一種弓形蟲(chóng)tox檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化鉀20～300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明核酸釋放方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提??；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)TOX的靈敏度可達(dá)400copies/ml，定量線性范圍為400～4.00E+09copies/ml；應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)血液和羊水等未知樣本中的TOX-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為優(yōu)生優(yōu)育及TOX感染的早期診斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說(shuō)明】—種弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的TOX-DNA檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii Nicolle & Manceaux, 1908)是貓科動(dòng)物的腸道球蟲(chóng)，由法國(guó)學(xué)者Nicolle及Manceaux在剛地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii)的脾臟單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲(chóng)，簡(jiǎn)稱弓形蟲(chóng)。
[0003]弓形蟲(chóng)是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，球蟲(chóng)亞綱，真球蟲(chóng)目，等孢子球蟲(chóng)科、弓形體屬。該蟲(chóng)呈世界性分布，人和許多動(dòng)物都能感染，可寄生在除紅細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞中，隨血液流動(dòng),到達(dá)全身各部位,損傷大腦、心臟、眼底,致使機(jī)體免疫力下降,患各種疾病。人體感染后多處于隱性感染狀態(tài)，只有當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，蟲(chóng)體被激活并迅速增殖，致病力增強(qiáng)。感染弓形蟲(chóng)的初孕婦女，可經(jīng)胎盤(pán)血流將弓形蟲(chóng)傳播給胎兒。在孕前3個(gè)月內(nèi)感染，可造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎或死胎，畸胎發(fā)生率高，如無(wú)腦兒、小頭畸形、小眼畸形、脊柱裂等。受染胎兒或嬰兒多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，有的出生后數(shù)月甚至數(shù)年才出現(xiàn)癥狀。據(jù)研究表明，嬰兒出生時(shí)出現(xiàn)癥狀或發(fā)生畸形者病死率為12%，而存活者中90%有精神發(fā)育障礙，典型臨床表現(xiàn)為腦積水、大腦鈣化灶、腦膜腦炎和運(yùn)動(dòng)障礙；其次表現(xiàn)為弓形蟲(chóng)眼病，如視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎；此外，還可伴有發(fā)熱、皮疹、嘔吐、腹瀉、黃疸、肝脾腫大、貧血、心肌炎、癲癇等。由于TOX對(duì)人類(lèi)健康造成了很大的威脅，對(duì)這種疾病的臨床感染診斷的時(shí)效性、精確性的要求也越來(lái)越聞。
[0004]目前TOX感染常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有病原學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)三種診斷方法。病原學(xué)診斷方法在過(guò)去近一個(gè)世紀(jì)的弓形蟲(chóng)病診斷中曾起到非常重要的作用，但檢出率低，耗時(shí)，容易漏診，一般不能進(jìn)行生前診斷。免疫學(xué)診斷方法是目前進(jìn)行弓形蟲(chóng)感染調(diào)查、臨床弓形蟲(chóng)病確診的常用方法。一般采用直接凝集試驗(yàn)(DAT)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、改良凝集試驗(yàn)(MAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CT)、染色試驗(yàn)(DT)、間接熒光免疫試驗(yàn)(IFA)等十多種方法檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)抗體或循環(huán)抗原。其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是最常用的方法，本法可檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgM、IgA、IgG、IgE抗體及Cag抗原(循環(huán)抗原)，是檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的一種可重復(fù)的方法，易自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化且敏感性強(qiáng)。近年來(lái)，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。
[0005]運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0006]目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用直接煮沸法對(duì)血液以及羊水樣本中的弓形蟲(chóng)核酸進(jìn)行提取，具體是向經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣本中加入某種核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板；該方法核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)高濃度的樣本裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。
[0007]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基 團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008]目前國(guó)內(nèi)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TOX-DNA的科研試劑盒，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測(cè)靈敏度不高，約在500~lOOOcopies/ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇 0.05 ~1%。
[0010]在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該核酸檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。
[0011]本發(fā)明提供一種弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.01~0.5mM/L,氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。
[0012]使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)TOX的靈敏度可達(dá)400copies/ml,定量線性范圍為400~4.00E+09copies/ml。
[0013]具體的，用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -CCAGACGAGACGACGCTTT-3’;下游引物序列為 5’ -GCATCTGGATTCCTCTCCTACC-3’;探針序列為 5’ -CTCCACTCTTCAATTCTCTCCGCCAT-3’。本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測(cè)靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。
[0014]本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列為5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3 ’。本發(fā)明中所述內(nèi)標(biāo)為插入pUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，它作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。在所述試劑盒中包含內(nèi)標(biāo)的情況下，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；內(nèi)標(biāo)上游引物序列為5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，內(nèi)標(biāo)下游引物序列為5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，內(nèi)標(biāo)探針的序列為 5 ’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-3，。
[0015]優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。
[0016]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中還包括TOX定量參考品、TOX陽(yáng)性對(duì)照和TOX陰性對(duì)照。
[0017]本發(fā)明還提供一種TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物序列為5 ’ -CCAGACGAGACGACGCTTT-3 ’；下游引物序列為5’ -GCATCTGGATTCCTCTCCTACC-3’。
[0018]本發(fā)明又提供一種TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -CTCCACTCTTCAA TTCTCTCCGCCAT-3’。
