專利名稱：一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法。
背景技術：
病毒病害造成農(nóng)作物的減產(chǎn)及品質(zhì)的嚴重下降。為了得到抗病農(nóng)作物，過去20年里育種學家通常采用把天然抗性基因轉(zhuǎn)入對病毒敏感作物的方法(Goldbach R，Bucher E，Prins M.Resistance mechanisms to plant virusesan overview.VirusRes 2003.92207-12)。同時，轉(zhuǎn)入外源抗病蛋白(Lodge JK，Kaniewski WK，TumerNE.Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweedantiviral protein.Proc Natl Acad Sci U S A 1993.907089-93；Watanabe Y，OgawaT，Takahashi H，Ishida I，Takeuchi Y，Yamamoto M，Okada Y.Resistance againstmultiple plant viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specificribonuclease.FEBS Lett 1995.372165-8；Boonrod K，Galetzka D，Nagy PD，Conrad U，Krczal G. Single-chain antibodies against a plant viralRNA-dependent RNA polymerase confer virus resistance.Nat Biotechnol 2004.22856-62)以及抑制寄主代謝酶途徑也得到廣泛應用(Masuta C，Tanaka H，UeharaK，Kuwata S，Koiwai A，Noma M.Broad resistance to plant viruses in transgenicplants conferred by antisense inhibition of a host gene essential inS-adenosylmethionine-dependent transmethylation reactions.Proc Natl AcadSci U S A 1995.926117-21)。如今，除了天然的抗性特征，利用基因操作獲得工程抗性已得到廣泛應用。例如，利用病原來源的抗性(PDR)已在幾個病毒株系中實現(xiàn)(Goldbach R，Bucher E，Prins M.Resistance mechanisms to plant virusesan overview.Virus Res 2003.92207-12；Abel PP，Nelson RS，De B，HoffmannN，Rogers SG，F(xiàn)raley RT，Beachy RN.Delay of disease development in transgenicplants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene.Science 1986.232738-43；Lindbo JA，Silva-Rosales L，Proebsting WM，Dougherty WG.Induction of a Highly Specific Antiviral State in Transgenic PlantsImplications for Regulation of Gene Expression and Virus Resistance.PlantCell 1993.51749-59)，該方法是在植物中引入病毒基因組的一部分序列或表達完整或修飾的病毒蛋白及RNA，以打亂病毒的復制周期。越來越多的證據(jù)表明其中一種PDR是病毒轉(zhuǎn)基因RNA沉默的結(jié)果。RNA沉默是導致真核生物序列特異的基因表達受抑的一種非常保守的現(xiàn)象。雙鏈RNA(dsRNA)作為沉默誘發(fā)因子被RNase III酶同源蛋白Dicer剪切成21-25 nt的siRNA。這些siRNA指導RNA誘導的沉默復合物(RISC，一種多聚蛋白復合物)，造成靶標RNA的降解或在DNA水平上發(fā)揮作用造成染色質(zhì)的修飾。
