一種重組質(zhì)粒pET28a-hACE2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組質(zhì)粒pET28a-hACE2，包含載體片段pET28a和基因片段hACE2，所述載體片段pET28a來自質(zhì)粒pET28a，所述基因片段hACE2來自人的Caco-2細(xì)胞。本發(fā)明還公開了一種重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)。本發(fā)明還公開了上述重組質(zhì)粒和重組菌株的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli克隆和表達(dá)截短的rhACE2，為ACE2的生物活性研究和生產(chǎn)提供基礎(chǔ)，且目前ACE2主要以動(dòng)物平滑肌細(xì)胞為載體進(jìn)行表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli克隆和表達(dá)比以往細(xì)胞表達(dá)的生產(chǎn)條件要求有所降低，生產(chǎn)效率和產(chǎn)量有明顯提高。
【專利說明】—種重組質(zhì)粒pET28a-hACE2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人截短的人ACE2基因表達(dá)方法，它具有抑制血管平滑肌增殖、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)心臟功能等作用。
【背景技術(shù)】
[0002]腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin angiotensin system, RAS)在機(jī)體中發(fā)揮有重要的生物學(xué)作用，它可以通過對(duì)心血管、腎臟的調(diào)節(jié)而維持血壓、體液和電解質(zhì)的平衡。血管緊張素II (angiotensinll, AngII)在RAS系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的病理生理學(xué)作用，八肽的AngII是由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)將十肽的AngI水解2個(gè)羧基而產(chǎn)生。2000年Tipnis等發(fā)現(xiàn)了在RAS系統(tǒng)中發(fā)揮有重要生物學(xué)作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)，ACE2與ACE的不同在于它是一種單羧基肽酶，可以水解AngII生成Ang (l-7)，Ang(l-7)具有其高度親和力的Mas受體，Ang(1_7)與ACE2和Mas受體共同構(gòu)成ACE2-Ang (l-7)-Mas軸，成為RAS系統(tǒng)里的另一重要的生物學(xué)作用途徑，其中多項(xiàng)研究表明該途徑可以對(duì)抗ACE-AngI1-ATIR生物學(xué)軸所介導(dǎo)的多種心血管病理生理作用，如降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)心臟功能等作用。
[0003]血管平滑肌細(xì)胞的增殖是高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究提示ACE2的過表達(dá)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎以及抗細(xì)胞增殖等心血管保護(hù)作用。ACE2的過表達(dá)可以通過下調(diào)ATlR和ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，提示ACE2具有血管保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種重組質(zhì)粒pET28a_hACE2。
[0005]本發(fā)明的的第二個(gè)目的是提供了一種重組菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了制備重組質(zhì)粒pET28a_hACE2的方法。
[0007]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了重組菌株pET28a_hACE2/BL21(DE3)的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供了重組質(zhì)粒pET28a_hACE2在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明第六個(gè)目的是提供了重組菌株pET28a_hACE2/BL21 (DE3)在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
[0010]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種重組質(zhì)粒pET28a-hACE2，包含載體片段pET28a和基因片段hACE2，所述載體片段pET28a來自質(zhì)粒pET28a，所述基因片段hACE2來自人的Caco_2細(xì)胞。
[0011]一種重組菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，包括上述的重組質(zhì)粒。
[0012]制備上述的重組質(zhì)粒pET28a_hACE2的方法，包括以下步驟:
[0013] I)引物設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)ncbi報(bào)道的hACE2mRNA序列用DNAstar軟件設(shè)計(jì)針對(duì)hACE2胞外區(qū)的上下游引物；[0014]2)總RNA的提取:收集足量的Caco-2細(xì)胞，提取總RNA ；
[0015]3 )采用 RT-PCR 擴(kuò)增 hACE2 基因；
[0016]4)將hACE2基因與pET28a質(zhì)粒片段連接得到重組質(zhì)粒pET28a_hACE2。
[0017]上述的重組菌株pET28a_hACE2/BL21 (DE3)的制備方法，包括所述的步驟I)~4)，另外還包括步驟5)，將步驟4)中連接得到的pET28a-hACE2克隆到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到重組菌株 pET28a-hACE2/BL21 (DE3)。
[0018]上述的重組質(zhì)粒pET28a_hACE2在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
[0019]上述的重組菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
[0020]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli克隆和表達(dá)截短的rhACE2，為ACE2的生物活性研究和生產(chǎn)提供基礎(chǔ)，且目前ACE2主要以動(dòng)物平滑肌細(xì)胞為載體進(jìn)行表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli克隆和表達(dá)比以往細(xì)胞表達(dá)的生產(chǎn)條件要求有所降低，生產(chǎn)效率和產(chǎn)量有明顯提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1從Coca-2細(xì)胞中提取總RNA核酸電泳圖；泳道1:為從Caco_2細(xì)胞中提取的總 RNA ;泳道 2:為 DNA Marker ；
