一種基因測(cè)序方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基因測(cè)序方法，其步驟如下：一、將待測(cè)的單鏈DNA連接到通用的DNA序列上；二、將互補(bǔ)的DNA引物與通用的DNA序列配對(duì)，并且引物上設(shè)有3’-OH官能團(tuán)進(jìn)行DNA延長(zhǎng)的化學(xué)反應(yīng)；三、通過(guò)DNA聚合酶的催化，把與待測(cè)序的DNA鏈堿基互補(bǔ)的熒光修飾核酸分子加入到引物鏈上；四、通過(guò)成像系統(tǒng)，讀出每段DNA上帶有的不同熒光信號(hào)；五、化學(xué)切除保護(hù)基團(tuán)；六、進(jìn)行下一輪的測(cè)序。本發(fā)明采用一種新的核苷酸修飾分子進(jìn)行合成測(cè)序，用K2CO3水溶液進(jìn)行化學(xué)切除，讓邊合成邊測(cè)序得以順利實(shí)現(xiàn)；采用3種熒光分子標(biāo)記核苷酸，減少了熒光修飾分子和激光的使用，節(jié)約了成本，且測(cè)序過(guò)程更穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】一種基因測(cè)序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因測(cè)序方法，主要用于生物的基因測(cè)序。
【背景技術(shù)】
[0002]在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，如診斷，生物技術(shù)，法醫(yī)生物學(xué)，生物系統(tǒng)學(xué)中，基因序列已成為不可缺少的知識(shí)。具有現(xiàn)代的基因測(cè)序技術(shù)的快速測(cè)序速度已經(jīng)有助于達(dá)到測(cè)序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測(cè)序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動(dòng)物，植物和微生物物種的完整基因序列。
[0003]如今基因測(cè)序正處在日新月異的進(jìn)步之中，其突出特點(diǎn)是，測(cè)序通量大幅增長(zhǎng)，原始數(shù)據(jù)中每個(gè)堿基的測(cè)序成本急劇下降。以前非常耗時(shí)耗資的研究項(xiàng)目如個(gè)人基因組測(cè)序，外顯子基因組學(xué)研究以及對(duì)大量重要物種的測(cè)序等等在在短短幾年之間變得越來(lái)越切實(shí)可行了。
[0004]第一代DNA測(cè)序技術(shù)用的是1975年由桑格(Sanger)開(kāi)創(chuàng)的雙脫氧終止法。后來(lái)經(jīng)過(guò)改進(jìn)成為四色熒光桑格測(cè)序法，用在自動(dòng)毛細(xì)管電泳測(cè)序系統(tǒng)中。此種方式不僅耗資龐大，花費(fèi)人力無(wú)數(shù)，而且歷時(shí)超過(guò)十年，但是由于其準(zhǔn)確性高，所以作為基因組的"參照"序列而被采用。
[0005]之后出現(xiàn)了第二代基因測(cè)序技術(shù)，主要是Roche公司的焦磷酸測(cè)序法，Illumina公司的DNA合成終止法測(cè)序以及Life Technologies公司的DNA連接測(cè)序法。這些公司利用商業(yè)化提供的儀器，以短的連續(xù)性的片段序列和測(cè)序閱讀長(zhǎng)度的形式，可以每周測(cè)出數(shù)十億堿基對(duì)(Gbp)的DNA序列。以上方法得到一個(gè)人的基因組數(shù)據(jù)成本仍然在數(shù)十萬(wàn)美元
左右。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了解決上述問(wèn)題，提供一種基因測(cè)序方法。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種基因測(cè)序方法，其步驟如下:
[0008]一、將待測(cè)的單鏈DNA連接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面；
[0009]二、將互補(bǔ)的DNA引物與通用的DNA序列配對(duì)，并且引物上設(shè)有3’_0H官能團(tuán)進(jìn)行DNA延長(zhǎng)的化學(xué)反應(yīng)；
[0010]三、通過(guò)DNA聚合酶的催化，把與待測(cè)序的DNA鏈堿基互補(bǔ)的熒光修飾核酸分子加入到引物鏈上，其中，三種核酸分子具有熒光，一種沒(méi)有熒光；
[0011]四、通過(guò)成像系統(tǒng)，讀出每段DNA上帶有的不同熒光信號(hào)，使用三種波長(zhǎng)的激光分別先后照射樣品，每種激光會(huì)激發(fā)相應(yīng)的熒光基團(tuán)，并且產(chǎn)生相應(yīng)的熒光，通過(guò)濾波片后可以收集到該熒光信號(hào)，玻璃表面的每一點(diǎn)產(chǎn)生的信號(hào)都會(huì)被記錄；
[0012]五、化學(xué)切除保護(hù)基團(tuán)，3’ -OH上的終止基團(tuán)，以及熒光分子和堿基之間的連接分子;
[0013]六、進(jìn)行下一輪的測(cè)序。[0014]進(jìn)一步的，所述步驟二中每條DNA鏈上每次只能加入一個(gè)核酸分子。
