專利名稱：寡聚酸生產(chǎn)菌的選育及其寡聚酸的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及寡聚酸的生產(chǎn)方法，特別是利用微生物生產(chǎn)寡聚酸的方法。
背景技術：
海藻酸是從褐藻類植物例如海帶中提取出來的多糖類碳水化合物。海藻酸分子是由 卩-D-l,4-甘露糖醛酸和a-L-l,4-古羅糖醛酸兩種單體組成的嵌段線性聚合物，分子量為106左 右。各種生物合成的海藻酸結構基本相似。但是組成海藻酸的兩種糖醛酸因生物不同而有差 異。在一個分子中,可能只含有其中一種糖醛酸構成的連續(xù)鏈段，也可能由兩種糖醛酸鏈節(jié)構成 嵌段共聚物。
近年來，海藻酸由于其廣泛的用途而被人們?nèi)找嬷匾暋Ｔ谑称饭I(yè)，海藻酸用于制作人 造水果、人造蛋、果凍等人造食品，還被用作食品增稠劑、飲料的防凍劑、防沉劑、校味劑 以及冰淇淋等，被人們稱之為奇妙的食品添加劑。在防病治病方面,海藻酸具有降低人體內(nèi)的 膽固醇含量、疏通血管、降低血液粘度、軟化血管等作用，被人們譽為保健長壽食品。在紡 織工業(yè)上,印染花布、上漿都需要大量使用到海藻酸，到目前為止，還沒有能代替海藻酸更好 的物質。在輕工業(yè)方面，利用海藻酸固定各種菌種和酶制劑，進行連續(xù)發(fā)酵、酶解、從而大 大提高生產(chǎn)率。另外，海藻酸還作為膠囊劑，以其安全、無副作用等優(yōu)勢用在制藥工業(yè)中。 在飼料工業(yè)上，海藻酸還被用作粘結劑、誘食劑。
在農(nóng)業(yè)上，海藻肥是以天然海藻為主要原料，經(jīng)過特殊生化工藝處理，提取海藻中的精 華物質而獲得的一種天然有機肥，它極大地保留了海藻中的天然活性組分，含有大量的非含 氮有機物和陸生植物無法比擬的鉀、鈣、鎂、鐵等四十余種的礦物元素和豐富的維生素，特 別含有海藻中所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不飽和脂肪酸和多種天然植物生長調(diào)節(jié)劑， 具有很高的生物活性，可刺激植物體內(nèi)非特異性活性因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的平衡。
由于海藻酸粘度高而影響生產(chǎn)效率是目前海藻酸在固體海藻肥生產(chǎn)存在的一大問題。寡 聚酸生物工程技術的開發(fā)不但可以解決海藻酸高粘度的問題，同時也解決海藻肥產(chǎn)品中含有 10-20%植物不可利用的海藻酸的非全營養(yǎng)問題。寡聚酸即寡聚海藻酸，以寡聚酸為基礎研制 的海藻生物肥是從馬尾藻中提取的，能夠調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長，增加產(chǎn)量和品質，減少病蟲害， 增強作物抗逆性的一類高效生物有機肥，是純天然的植物生長促進劑，對環(huán)境和作物本身沒
有任何副作用和污染。
公開文獻報道了一些褐藻酸酶的制備，主要是從一些微生物中經(jīng)過篩選，選擇那些能以 海藻酸鈉為原料，培養(yǎng)條件不復雜的，又可得到高活性褐藻酸酶的菌種。如《中國海洋大學 學報》2006年第2期公開了經(jīng)過篩選的埃氏交替單胞菌作為產(chǎn)生褐藻酸酶的菌種，以及培養(yǎng) 條件包括溫度、pH值、時間、最佳碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響，其酶活力一般可達0.18u/mL 左右?！逗Ｑ罂茖W》2006年第2期以別單胞菌屬作為產(chǎn)生褐藻酸酶的菌種，對其篩選出的兩 株菌株分別進行了褐藻酸鈉降解能力及胞外產(chǎn)物中褐藻酸酶特性的分析，所得到的褐藻酸酶 活力最高可達0.36u/mL。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物生產(chǎn)寡聚酸的方法，特別是能產(chǎn)生高活性褐藻酸酶 的海洋微生物以及利用該微生物和其產(chǎn)生的高活性褐藻酸酶對海藻酸鈉進行降解，使之得到 性能優(yōu)異的水溶性寡聚酸的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明人多年來一直從事海洋生物工程技術工藝的研究開發(fā)工作，專長于海藻多糖領域 的應用開發(fā)和測試分析技術研究。由于海藻酸粘度高而影響生產(chǎn)效率是目前固體海藻肥生產(chǎn) 存在的一大問題。寡聚酸生物工程技術的開發(fā)不但可以解決海藻酸高粘度的問題，同時也解 決海藻肥產(chǎn)品中含有10-20%植物不可利用的海藻酸的非全營養(yǎng)問題。