[0022]圖2PCR擴(kuò)增hACE2片段核酸電泳圖；泳道1:1024bp的片段；泳道2:1217bp的片段；泳道 3: DNA Marker
[0023]圖3 (A)重疊PCR擴(kuò)增截短的hACE2基因；泳道1:重疊PCR擴(kuò)增的截短hACE2基因，泳道 2: DNA marker ；
[0024]圖3 (B) pET28a、hACE2 基因雙酶切片段；泳道 1:DNA marker,泳道 2:pET28a 質(zhì)粒Nco I/Xho I雙酶切片段，泳道3:hACE2基因Nco I/Xho I雙酶切產(chǎn)物；
[0025]圖4 (A)和圖4 (B)為菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒；圖4 (A)第一對(duì)引物的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道I和2:為截短的hACE2目的基因片段；泳道3:DNA Marker
[0026]圖4 (B)第二對(duì)引物的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道I和2:—段hACE2基因片段大小為 1000bp 左右，泳道 3:DNA Marker
[0027]圖5Nco I/Xho I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET28a_hACE2 ;泳道1_3為從三個(gè)不同的克隆菌落中提取質(zhì)粒用Nco I/Xho I雙酶切后的電泳圖；泳道4:DNA Marker ；
[0028]圖6截短的hACE2重組蛋白SDS-PAGE鑒定；泳道I和2為陰性對(duì)照，為誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后 pET28a/BL21 (DE3)，泳道 3、5 和 7pET28a_hACE2/BL21 (DE3)誘導(dǎo)前樣品，泳道 4、6 和8為ImM IPTG誘導(dǎo)4h pET28a_hACE2/BL21 (DE3)后的樣品(箭頭所示為重組hACE2蛋白條帶)；
[0029]圖7Western blot檢測(cè)截短的rhACE2蛋白。泳道I為誘導(dǎo)前陰性對(duì)照，泳道2、3為 ImM IPTG 誘導(dǎo) 4h 后的 rhACE2。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。[0031]實(shí)施例1
[0032]1、引物設(shè)計(jì)和合成
[0033]根據(jù)ncbi報(bào)道的人hACE2mRNA序列，序列號(hào)為AY623811。用DNAstar軟件設(shè)計(jì)針對(duì)hACE2胞外區(qū)的上下游引物，在hACE2基因N-端和C-端分別引入Nco I和Xho I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。本研究采用重疊PCR擴(kuò)增hACE2基因。首先分別擴(kuò)增hACE2的兩個(gè)基因片段，正向引物 Al:5’ -C ATG CCA TGG ATG TCA AGC TCT TCC TGG CTC-3’，反向引物 A2:5’ -TCC CCA ACA GCT TCA TGG AAT C-3’(擴(kuò)增片段為 1217bp);正向引物 BI:5，-CCA TGA AGC TGT TGG GGA AAT C-3，，反向引物B2:5，_CCG CTC GAG CTA GGA AAC AGGGGG CTG G-3’(擴(kuò)增片段為1024bp)。所用引物由上海生物工程公司合成。
[0034]2、總RNA的提取
[0035]收集足量的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Caco-2細(xì)胞,根據(jù)Invitogen Trizol試劑說明書提取細(xì)胞的總RNAjPA ImL Trizol試劑，反復(fù)吹打。待細(xì)胞徹底消化后，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中,加入200 μ L氯仿,反復(fù)顛倒數(shù)次,室溫放置3min ；4°C 12000g離心15min ;上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，加入500 μ L異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ；4°C 12000g離心10min ;吸去上清，加 入lmL75%乙醇，震蕩混勻；4°C 7500g離心5min ;棄上清，帶殘留的乙醇揮發(fā)完全后，加入100 μ L1%DEPC水溶解總RNA。用核酸電泳法和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其A26(l/A28(l的比值，以考察提取的總RNA的完整性和純度。提取的總RNA的經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示明亮的3條RNA條帶，即5S、18S、28S (如圖1所示)。其核酸紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280的比值〈2.0。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)提取總RNA完整性較好，且純度較高。
[0036]3、RT-PCR以及PCR擴(kuò)增目的基因
[0037]根據(jù)Tiangen生化RT-PCR試劑盒使用說明，取I μ g提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用設(shè)計(jì)的特異性引物在最佳擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄條件如下:第一輪分別以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，PCR條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72°C補(bǔ)平lOmin。第二輪PCR以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物互為模板和引物進(jìn)行重疊PCR，PCR條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72°C補(bǔ)平lOmin。擴(kuò)增得到的兩條hACE2片段均為一條明亮的DNA條帶，大小分別在1200bp和1000bp左右(如圖2所示)。
[0038]將上述擴(kuò)增的目的條帶凝膠回收后，互為引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果在2200bp處顯示一條明亮的基因條帶(如圖3A)。將擴(kuò)增后的hACE2目的條帶，進(jìn)行凝膠回收后，用Nco I和Xho I對(duì)該目的基因和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果如圖3B所示。用凝膠回收試劑盒回收后，通過T4DNA連接酶4°C條件下將目的基因和載體pET28a的雙酶切產(chǎn)物連接過夜，同時(shí)分別做兩種基因片段(目的基因和pET28a的雙酶切產(chǎn)物)的自連對(duì)照。將3種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)化完整pET28a質(zhì)粒做陽性對(duì)照。將轉(zhuǎn)化子涂布到帶有Kana抗性的LB平板上，同時(shí)涂布空白E.coli DH5a感受態(tài)做陰性對(duì)照，將5類平板放37°C培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:涂布空白E.coli DH5a感受態(tài)、兩種基基因片段自連的平板上均未見有菌落長(zhǎng)出，而在涂布帶有pET28a-hACE2重組子和完整pET28a質(zhì)粒的E.coli DH5a平板上分別長(zhǎng)出許多的菌落，但前者的菌落數(shù)量明顯少于后者。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí):hACE2克隆成功。
