專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的rt-lamp快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科植物上黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測(cè)技術(shù)及其在病害診斷上的應(yīng)用，具體涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus, CGMMV)屬番爺叢矮病毒科(Tombusviridae)、煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員。該病嚴(yán)重為害葫蘆科作物，為我國(guó)的檢疫性有害生物。黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期染病幼苗頂尖部的2 3片葉子現(xiàn)亮綠或暗綠色斑駁，葉片較平，產(chǎn)生暗綠色斑駁的病部隆起，新葉濃綠，后期葉脈透化，葉片變小，引起植株矮化，葉片斑駁扭曲，呈系統(tǒng)性傳染。瓜條染病現(xiàn)濃綠色花斑，有的也產(chǎn)生瘤狀物，致果實(shí)成為畸形瓜，影響商品價(jià)值，嚴(yán)重的減產(chǎn)25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜及瓠瓜等多種葫蘆科作物，通過(guò)種子和土壤傳播，此外也可通過(guò)汁液，農(nóng)事操作及葉片接觸等方式進(jìn)行傳播。帶毒種子傳播是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。該病自1935年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，曾先后在英國(guó)、德國(guó)、丹麥、荷蘭、俄羅斯、印度、日本、韓國(guó)以及我國(guó)臺(tái)灣發(fā)生并造成嚴(yán)重危害。黃瓜綠斑駁病毒病以前在我國(guó)大陸沒(méi)有發(fā)生記載，2006年國(guó)內(nèi)個(gè)別地方發(fā)現(xiàn)西瓜綠斑駁病毒病，2006年12月份中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布788號(hào)公告，將其列為全國(guó)植物檢疫性有害生物。目前在植物病毒鑒定識(shí)別上常采用的方法有:生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，血清學(xué)檢測(cè)，電鏡觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。由于傳統(tǒng)的植物病毒監(jiān)測(cè)方法，如電鏡觀察、傳統(tǒng)的生物學(xué)接種鑒定等這些方法很難分別出是否是黃瓜綠斑駁花葉病毒，因此需要一個(gè)快速準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)該病毒。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),是由Notomi等在2000年發(fā)明 的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，他是一種高靈敏度的鏈置換技術(shù)，一種新型的PCR替代技術(shù)。LAMP特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了 4個(gè)特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶一Bst DNA polymerase在恒溫的條件下反應(yīng)60min就可以完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)熒光染色后在紫外光下觀察可以清晰的觀察到反應(yīng)結(jié)果。不需要長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要昂貴的PCR儀，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過(guò)程。目前已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和動(dòng)植物各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等引起的疾病監(jiān)測(cè)和快速診斷。但是，目前尚沒(méi)有將RT-LAMP技術(shù)應(yīng)用在黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的檢測(cè)上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測(cè)的RT-LAMP引物組。本發(fā)明的另一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明又一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法。該方法用于快速檢測(cè)西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科上黃瓜綠斑駁花葉病毒，通過(guò)該方法可以快速診斷出疑似病株是否攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其在于所述的RT-LAMP引物組包含一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，所述外引物對(duì)F3、B3的序列分別為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，所述內(nèi)引物對(duì)FIP、BIP的序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示。上述的引物組在制備黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。一種含有上述的引物組的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其在于所述的試劑盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反應(yīng)液、DEPC水和熒光染料SYBR Green I檢測(cè)液組成的檢測(cè)體系。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL (pH8.0);采用植物病毒RNA快速提取液提取樣品粗提總RNA，將提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應(yīng)液中混合，建立擴(kuò)增體系；以反應(yīng)總體積IOyL為例，所述擴(kuò)增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA
0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補(bǔ)充DEPC水至10 μ L0`一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其在于使用上述的引物組對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，利用電泳檢測(cè)或熒光染料技術(shù)鑒定出待檢測(cè)樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，具體包括以下步驟:(I)提取樣品粗提總RNA ；(2)取步驟(I)提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應(yīng)液中混合，建立擴(kuò)增體系;(3)在63 64°C恒溫水浴中反應(yīng)6(T75min ；(4)結(jié)果診斷:取熒光染料檢測(cè)液SYBR Green I加入到步驟(3)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行診斷，在紫外光下觀察，呈陽(yáng)性即顯綠色的表示樣本中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒，呈陰性即保持染料橙色的表示樣本不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。步驟(I)所述樣本粗提總RNA的提取方法為:用剛采集的病葉在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，將研磨液加入到Tris-HCL (pH8.0)中制成樣品粗提總RNA提取液。