與動物一樣，RNA沉默在植物中作為一種防御病毒入侵的免疫反應發(fā)揮作用(Baulcombe D.RNA silencing.Trends Biochem Sci 2005.30290-3；Voinnet O.Induction and suppression of RNA silencinginsights from viral infections.Nat Rev Genet 2005.6206-20)。當植物受到病毒入侵時，就會激活病毒誘導的基因沉默(VIGS)途徑，該抗病途徑能特異識別并降解病毒RNA(Baulcombe D.RNAsilencing in plants. Nature 2004. 431356-63；Scholthof HB.TheTombusvirus-encoded P19from irrelevance to elegance.Nat Rev Microbiol 2006.4405-11)。在病毒入侵的植物體內(nèi)能檢測到病毒來源的siRNA(vsiRNA)的積累(Chellappan P，Vanitharani R，Pita J，F(xiàn)auquet CM.Short interfering RNAaccumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected hosts，andgene silencing targets specific viral sequences.J Virol 2004.787465-77；Molnar A，Csorba T，Lakatos L，Varallyay E，Lacomme C，BurgyanJ.Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly fromhighly structured single-stranded viral RNAs.J Virol 2005.797812-8)。研究表明，vsiRNA主要來源于病毒復制過程中的dsRNA雙鏈中間體以及高度結(jié)構化的病毒RNA單鏈(Molnar A，Csorba T，Lakatos L，Varallyay E，Lacomme C，BurgyanJ.Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly fromhighly structured single-stranded viral RNAs.J Virol2005.797812-8；Pantaleo V，Szittya G，Burgyan J.Molecular bases of viralRNA targeting by viral siRNA programmed RISC.J Virol 2007.813797-806)。
病毒基因組序列的同源基因轉(zhuǎn)入植物后誘發(fā)RNA沉默并賦予轉(zhuǎn)基因植物對該病毒高度特異的抗性(Lindbo JA，Silva-Rosales L，Proebsting WM，Dougherty WG.Induction of a Highly Specific Antiviral State in Transgenic PlantsImplications for Regulation of Gene Expression and Virus Resistance. PlantCell 1993.51749-59；Lindbo JA，Dougherty WG.Pathogen-derived resistanceto a potyvirusimmune and resistant phenotypes in transgenic tobaccoexpressing altered forms of a potyvirus coat protein nucleotide seauence.Mol Plant Microbe Interact 1992. 5144-53；Guo HS，Garcia JA.DelayedResistance to Plum Pox Potyvirus Mediated by a Mutated RNA Replicase GeneInvolvement of a Gene-Silencing Mechanism.Mol Plant Microbe Interact1997.10160-70)。對于轉(zhuǎn)基因沉默介導的抗性來說，有時病毒的侵染甚至是必要的，而且植物常表現(xiàn)出“恢復”表型。另外，在病毒侵染的野生型植物中也能看到這種恢復現(xiàn)象。這種恢復現(xiàn)象非常類似于病毒誘導的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的恢復抗性，即在未侵染的系統(tǒng)葉中病毒濃度顯著降低(Covey SN，Al-Kaff NS，Langara A，Turner DS.Plants combat infection by gene silencing.Nature 1997.385781-2；Ratcliff F，Harrison BD，Baulcombe DC.A Similarity Between ViralDefense and Gene Silencing in Plants.Science 1997.2761558-60)。
黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麥花葉病毒科，黃瓜花葉病毒屬的典型成員，寄主范圍廣泛，能侵染超過85科365種的1000多種植物，包括單子葉與雙子葉植物、草本、灌木與木本植物等(Palukaitis P，Roossinck MJ，Dietzgen RG，F(xiàn)rancki RI.Cucumber mosaic virus. Adv Virus Res 1992.41281-348)。CMV是典型的三組分正義單鏈RNA病毒之一，其基因組RNA包裹在獨立的病毒粒子中(Sugiyama M，Sato H，Karasawa A，Hase S，Takahashi H，EharaflY.2000.Characterization of symptom determinants in two mutants of cucumbermosaic virus Y strain，causing distinct mild green mosaic symptoms in tobacco.Physiol Mol Plant Pathol 5685-90)。根據(jù)衣殼蛋白(CP)的系統(tǒng)發(fā)展史估計與5’非翻譯區(qū)(5’UTR)的重組，CMV可被分為三個亞組，即亞組IA，IB和亞組II(Roossinck MJ，Zhang L，Hellwald KH.Rearrangements in the 5’nontranslatedregion and phylogenetic analyses of cucumber mosaic virus RNA 3 indicateradial evolution of three subgroups.J Virol 1999；736752-8)。RNA1和RNA2分別編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)的亞單位1a和2a(Hayes RJ，Buck KW.Complete replication of a eukaryotic virus RNA in vitro by a purifiedRNA-dependent RNA polymerase.Cell 1990；63363-8)。RNA3具有兩個開放閱讀框，編碼運動蛋白(MP)和CP蛋白。其中CP蛋白是由亞基因組RNA-RNA4轉(zhuǎn)譯的，該RNA由負鏈轉(zhuǎn)錄而來(Schwinghamer MW，Symons RH.Translation of the fourmajor RNA species of cucumber mosaic virus in plant and animal cell-freesystems and in toad oocytes.Virology 1977；7988-108)。而另一個亞基因組RNA-RNA4A編碼的是2b蛋白。CMV的3’UTR序列在不同基因組RNA之間以及不同株系與亞組RNA中都非常保守，而且其3’端都能夠形成非常穩(wěn)定的類似于tRNA的二級結(jié)構(TLS)(Rietveld K，Pleij CW，Bosch L.Three-dimensional models of thetRNA-like 3’termini of some plant viral RNAs.EMBO J 1983.21079-85；KwonCS，Chung WI.Differential roles of the 5’untranslated regions of cucumbermosaic virus RNAs 1，2，3 and 4 in translational competition.Virus Res 2000.66175-85)。已知該TLS區(qū)域包含有負鏈合成的啟動子，其首要功能包括在寄主因子參與下的與復制酶的互作(Fernandez-Cuartero B，Burgyan J，Aranda MA，Salanki K，Moriones E，Garcia-Arenal F.Increase in the relative fitness ofa plant virus RNA associated with its recombinant nature.Virology 1994；203373-7)。
申請?zhí)枮?1104076.5，發(fā)明名稱為“構建抗黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植物”的中國專利申請公開了將CMV外殼蛋白(CP)基因和CMV衛(wèi)星RNA基因同時引入植物表達來獲得抗病的轉(zhuǎn)化技術。利用CP基因獲得的抗性主要機制是交叉保護機理。大量的實驗已經(jīng)證明，CP基因介導的抗性不適合應用于大田的抗CMV病毒，因為植物生長在稍高的溫度下該抗性很容易被打破。CMV衛(wèi)星RNA雖然可以減緩CMV的病癥，但是也具有對CMV(輔助病毒)和寄主的特異性。利用衛(wèi)星RNA來減緩CMV侵染的病癥也不宜在大田應用。雖然利用CP和衛(wèi)星RNA兩者的結(jié)合，可以獲得較高的專一抗性，但是，也不適合應用于大田上。因為CMV病毒病害最致命的危害就是它的傳毒載體蚜蟲無?；砸螅罅康囊吧闹骱蛶Ф狙料x常使植物出現(xiàn)多種亞組CMV病毒的復合侵染，所以，造成長期以來許多防治方法難以奏效。也因此使CMV有植物“流感性病毒”之稱。