[0039]4、pET28a_hACE2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[0040]對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的基因PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切目的基因hACE2片段和pET28a質(zhì)粒載體，酶切4h后，凝膠回收目的片段。用T4DNA連接酶連接hACE2和pET28a質(zhì)粒片段，16°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，加入500 μ L不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)45min-lh。取200 μ L涂布LB/Kana+平板。待平板上長(zhǎng)出菌落，隨機(jī)挑取上述重組克隆的菌落，接種到無菌100 μ g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，對(duì)長(zhǎng)出的克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，以及提取質(zhì)粒進(jìn)行Nco I/Xhol雙酶切鑒定。
[0041]通過A1/B2和B1/B2兩對(duì)不同的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果分別在2200bp和1000bp處顯示一條明亮的目的條帶(如圖4所示)。
[0042]用Tiangen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,將提取的質(zhì)粒進(jìn)行BamH I/Xho I雙酶切鑒定，顯示兩條明亮的條帶。這兩種方法均進(jìn)一步證實(shí)hACE2基因克隆成功。(如圖5所示)
[0043]為了確定克隆的hACE2基因是否完全正確，隨機(jī)選取一個(gè)克隆對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與ncbi報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致，顯示堿基沒有發(fā)生突變。證明該重組質(zhì)粒pET28a-hACE2克隆成功。
[0044]5、rhACE2 蛋白的表達(dá)以及 SDS-PAGE 和 Western blot 鑒定
[0045]將經(jīng)鑒定完全正確的重組質(zhì)粒pET28a_hACE2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中得到重組菌種 pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，將重組菌株 pET28a_hACE2/BL21 (DE3)接種到2mL含有100 μ g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)液中。37 °C培養(yǎng)過夜。按照1:5的比例將其接種到20mL LB/Lana+培養(yǎng)液中。37°C搖床培養(yǎng)2h后，測(cè)OD6tltl,達(dá)到0.3-0.4左右時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后4h分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定重組hACE2表達(dá)情況。pET28a_hACE2/BL21 (DE3)在85KD位置處出現(xiàn)目的條帶，而pET28/BL21(DE3)和空白BL21(DE3)均未見有目的條帶出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:rhACE2蛋白重組表達(dá) 成功。
[0046]為了進(jìn)一步確定截短的rhACE2蛋白，利用Western blot鑒定是否正確。結(jié)果顯示，在pET28a-hACE2/BL21 (DE3)泳道的目的位置出現(xiàn)目的條帶，對(duì)照樣品均未見有條帶出現(xiàn)。(如圖7所示)
【權(quán)利要求】
1.一種重組質(zhì)粒pET28a-hACE2，其特征在于，包含載體片段pET28a和基因片段hACE2，所述載體片段pET28a來自質(zhì)粒pET28a，所述基因片段hACE2來自人的Caco_2細(xì)胞。
2.—種重組菌株pET28a-hACE2/BL21 (DE3)，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒。
3.制備權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET28a-hACE2的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)引物設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)ncbi報(bào)道的hACE2mRNA序列用DNAstar軟件設(shè)計(jì)針對(duì)hACE2胞外區(qū)的上下游引物； 2)總RNA的提取:收集足量的Caco-2細(xì)胞，提取總RNA； 3)采用RT-PCR擴(kuò)增hACE2基因； 4)將hACE2基因與pET28a質(zhì)粒片段連接得到重組質(zhì)粒pET28a_hACE2。
4.權(quán)利要求2所述的重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)的制備方法，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述的步驟I)~4)，另外還包括步驟5)將步驟4)中連接得到的pET28a-hACE2 克隆到大腸桿菌 BL21 (DE3)中，得到重組菌株 pET28a_hACE2/BL21 (DE3)。
5.權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET28a-hACE2在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)在表達(dá)人截短的rhACE2蛋白方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103898148SQ201410075374
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】牛佳, 陸豪杰, 方月琴, 賈紅圣, 顧準(zhǔn) 申請(qǐng)人:健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院