基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)多基因遺傳性腸癌檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及高發(fā)遺傳性腸癌易感基因無創(chuàng)檢測(cè)的試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，相比于70年代中期增加了 83. 1%。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國平均的患癌率為286/10萬人，死亡數(shù)達(dá)到181/10萬人，這就 意味著我國每年新發(fā)的癌癥病例達(dá)235萬人，每分鐘就有6個(gè)人被診斷為癌癥。研宄表明， 癌癥的形成與外界環(huán)境、生活習(xí)慣以及自身遺傳等多個(gè)因素有關(guān)，其中遺傳因素約占到癌 癥發(fā)病人群的10%左右。遺傳性的癌癥主要分為兩類，一種是將癌癥遺傳給下一代，常見 的有腎母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，它們都屬遺傳性疾病，由異常的基因決定，80%~90% 帶有這些異常基因的后代將患這類癌癥；另一種是將患癌的風(fēng)險(xiǎn)遺傳給下一代，對(duì)于這種 情況，子女?dāng)y帶的突變基因意味患某種腫瘤風(fēng)險(xiǎn)和可能性相比于不攜帶突變基因的正常人 大大增加。腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，腸癌的發(fā)病率男女均處 于惡性腫瘤的第3位，其中在西方發(fā)達(dá)國家，腸癌的發(fā)病率處于第2位。根據(jù)國際癌癥研 宄組織（IARC) 2005年提供的數(shù)據(jù)顯示，在一些相對(duì)發(fā)達(dá)的西亞國家，腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)快 速增長(zhǎng)趨勢(shì)，其腸癌的發(fā)病率與西方國家非常接近。在日本男性腸癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為 49. 3/10萬，韓國為24. 7/10萬，新加坡為35. 1/10萬，而在北美和西歐則分別為44. 4/10萬 和42. 9/10萬。在我國，隨著生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣的改變，腸癌的發(fā)病率呈上升 態(tài)勢(shì)，排在惡性腫瘤和致死因素的第4位，并且中國的結(jié)直腸癌每年發(fā)病遞增速度為世界 平均數(shù)的兩倍。我國腸癌的高發(fā)區(qū)主要是長(zhǎng)江三角洲地區(qū)、珠江三角洲地區(qū)以及港澳臺(tái)地 區(qū)，蘇浙滬三地是最高發(fā)區(qū)。在發(fā)病年齡上，我國腸癌的平均發(fā)病年齡逐漸增大，已從20世 紀(jì)60年代的48歲上升到90年代的55歲，這可能與中國社會(huì)的人口老齡化有關(guān)。已發(fā)現(xiàn) 達(dá)到50歲者，其罹患腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，并且每增長(zhǎng)10歲其風(fēng)險(xiǎn)增加1倍。然而，青年 患者中惡性程度較高的黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌的比例顯著高于老年患者。
[0003] 結(jié)腸癌的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果，是由結(jié)腸粘膜的病變（非 典型增長(zhǎng)腺瘤等）演變而來。研宄表明，結(jié)腸癌的形成可能需要10年的時(shí)間，僅從內(nèi)鏡下可 辨認(rèn)的腺瘤發(fā)展成侵襲性癌就需要5年左右的時(shí)間。早期結(jié)腸癌可無癥狀，但早期的結(jié)腸 癌是可以治愈的，而進(jìn)展期的結(jié)腸癌則預(yù)后較差，術(shù)后5年生存率僅60%左右。結(jié)腸癌的早 期診斷已不再是僅僅發(fā)現(xiàn)體積較小的癌腫，而是可以診斷剛形成或發(fā)生癌變的結(jié)腸癌。及 時(shí)發(fā)現(xiàn)可治愈的癌前病變或早期癌具有相當(dāng)重要的臨床意義。
[0004] 目前，基因診斷技術(shù)的發(fā)展為大腸癌早期診斷提供了可能性。分子生物學(xué)研宄顯 示：大腸癌的發(fā)生涉及多種癌基因的激活及抑癌基因的失活，在腫瘤克隆形成過程中，基因 改變?cè)缬谛螒B(tài)改變，對(duì)這些基因及其產(chǎn)物進(jìn)行檢查，將有助于早期診斷。在人群普查開展得 比較好的國家，結(jié)直腸癌死亡率相對(duì)較低，例如英國、丹麥、瑞典等國家。提高早期診斷率是 提高結(jié)直腸癌患者存活率的關(guān)鍵。此外高危人群應(yīng)視為結(jié)直腸癌篩查的重點(diǎn)人群，但自然 人群普查是發(fā)現(xiàn)早期結(jié)直腸癌的最有效的方法之一，既可以提高患者的長(zhǎng)期生存率，又可 以降低發(fā)病率。