公開號為EP806481-A、發(fā)明名稱為“Preparing transgenic plants resistantto RNA virus infection-using antisense gene constructs containing the viralcoat protein gene，e.g.from cucumber mosaic virus”的歐洲專利申請公開了在煙草中表達CMV的coat protein(CP)的反向序列來獲得對單一CMV的抗性技術。用病原基因的反向序列來獲得抗性的主要機理是利用寄主的RNA沉默抗性機制。大量的實驗已經(jīng)證明，用反向序列引起的RNA沉默(RNAi)效應遠遠不及用含有內(nèi)含子的反向重復序列引起的RNAi效應顯著；另外，用CP的序列不能同時將CMV的三個基因組和兩個亞基因組作為RNAi的靶標基因，更談不上能靶向其他亞組的CMV病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，是使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA，得到抗黃瓜花葉病毒的植物。
所述方法中，使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA，也就是使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的發(fā)夾RNA(hpRNA)。
上述方法中，所述黃瓜花葉病毒3’UTR可為亞組IA，IB和亞組II的黃瓜花葉病毒中的任意一個株系的3’UTR。如亞組II中的Q株系、Ly株系或Trk7的3’UTR；亞組IB中的SD株系、Tfn株系或Nt9株系等的3’UTR；亞組IA中的Fny株系、Mf株系或O株系的3’UTR。其中，亞組II中的Q株系(Genbank Accession Number M21464)以及其他株系的3’UTR序列；亞組IB中的SD株系(GenBank Accession NumberAB008777)以及其他株系的3’UTR序列；亞組IA中的Fny株系(GenBank AccessionNumber NC001440(也可為D10538，都是一樣的序列))以及其他株系的3’UTR序列。
上述方法中，黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA優(yōu)選來自亞組IA黃瓜花葉病毒中的Fny株系，或亞組IB黃瓜花葉病毒中的SD株系，或亞組II黃瓜花葉病毒中的Q株系；尤其優(yōu)選來自亞組II黃瓜花葉病毒的Q株系。
所述3’UTR可為RNA1、RNA2或RNA3的3’UTR，優(yōu)選為RNA3的3’UTR。
現(xiàn)有的可使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA的方法均可選用，其中的一種選擇是，將在多克隆位點插入有用黃瓜花葉病毒3’UTR的3′端序列或5′端序列構建成的發(fā)夾結(jié)構的重組真核表達載體導入目的植物中。
其中，所述黃瓜花葉病毒3’UTR的5′端序列或3′端序列，可來自亞組IA、IB和亞組II的黃瓜花葉病毒中的任意一個株系的RNA1、RNA2和RNA3中任一個基因組RNA的3’UTR，如亞組II黃瓜花葉病毒的Q株系的RNA3的3’UTR或SD株系的RNA3的3’UTR。所述亞組II黃瓜花葉病毒的Q株系的RNA3的3’UTR的5′端序列具體可選自GenBank Accession Number M21464的自5′端第1877至2076位中21-200nt核苷酸片段中的任意一個序列。所述SD株系的RNA3的3’UTR的5′端序列選自GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1919至2118位中21-200nt核苷酸片段中的任意一個序列。
上述方法中，在多克隆位點插入有用黃瓜花葉病毒3’UTR的3′端序列或5′端序列構建成的發(fā)夾結(jié)構的重組真核表達載體具體可為如圖1B所示的35S-3TRi或35S-3UTi或35S-SD-3UTi。
本發(fā)明的培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，適合于黃瓜花葉病毒能侵染的各種植物，包括單子葉與雙子葉植物、草本、灌木與木本植物等，如煙草。
