模擬混合DNA取20μ I (按人全血DNA與約2. 6kbp質(zhì)粒按照納克量9 I混合，總量約IOOng/μ I)于200 μ IPCR管中，置于PCR儀95°C預(yù)熱5分鐘，65°C 5分鐘；取26μ I
2X雜交液HYB置于PCR儀中65°C預(yù)熱5分鐘；4、將混合DNA和雜交液加入磁珠中，混勻，置于PCR儀中65°C，雜交I小時(shí)，期間間隔混
勻；
5、雜交結(jié)束之后步驟參照實(shí)施例1的步驟6-8。實(shí)施例4對(duì)呼吸道灌洗液樣品總DNA進(jìn)行探針雜交消減(先偶聯(lián)后雜交)
除了步驟2中加入12種序列號(hào)為SEQ ID NO :1 12的探針各1μ l(120pmol)以及3μ I水、步驟3中取人呼吸道灌洗液樣品DNA樣品20 μ I外，以與實(shí)施例3中相同的方法和條件進(jìn)行先偶聯(lián)后雜交探針雜交消減。檢測(cè)例I測(cè)定雜交消減前后宿主DNA的降低
利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量分析，測(cè)定雜交消減前后混合樣品中質(zhì)粒DNA的含量差異，以及人DNA與質(zhì)粒DNA的比例差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑采用THUNDERBIRDProbe qPCR Mix(Toyobo)，選取質(zhì)粒上特定序列設(shè)計(jì)的序列號(hào)為SEQ ID NO :142和SEQ IDNO :143的引物和序列號(hào)為SEQ ID NO :144的探針，探針的5’端標(biāo)記FAM熒光集團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅集團(tuán)。依照THUNDERBIRD Probe qPCR Mix說明書進(jìn)行Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)。通過標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)雜交前后質(zhì)粒DNA的含量進(jìn)行絕對(duì)定量，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)樣。Q-bit熒光定量測(cè)定DNA樣品的總DNA含量之后，用總量減去質(zhì)粒DNA量，即為人DNA含量，測(cè)定以ng為單位，結(jié)果見表I。圖3為實(shí)施例1中混合樣品 原液、雜交液回收液以及磁珠清洗液中質(zhì)粒qPCR絕對(duì)定量擴(kuò)增曲線。3組曲線簇自左至右分別代表模擬混合DNA原樣，雜交液BW，清洗液W。綠色橫線表示閾值線，閾值線與擴(kuò)增曲線相交處對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值，通過Ct值可以比較計(jì)算初始DNA模板量。Ct值越小，初始模板濃度越大，結(jié)合DNA溶液體積即可計(jì)算初始模板總量。經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)混合DNA原液和雜交回收液中的質(zhì)粒進(jìn)行絕對(duì)定量分析，合并BW和W純化回收之后得到的質(zhì)粒量。實(shí)施例1中，質(zhì)粒回收效率約為初始混合DNA中質(zhì)粒的91%，雜交之后人與質(zhì)粒DNA量(ng)比例約為1:1 ;實(shí)施例3中，質(zhì)粒回收效率約為初始混合DNA中質(zhì)粒的83. 5%，雜交之后人與質(zhì)粒DNA量(ng)比例約為O. 92 1，能夠有效減少人DNA的含量，結(jié)果見表I。表I定量分析實(shí)施例1和3中雜交前后的質(zhì)粒DNA和人DNA含量及比例。
權(quán)利要求
1.一種宏基因組提取方法，其特征在于利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針與所述宿主基因組DNA樣品雜交后與所述磁珠偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的宏基因組提取方法，其特征在于包括步驟 1)將標(biāo)記有生物素的所述探針與提取的所述宿主宏基因組DNA樣品進(jìn)行雜交； 2)用包被有鏈霉親和素的所述磁珠捕獲探針與所述宿主DNA的復(fù)合體，并用磁力架分離磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物； 3)將去除所述磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物的雜交液以及雜交后的磁珠清洗液進(jìn)行純化回收DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針與所述磁珠偶聯(lián)后與所述宿主基因組的雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宏基因組提取方法，其特征在于包括步驟 1)利用包被有鏈霉親和素的所述磁珠與標(biāo)記生物素的所述探針偶聯(lián)； 2)將偶聯(lián)好的復(fù)合物與所述宿主宏基因組DNA樣品雜交； 3)去除磁珠-探針-目標(biāo)DNA復(fù)合物，對(duì)雜交液和雜交清洗液進(jìn)行純化回收DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1飛的任一項(xiàng)所述的宏基因組提取方法，其特征在于在偶聯(lián)溫度下使用多種正反向探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的宏基因組提取方法，其特征在于雜交完成之后，對(duì)所述磁珠-探針-DNA復(fù)合物進(jìn)行加熱或者氫氧化鈉法變性，回收偶聯(lián)有探針的磁珠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針選自序列表中的序列 SEQ ID NO 1 至序列 SEQ ID NO :139。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述宿主宏基因組DNA樣品取自人呼吸道、口腔、消化道、皮膚或生殖道。
全文摘要
本發(fā)明公開了宏基因組提取方法，所述方法利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA。所述方法利用宿主DNA中的重復(fù)序列Alu序列及其兩端保守序列作為模板，設(shè)計(jì)單向或者雙向探針，其中每條探針的5’端以生物素修飾，使用包被有鏈霉親和素的磁珠捕獲與探針雜交的宿主DNA，以達(dá)到減弱宏基因組中宿主DNA背景、提高測(cè)序數(shù)據(jù)有效率的目的。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103060309SQ20121058061
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者任魯風(fēng), 王緒敏, 楚亞男, 高靜, 谷嵐, 隋碩, 康禹, 徐力, 袁麗娜, 張奕杰, 高占成, 于軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所, 北京大學(xué)人民醫(yī)院