所述的病葉和0.5M NaOH溶液的質(zhì)量體積比g:mL為1:4 ;所述混合液和Tris-HCL(pH8.0)的體積比為I:49o步驟(2)中所述反應(yīng)總體積IOyL為例，擴(kuò)增體系中各組分的含量為:樣品粗提總 RNA 0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 BstDNA Polymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ，0.2 μ M 的 F3 和
0.2 μ M 的 B3,補(bǔ)充 DEPC 水至 10 μ L。
本發(fā)明所提供的快速檢測(cè)病株上黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，具體包括以下詳細(xì)步驟:I)根據(jù)NCBI已報(bào)道的黃瓜綠斑駁花葉病毒核苷酸序列，通過(guò)軟件DNAstar分析后找出該病核酸外殼蛋白基因保守區(qū)域序列作為模板參考序列使用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)弓I物；2)快速提取法提取植株樣品粗提總RNA ；3)設(shè)置不同Mg2+濃度、dNTP濃度、內(nèi)外引物濃度比例、Betaine濃度、確定最佳反應(yīng)體系；分別改變反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)條件。4)通過(guò)紫外光或肉眼判斷SYBR Green I染色對(duì)RT-LAMP產(chǎn)物進(jìn)行可視化處理。5)在最佳反應(yīng)參數(shù)條件下，與RT-PCR方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證RT-LAMP的靈敏度；6)以CMV和TMV為對(duì)照驗(yàn)證這一反應(yīng)的特異性；本發(fā)明提供的引物序列如下:
權(quán)利要求
1.一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物組包含一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，所述外引物對(duì)F3、B3的序列分別為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，所述內(nèi)引物對(duì)FIP、BIP的序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示。
2.權(quán)利要求1所述的引物組在制備黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的引物組的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反應(yīng)液、DEPC水和熒光染料SYBR Green I檢測(cè)液組成的檢測(cè)體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL (pH8.0);采用植物病毒RNA快速提取液提取樣品粗提總RNA，將提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應(yīng)液中混合，建立擴(kuò)增體系；以反應(yīng)總體積10 μ L為例，所述擴(kuò)增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補(bǔ)充DEPC水至10 μ L0
6.一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物組對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-L AMP擴(kuò)增，利用電泳檢測(cè)或熒光染料技術(shù)鑒定出待檢測(cè)樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)提取樣品粗提總RNA； (2)取步驟(I)提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應(yīng)液中混合，建立擴(kuò)增體系； (3)在63 64°C恒溫水浴中反應(yīng)6(T75min； (4)結(jié)果診斷:取熒光染料檢測(cè)液SYBRGreen I加入到步驟(3)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行診斷，在紫外光下觀察，呈陽(yáng)性即顯綠色的表示樣本中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒，呈陰性即保持染料橙色的表示樣本不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(I)所述樣本粗提總RNA的提取方法為:用剛采集的病葉在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，將研磨液加入到Tris-HCL (pH8.0)中制成樣品粗提總RNA提取液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的病葉和0.5M NaOH溶液的質(zhì)量體積比g:mL為1:4 ;所述混合液和Tris_HCL(pH8.0)的體積比為1:49。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中所述反應(yīng)總體積IOyL為例，擴(kuò)增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA·0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補(bǔ)充DEPC水至10 μ L0
全文摘要
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，其中該方法包括植物病毒總RNA的提取，RT-LAMP反應(yīng)和電泳檢測(cè)或熒光染料檢測(cè)，確定植物是否帶病。本發(fā)明根據(jù)CGMMV的外殼蛋白基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了RT-LAMP引物，采用RT-LAMP技術(shù)建立了一種快速、靈敏、高度特異性的檢測(cè)黃瓜、西瓜和葫蘆等葫蘆科植物植株上CGMMV的檢測(cè)技術(shù)及其在病害診斷上的應(yīng)用方法。本發(fā)明可以利用快速抽提RNA和常規(guī)RNA抽提作為RNA模板用于RT-LAMP實(shí)驗(yàn)。利用這一方法可以快速鑒定出黃瓜綠斑駁花葉病毒植株樣本，進(jìn)而采取針對(duì)性的檢疫性保護(hù)措施，減少病害帶來(lái)的損失。
文檔編號(hào)C12R1/94GK103146847SQ201310093869
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者陶小榮, 李靖玉, 衛(wèi)其巍, 張?chǎng)┠? 吳鑒艷 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)