本發(fā)明人在廣西壯族自治區(qū)北海市山口紅樹林地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一株能在以海藻酸鈉為唯一碳 源的培養(yǎng)基中生長，并分泌出褐藻酸酶的優(yōu)良菌株。
經(jīng)過對上述篩選出來的優(yōu)良菌株在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其誘導物為海藻酸鈉，發(fā)現(xiàn)其分 泌出的褐藻酸酶具有較高的活性和十分穩(wěn)定的遺傳性，初步鑒定其屬短桿菌屬?？梢栽?°C 或常溫下保存。
本申請人目前已將該菌種送到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2007年10月 30日，保藏編號為CCTCCM 207168，建議的分類命名為短桿菌屬。
該菌的表面特征是革蘭氏陽性。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長，菌落的顏色為乳黃色。 本發(fā)明的褐藻酸降解菌的菌種培養(yǎng)以及寡聚酸的生產(chǎn)工藝如下
先將中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為CCTCCM 207168的褐藻酸降解菌擴大培養(yǎng)，再 用兩步法制備寡聚酸第一步使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型褐藻酸酶制劑；第二步使 用第一步產(chǎn)生的粗制液體型褐藻酸酶制劑對褐藻酸溶液進行降解，制備寡聚酸。
上述所說的褐藻酸降解菌的擴大培養(yǎng)是將篩選的菌種在介質中培養(yǎng)，培養(yǎng)的介質可以是 固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。所述的固體培養(yǎng)基為海藻酸鈉選擇培養(yǎng)基，其中各成分的重量百
分含量為海藻酸鈉0.5-2%，硫酸銨0.5-1%，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀0.05-0.1%，磷酸二 氫鈉或磷酸氫二鈉0.05-0.1%，硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣各0.01-0.1%;
所述的液體培養(yǎng)基各成分的重量百分含量為海藻酸鈉0.5-2%，尿素0.5-1%，磷酸二 氫鉀或磷酸氫二鉀0.05-0.1%，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉0.05-0.1%，硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯 化鈣各0.01-0.1%;或用海水做溶劑，加入海藻酸鈉0.5-2%，尿素或其它氮源0.5-1%，及鐵 鹽、鈣鹽各0.01-0.1%，調(diào)節(jié)pH值至6.0-8.0。
在擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為25-35°C，時間為1-3天。
從擴大培養(yǎng)得到的菌種少量留種保存于4'C的冰箱中，大部分可直接用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn) 褐藻酸酶制劑。工業(yè)化生產(chǎn)褐藻酸酶制劑的設備采用帶攪拌器和加熱裝置的發(fā)酵罐，生產(chǎn)過 程首先是配制誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，方法是在海藻酸鈉培養(yǎng)基的基礎上，再加入0.5-1 %蛋白 胨或其它氮源物質以及0.01-0.1%促酶釋放因子，然后加入擴大培養(yǎng)的菌種，加入菌種的量按 總海藻酸鈉總量的0.5-1 % ，調(diào)節(jié)pH6.0-8.0，最佳為6.5-7.0，溫度保持25-35°C ，發(fā)酵時間36-48 小時，發(fā)酵過程定時對物料進行分析， 一般當發(fā)酵液中出現(xiàn)芽孢時，發(fā)酵液中的褐藻酸酶活 力達到高峰時即可結束發(fā)酵。離心除渣除菌后的發(fā)酵液即為粗制液體型褐藻酸酶制劑。