[0019]本發(fā)明還具體提供一種TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、內(nèi)標(biāo)、酶混合液、TOX定量參考品、TOX陽(yáng)性對(duì)照和TOX陰性對(duì)照；且所述核酸釋放劑中包含莎梵婷(surfactin) 0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%，乙醇0.05~1%和溶劑TE緩沖液；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，用于內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，10XPCR反應(yīng)緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0020]本發(fā)明提供的TOX熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)血液、羊水等未知樣本中的TOX-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為優(yōu)生優(yōu)育及診斷弓形蟲(chóng)感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1中①為實(shí)施例中TOX-DNA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線，圖1中②為實(shí)施例中TOX-DNA檢測(cè)結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進(jìn)行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0023]實(shí)施例1
[0024]本實(shí)施例提供一種具體的弓形蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分:
[0025]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.1mM/L,氯化鉀100mM/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%, 0.1%的乙醇和溶劑TE緩沖液。
[0026]②內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照):為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為2.00E+04copies/ml, 100堿基對(duì)的序列為:5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。 [0027]③PCR反應(yīng)液:包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物均為0.3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針為0.3 μ mol/L,用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物均為0.3 μ mol/L，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為0.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于弓形蟲(chóng)核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為:上游引物:5’ -CCAGACGAGACGACGCTTT-3’ ；下游引物:5’ -GCATCTGGATTCCTCTCCTACC-3’ ；探針:5’ -CTCCACTCTTCAATTCTCTCCGCCAT-3’;所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為:上游引物:5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’ ；下游引物:5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’ ；探針:5’ -TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA - 3’。
[0028]④酶混合液:包含5U/ μ I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0029]⑤TOX定量參考品:來(lái)源于使用TOX企業(yè)定量線性參考品LI~L5定值后的TOX強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，該TOX定量參考品包括Α、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 4.00E+07copies/ml (Α)、4.00E+06copies/ml (Β)、4.00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0
[0030]⑥TOX陽(yáng)性對(duì)照:為臨床醫(yī)院收集的已滅活的TOX強(qiáng)陽(yáng)性羊水樣本，經(jīng)濃縮離心后,加入滅菌生理鹽水溶解沉淀，并經(jīng)合格的TOX試劑盒檢測(cè)并定值后，用滅菌生理鹽水稀釋至濃度為 4.00E+05copies/ml。
[0031]⑦TOX陰性對(duì)照:臨床醫(yī)院收集的已滅活的TOX陰性羊水樣本，用滅菌生理鹽水稀釋100倍后，經(jīng)合格的TOX試劑盒檢測(cè)為陰性。
[0032]實(shí)施例2
[0033]本實(shí)施例提供上述實(shí)施例1所述試劑盒用于檢測(cè)血液、羊水等未知樣本中TOX-DNA的操作步驟:
[0034]一、試劑準(zhǔn)備[0035]根據(jù)待測(cè)樣本、TOX陰性對(duì)照、TOX陽(yáng)性對(duì)照以及TOX定量參考品A~D的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及內(nèi)標(biāo)0.5 μ I/人份，充分混勻成PCR-mix，例如待測(cè)樣本為3人份時(shí)，一共需配制9人份(上述四者的人份數(shù)分別為3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬時(shí)離心后備用。
[0036]二、核酸提取
[0037]1.羊水樣本:取Iml樣本，12，OOOrpm離心5分鐘，棄上清后往沉淀中加入50 μ I核酸釋放劑，與沉淀震蕩或移液槍吸打混勻，作為待測(cè)樣本備用。
[0038]2.血液樣本:使用湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA抽提試劑盒處理(該試劑盒市面有售，并不使用本發(fā)明上述實(shí)施例1中所述的核酸釋放劑)，得到的DNA作為待測(cè)樣本。
[0039]3.TOX陰性對(duì)照、TOX陽(yáng)性對(duì)照、TOX定量參考品:TOX陰性對(duì)照、TOX陽(yáng)性對(duì)照、TOX定量參考品A~D分別取10 μ I與10 μ I核酸釋放劑混勻待用。
[0040]三、向PCR反應(yīng)管中加樣
[0041]每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入上述第二步驟中處理后的待測(cè)樣本、TOX陰性對(duì)照、TOX陽(yáng)性對(duì)照以及TOX定量參考品A~D各10 μ I ;靜置10分鐘后，每管加入步驟一中的PCR-mix40 μ 1，吸打混勻2_3次，去除氣泡后蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0042]四、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析(在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行)
[0043]I)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱及定量參考品濃度。
[0044]2)突光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測(cè)TOX ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter:VIC, Quencher:None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo);參比突光(PassiveReference)設(shè)置為 none。
[0045]3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1:
[0046]表1
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸釋放劑在弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05 ~1%。
2.一種弓形蟲(chóng)TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -CCAGACGAGACGACGCTTT-3’ ；用于靶多核苷酸的下游引物序列為5’ -GCATCTGGATTCCTCTCCTACC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探針序列為5’-CTCCACTCTTCAATTCTCTCCGCCAT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2~4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列為 5 ’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；且內(nèi)標(biāo)上游引物序列為5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，內(nèi)標(biāo)下游引物序列為5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，內(nèi)標(biāo)探針序列為 5 ’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求2~4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。
8.—種TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物序列為5 ’ -CCAGACGAGACGACGCTTT-3 ’；下游引物序列為5’ -GCATCTGGATTCCTCTCCTACC-3’。
9.一種TOX檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為 5’ -CTCCACTCTTCAATTCTCTCCGCCAT-3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103725788SQ201410017112
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】戴立忠, 艾穎娟, 李勃 申請(qǐng)人:湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司