[0015]進(jìn)一步的，所述步驟二中，在測(cè)序的玻片中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶，緩沖溶液，Mn2+在引物處進(jìn)行擴(kuò)增，緩沖溶液100mmol/L Tris-HCl pH = 7.8,20mmol/LMnCl2, 2mmol/L四種突光標(biāo)記的dNTP, I單位的DNA聚合酶Thermosequenase,在恒溫60°C,避光條件下反應(yīng)30min。
[0016]進(jìn)一步的，所述步驟三中，停止反應(yīng)，用去離子水多次沖洗除去玻片表面的反應(yīng)溶液。然后用lOOmmol/L Tris-HCl (pH = 7.8)緩沖溶液沖洗玻片表面。再用去離子水多次沖洗。最后用氮?dú)獯蹈刹Ｆ砻妗?br> [0017]進(jìn)一步的，所述步驟四中，運(yùn)行激光激發(fā)玻片程序，四種激光依次打開(kāi)，每次一束激光通過(guò)預(yù)設(shè)光路進(jìn)入物鏡，并且聚焦到玻璃片表面，一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。
[0018]進(jìn)一步的，所述步驟五中，使用飽和K2CO3水溶液與玻璃表面的DNA分子反應(yīng)，完全切割熒光基團(tuán)以及3’ -OH的保護(hù)基團(tuán)。
[0019]進(jìn)一步的，所述步驟二中，熒光修飾的核酸分子分子結(jié)構(gòu):
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種基因測(cè)序方法，其特征在于，步驟如下: 一、將待測(cè)的單鏈DNA連接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 二、將互補(bǔ)的DNA引物與通用的DNA序列配對(duì)，并且引物上設(shè)有3’-0H官能團(tuán)進(jìn)行DNA延長(zhǎng)的化學(xué)反應(yīng)； 三、通過(guò)DNA聚合酶的催化，把與待測(cè)序的DNA鏈堿基互補(bǔ)的熒光修飾核酸分子加入到引物鏈上，其中，三種核酸分子具有突光，一種沒(méi)有突光； 四、通過(guò)成像系統(tǒng)，讀出每段DNA上帶有的不同熒光信號(hào)，使用三種波長(zhǎng)的激光分別先后照射樣品，每種激光會(huì)激發(fā)相應(yīng)的熒光基團(tuán)，并且產(chǎn)生相應(yīng)的熒光，通過(guò)濾波片后可以收集到該熒光信號(hào)，玻璃表面的每一點(diǎn)產(chǎn)生的信號(hào)都會(huì)被記錄； 五、化學(xué)切除保護(hù)基團(tuán)，3’-OH上的終止基團(tuán)，以及熒光分子和堿基之間的連接分子； 六、進(jìn)行下一輪的測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟二中每條DNA鏈上每次只能加入一個(gè)核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟二中，在測(cè)序的玻片中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶，緩沖溶液，Mn2+在引物處進(jìn)行擴(kuò)增，緩沖溶液100mmol/LTris-HCl pH = 7.8, 20mmol/LMnCl2, 2mmol/L 四種突光標(biāo)記的 dNTP, I 單位的 DNA聚合酶Thermosequenase,在恒溫60°C,避光條件下反應(yīng)30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟X中，停止反應(yīng)，用去離子水多次沖洗除去玻片表面的反應(yīng)溶液。然后用lOOmmol/L Tris-HCl (pH = 7.8)緩沖溶液沖洗玻片表面。再用去離子水多次沖洗。最后用氮?dú)獯蹈刹Ｆ砻妗?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟四中，運(yùn)行激光激發(fā)玻片程序，四種激光依次打開(kāi)，每次一束激光通過(guò)預(yù)設(shè)光路進(jìn)入物鏡，并且聚焦到玻璃片表面，一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟五中，使用飽和K2CO3水溶液與玻璃表面的DNA分子反應(yīng)，完全切割熒光基團(tuán)，恢復(fù)堿基的原本結(jié)構(gòu)不帶任何其他修飾，以及切除3’ -OH的保護(hù)基團(tuán)，恢復(fù)羥基結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟X中，熒光修飾的核酸分子分子結(jié)構(gòu):
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟X中，熒光修飾的核酸分子分子結(jié)構(gòu):
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602719SQ201310115492
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月7日
【發(fā)明者】伍建 申請(qǐng)人:北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司