將此粗酶液與2%-6%海藻酸鈉溶液按一定比例(如1:10-1:20V/V)混勻，在40。C-50。C， pH6.0-7.0條件下進行褐藻酸的酶解反應。由于底物海藻酸鈉的分子量不同，酶解反應終止的 時間不同， 一般不超過3-12小時，海藻酸鈉即己全部轉化為水溶性寡聚酸。利用不同的酶底 比和酶解反應時間，可獲得不同分子量分布范圍的寡聚酸產(chǎn)物。
酶解反應混合物進行50-70'C的高溫滅酶活，經(jīng)超濾、.納濾濃縮和純化，噴霧干燥得到寡 聚酸產(chǎn)品，此產(chǎn)品可用作制藥、農(nóng)藥、食品或輕工業(yè)原料等。
與目前所公開文獻的技術相比，本發(fā)明具有突出的實質性特點和進步是
1. 從灘涂紅樹林淤泥中獲得的菌種為短桿菌，可以采用一般的菌種培育方法，過程不復 雜。其遺傳性十分穩(wěn)定；傳代五年后產(chǎn)酶能力不下降，在室溫15-4(TC的條件下密封保存半年 以上不失活，產(chǎn)酶能力也不下降。
2. 用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的菌種，其產(chǎn)酶能力高，單位發(fā)酵液所含褐藻酸酶 活力高，并能抑制雜菌的生長，褐藻酸消耗少，培養(yǎng)條件容易控制，褐藻酸酶制劑活性高， 酶解反應十分溫和，短時間即可將褐藻酸轉化為寡聚酸，濃縮或干燥得到產(chǎn)品。
3. 產(chǎn)酶發(fā)酵及酶解反應的時間短， 一般40-48小時即可完成發(fā)酵及酶解的全過程，對工業(yè) 化生產(chǎn)很有利，表明可在短時間內(nèi)提高生產(chǎn)效率，菌種遺傳性穩(wěn)定，產(chǎn)酶率高，發(fā)酵及酶解 條件常規(guī)化、速度快，產(chǎn)品質量好，節(jié)約生產(chǎn)成本。
4.酶解反應條件溫和，易于控制反應條件以獲得不同分子量分布范圍的寡聚酸產(chǎn)物。
以下是
具體實施例方式
實施例一
1. 液體培養(yǎng)基擴大菌種。將保藏編號為CCTCC M 207168的短桿菌菌種從斜面培養(yǎng)基 接入液體海藻酸鈉選擇培養(yǎng)基中，海藻酸鈉0.5-2%，硫酸銨0.5-1%，磷酸二氧鉀或磷酸氫 二鉀0.05-0.1%，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉0.05-0.1%，硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣各0.01-0.1 %;或在其基礎上加入0.5-1%蛋白胨，調(diào)節(jié)pH值至6.0-8.0。在擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為 25-35°C，時間為1-3天。
2. 產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴大菌種培養(yǎng)液300mL加入600L發(fā)酵罐(罐內(nèi)由上述產(chǎn) 酶發(fā)酵培養(yǎng)基400L，促酶釋放因子0.01-0.1%，調(diào)節(jié)pH6.0-8.0，溫度25-35。C，發(fā)酵時間42 小時，此時發(fā)酵液中褐藻酸酶活性達到高峰，終止發(fā)酵，然后離心除渣除菌即得粗制液體型 褐藻酸酶制劑。
3. 酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。在5000L反應釜內(nèi)，將上述粗酶液與2-6%海藻酸鈉溶液銨1: 10體 積比混勻，40°C-50°C， pH6.0-7.0條件下反應6小時，升溫至60'C滅酶活，超濾濃縮10倍 后噴霧干燥得到粗制寡聚酸粉劑。
實施例二
1. 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種。配制由海藻酸鈉、尿素和無機鹽組成的培養(yǎng)基，其中各成分 的重量百分含量為海藻酸鈉0.5-2%，硫酸銨0.5-1%，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀0.05-0.1%， 磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉0.05-0.1%，硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣各0.01-0.1%。將菌種接入 此培養(yǎng)基上，25-3(TC培養(yǎng)3-5天，得到擴大菌種。