[0005] 研宄表明大腸癌是一種遺傳傾向比較明顯的惡性腫瘤，其發(fā)病既受遺傳因素的影 響又受環(huán)境因素的控制。遺傳性非息肉病性大腸癌（HNPCC)主要與遺傳因素有關(guān)，呈常染 色體顯性遺傳，外顯率高達(dá)70% -80%。它發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是一系列錯(cuò)配修復(fù)（MMR) 基因的種系突變所致，其中hMLHl和hMSH2在HNPCC的發(fā)病中起主要作用，占所有突變的 90%。該基因的表達(dá)產(chǎn)物錯(cuò)配修復(fù)蛋白是一種核酸水解酶，可以水解DNA復(fù)制過程中錯(cuò)配 的堿基對(duì)以及可能出現(xiàn)的小片段的堿基插入和缺失，從而保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確無誤，使人 類遺傳的穩(wěn)定性和保守性得以實(shí)現(xiàn)。此種基因一旦發(fā)生突變，錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)量就會(huì) 減少或缺失，結(jié)果使DNA復(fù)制過程中錯(cuò)配的堿基對(duì)增加，表現(xiàn)為DNA簡(jiǎn)單重復(fù)序列的擴(kuò)增或 缺失，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MSI可以說是MMR基因突變的表現(xiàn) 型，hMLHl和hMSH2的蛋白表達(dá)和MSI可以間接地反映MMR基因突變情況。我國每年有近 數(shù)十萬人被診斷出遺傳性癌癥，其中大多數(shù)人被診斷出時(shí)已經(jīng)是癌癥晚期，錯(cuò)過了最佳的 治療時(shí)間，因此，對(duì)遺傳性癌癥的早發(fā)現(xiàn)和早治療是提高腫瘤患者生存率的最重要的途徑， 其中早期診斷是關(guān)鍵，是提高腫瘤患者的治愈率，延長(zhǎng)生存期的首要環(huán)節(jié)。
[0006]目前，市場(chǎng)上對(duì)于遺傳性腫瘤的診斷方法多數(shù)停留在單個(gè)腫瘤單個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的 檢測(cè)水平，檢測(cè)方法多為熒光PCR、芯片法等方法，這些方法都存在不同的缺陷，例如操作 繁瑣、引物或探針設(shè)計(jì)復(fù)雜、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陽性和假陰性多，聯(lián)合基因數(shù)目較 少、通量低等問題，難以滿足目前檢測(cè)樣本數(shù)量大，檢測(cè)位點(diǎn)多、分布廣、檢測(cè)準(zhǔn)確性高等 檢測(cè)要求，因此急需一種新型的檢測(cè)手段以滿足市場(chǎng)和醫(yī)療的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種基于LifeTechnologies公司的IonTorrentPGM二代測(cè)序平 臺(tái)對(duì)國內(nèi)發(fā)病率較高的遺傳性腸癌的10個(gè)易感基因熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)無創(chuàng)檢測(cè)的試劑盒，該試 劑盒檢測(cè)通量高、靈敏度高、特異性強(qiáng)，一次檢測(cè)能夠覆蓋245個(gè)熱點(diǎn)SNP位點(diǎn)。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目標(biāo)，本發(fā)明的技術(shù)方案是基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)多基因遺傳 性腸癌檢測(cè)試劑盒，所述基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)多基因遺傳性腸癌檢測(cè)試劑盒包括SEQ N0 :1~SEQN0 :272 的引物；
[0009] 所述SEQN0 :1~SEQN0 :272的引物見表1。
[0010] 所述基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)多基因遺傳性腸癌檢測(cè)試劑盒包括：MasterMix llyl、包含所述SEQN0:1~SEQN0:272引物的引物panel5.5yl、待測(cè)DNA樣品4.5yl。
[0011] 所述SEQNO:1~SEQNO:272引物在引物panel的濃度均為100nM。
[0012] 優(yōu)選的，所述MasterMix組成為：PCRbuffer(5X) 4u1、MgCl2 1. 5u1、Taq酶 1. 5y1、ddH20 4yl〇
[0013] 優(yōu)選的，所述基于二代測(cè)序