2. 產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴大菌種50公斤加到事先放有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上 述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400L，促酶釋放因子0.01-0.1%)的4噸發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)pH6.0-8.0，溫度 25-35°C，發(fā)酵時間42小時，此時發(fā)酵液中褐藻酸酶活性達到高峰，終止發(fā)酵，離心除渣除 菌即得粗制液體型褐藻酸酶制劑。
3. 酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實施例一的方法進行。
實施例三
1.液體培養(yǎng)基擴大菌種。將斜面菌種接入事先放有實施例一海藻酸鈉培養(yǎng)基的200L 種罐中，25-30'C通氣培養(yǎng)24小時，得到液體擴大菌種。
2. 產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴大菌種加到事先放有3噸產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上述 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400L，促酶釋放因子0.01-0.1 %)的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)pH6.0-8.0，溫度25-35°C， 發(fā)酵時間42小時，離心除渣除菌即得粗制液體型褐藻酸酶制劑。
3. 酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實施例一的方法進行。
實施例四
1. 固體培養(yǎng)基擴大菌種。將海藻酸鈉培養(yǎng)基在500mL的茹形瓶內(nèi)鋪成斜面，將菌種由 試管斜面接入茄形瓶斜面，25-30'C培養(yǎng)3-5天，得到擴大菌種。
2. 產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的一個茄形瓶的擴大菌種接入有400L誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基的0.6 噸發(fā)酵罐中，pH6.0-8.0，溫度25-35。C，發(fā)酵時間42小時后終止發(fā)酵。離心除渣除菌，經(jīng)硫 酸銨鹽析、透析除鹽后得到較為純化的液體型褐藻酸酶制劑。
3. 酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。將上述酶液與3%純化海藻酸鈉溶液混勻，40°C-50°C， pH6.0-7.0條 件下酶解4小時，調(diào)pH值至2.0終止反應。離心除渣，超濾除蛋白質及濃縮糖液，納濾除單 糖及無機鹽后，噴霧干燥或真空冷凍干燥制備純凈的寡聚酸固體制劑。
應用實例
1. 將上述制得的寡聚酸作為植物生長調(diào)節(jié)劑的主要成分，可明顯促進植物的生長。 不同濃度的OAS浸種處理對番茄種子的發(fā)芽有促進作用，處理后番茄種子的發(fā)芽勢高，
發(fā)芽比較整齊；經(jīng)10卯mOAS處理的種子的發(fā)芽勢可比對照提高11.34%。
OAS對豌豆幼苗的生長有促進作用，具體表現(xiàn)在葉片數(shù)增多、株高增加、根增長、株重 和根重增加；與對照組相比，葉片數(shù)可增多7.87%、株高增加23.62%、根長增加33.74%、 株重增加29.13%、根重增加47.62%;根系活力和光合色素含量也明顯提高。
2. 將上述制得的寡聚酸作為生防農(nóng)藥的主要成分，可減少病蟲害，增強作物抗逆性。 在低溫和冷害條件下寡聚酸能將番茄種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活性指數(shù)分別提高12.36
%、 9.85%、 23.78%,降低低溫脅迫對細胞膜的傷害，提高萌發(fā)種子的活性，增強作物抗逆 性。
權利要求
1.一種寡聚酸生產(chǎn)菌，其特征在于它屬于短桿菌屬，是將從自然界提取分離得到的菌株，用海藻酸鈉選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，在4℃或常溫下保存，菌種的送保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏日為2007年10月30日，保藏號為CCTCC M 207168。
2. —種如權利要求1所述寡聚酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)寡聚酸的方法，其特征在于先將中國典型 培養(yǎng)物保藏中心保藏號為CCTCCM 207168的褐藻酸降解菌擴大培養(yǎng)，再用兩步法制備寡聚 酸第一步使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型褐藻酸酶制劑；第二步使用第一步產(chǎn)生的粗制液體型褐藻酸酶制劑對海藻酸鈉溶液進行降解，制備寡聚酸。
3. 根據(jù)權利要求2所述的寡聚酸的生產(chǎn)方法，其特征在于褐藻酸降解菌的擴大菌種方法是將采集得到的菌種加入到固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基種，溫度為25-35'C，時間為l-3天， 得到擴大菌種；所述的固體培養(yǎng)基為海藻酸鈉選擇培養(yǎng)基，其中各成分的重量百分含量為海藻酸鈉0.5-2%,硫酸銨0.5-1%，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀0.05-0.1%，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉 0.05-0.1%,硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣各0.01-0.1%;所述的液體培養(yǎng)基各成分的重量百分含量為海藻酸鈉0.5-2%，尿素0.5-1%，磷酸二 氫鉀或磷酸氫二鉀0.05-0.1%，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉0.05-0.1%，硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯 化鈣各0.01-0.1%;或用海水做溶劑，加入海藻酸鈉0.5-2%，尿素或其它氮源0.5-1%，及鐵 鹽、鈣鹽各0.01-0.1%，調(diào)節(jié)pH值至6.0-8.0。
4. 根據(jù)權利要求2所述的寡聚酸的生產(chǎn)方法，其特征在于使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗 制液體型褐藻酸酶制劑的過程是將擴大培養(yǎng)得到的菌種放到事先加有誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的 發(fā)酵罐中，在pH6.0-8.0，溫度25-35"的條件下發(fā)酵36-48小時，得到的發(fā)酵液經(jīng)離心除渣 除菌后得到的粗制液體型褐藻酸酶制劑；所述的誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基包括海藻酸鈉選擇培養(yǎng)基并添加0.5-1 %蛋白胨或其它氮源物質以 及0.01-0.1%促酶釋放因子。
5. 根據(jù)權利要求2所述的寡聚酸的生產(chǎn)方法，其特征在于粗制液體型褐藻酸酶制劑對 海藻酸鈉溶液進行降解，制備寡聚酸的過程是按粗酶液與2%-6%海藻酸鈉溶液的體積比 1:10-1:20，混勻，在4(TC-50。C， pH6.0-7.0條件下進行海藻酸鈉的酶解反應。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物培養(yǎng)得到褐藻酸酶和生產(chǎn)寡聚酸(或稱寡聚海藻酸)的方法，所述的微生物短桿菌是從灘涂紅樹林淤泥中分離獲得，獲得菌種后誘導產(chǎn)酶發(fā)酵的方法是加入適量的海藻酸鈉和氮源、無機鹽的溶液中，在常溫下培養(yǎng)36-48小時即可得到具有高活性的褐藻酸酶制劑，酶解產(chǎn)糖的方法是將酶液與海藻酸鈉溶液按一定比例混勻，在十分溫和的條件下進行酶解反應，短時間即可將海藻酸鈉轉化為寡聚酸，濃縮或干燥得到產(chǎn)品。該方法的菌種遺傳性穩(wěn)定，產(chǎn)酶率高，發(fā)酵及酶解條件常規(guī)化、速度快，產(chǎn)品質量好。
文檔編號C12N1/20GK101186892SQ20071005057
公開日2008年5月28日 申請日期2007年11月16日 優(yōu)先權日2007年11月16日
發(fā)明者劉衛(wèi)萍, 婕 盧, 偉 周, 王士奎, 邱雪群, 陳書勤 申請人:北海國發(fā)海洋生物農(nóng)藥有限公司