本發(fā)明基于3’UTR對于CMV復制的重要性，以及核酸序列與三維結(jié)構的穩(wěn)定性，探求CMV 3’UTR介導的RNA沉默抗病毒效應。實驗結(jié)果表明，表達CMV 3’UTR來源的hpRNA的大部分轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出恢復表型，并伴隨系統(tǒng)葉中病毒RNA積累的降低。在轉(zhuǎn)基因植物中3’UTR來源的siRNA的積累水平與轉(zhuǎn)基因組的抗性程度之間不存在明顯的相關性。不同亞組CMV的抗性實驗表明，轉(zhuǎn)基因煙草同樣具有對其他亞組CMV的誘導型廣譜抗性作用。
黃瓜花葉病毒(CMV)是三分體病毒，包括三條基因組RNA和兩條亞基因組RNA。CMV病毒不同基因組間的3’UTR核苷酸序列具有大于80％的同源性，不同亞組間的3’UTR核苷酸序列具有約60％的同源性。所以，把3’UTR序列作為靶向目標可以同時作用于病毒多基因組。實驗證明，利用一種CMV的3’UTR序列構建的發(fā)夾RNA(hpRNA)產(chǎn)生的小RNA對不同亞組的CMV基因組RNA都有沉默效用，從而獲得廣譜的抗CMV抗性效果。這也是為大田抗CMV應用所必要的。
本發(fā)明利用含有內(nèi)含子的反向重復序列(hpRNA)而不是簡單的正向或反向序列，能產(chǎn)生最高效率的RNA沉默抗病毒效應。而且該抗病特點在于減弱病毒的初期侵染的同時利用病毒初期侵染提高抗病效力，充分利用病毒初期侵染產(chǎn)生的病毒RNA被3’UTR hpRNA來源的小RNA的剪切，來加速RNAi效率，實現(xiàn)誘導型RNAi效力疊加的新型抗病體系。


圖1A為CMV基因組RNA 3’UTR序列的高度相似性。
圖1B為CMV基因組結(jié)構及35S-3UTi和35S-3TRi表達框架示意圖。
圖2為3’UTR來源的siRNAs瞬時表達檢測及對CMV靶標RNA的下調(diào)。
(A)3’UTR發(fā)夾RNA來源的siRNAs瞬時表達檢測。
(B)，(C)，(D)分別為35S-3UTi與三種靶標(35S-QR4，35S-QR1*，35S-SDR4)的共注射雜交結(jié)果。
圖3為35S-3UTi轉(zhuǎn)基因煙草中3UTi來源的siRNAs與CMV RNAs積累水平的檢測。
(A)對47個轉(zhuǎn)基因株系中的20個株系的T1代進行3UTi來源的siRNAs積累水平的Northern雜交檢測。
(B)在CMV感染轉(zhuǎn)基因T1代株系25天后，每個組選擇兩個轉(zhuǎn)基因株系進行CMVRNA積累水平的分子檢測。
圖4為CMV攻毒35S-3UTi轉(zhuǎn)基因植物后的表型觀察(A)左圖顯示的是SD-CMV感染空載體轉(zhuǎn)基因植物后葉片出現(xiàn)嚴重失綠及卷曲的癥狀，右圖顯示的是35S-3UTi轉(zhuǎn)基因植物能從SD-CMV感染中恢復過來。
(B)上圖顯示的Q-CMV感染空載體與35S-3UTi轉(zhuǎn)基因植物后感染葉與系統(tǒng)葉的癥狀表型，下圖顯示的是SD-CMV感染空載體與35S-3UTi轉(zhuǎn)基因植物后感染葉與系統(tǒng)葉的癥狀表型。未感染的野生型煙草葉片作為正對照。
圖5為pSK-intron的物理圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明的方法適用于培育黃瓜花葉病毒能侵染的各種植物，包括單子葉與雙子葉植物、草本、灌木與木本植物等。下面僅以培育抗黃瓜花葉病毒煙草為例，闡明本發(fā)明的方法。
培育抗黃瓜花葉病毒煙草的實驗證明，表達Q株系或SD株系的黃瓜花葉病毒CMV3’UTR來源的發(fā)夾RNA(hpRNA)的轉(zhuǎn)基因煙草(Xanthi.nc)能有效地降低CMV RNA的積累。少數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草出對Q-CMV侵染表現(xiàn)出完全抗性；大部分轉(zhuǎn)基因煙草在Q-CMV侵染后誘導了對病毒的抗性，并恢復健康表型。與CMV接種葉相比，上層系統(tǒng)葉表現(xiàn)出無病或弱病癥表型，而且病毒RNA的積累減少，表現(xiàn)出恢復型抗性。Northernblot雜交結(jié)果顯示，抗性程度與轉(zhuǎn)基因植物中3’UTR來源的siRNA的積累量不存在明顯的相關性。對其他亞組的CMV株系，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草同樣表現(xiàn)出恢復型抗性。結(jié)合植物瞬時表達系統(tǒng)的實驗，結(jié)果表明植物中表達3’UTR來源的siRNA具有降解病毒靶標的生物學活性，即能有效地靶向病毒基因組RNA，造成病毒多基因組分RNA的剪切，最終使植物表現(xiàn)應答病毒侵染的誘導型抗性。由于不同亞組CMV3’UTR的高度同源性，使轉(zhuǎn)基因煙草同時具用對不同亞組CMV的廣譜抗性。下面具體闡明培育抗黃瓜花葉病毒煙草的方法。
實施例1、培育抗黃瓜花葉病毒煙草1、瞬時表達實驗中CMV RNA3 3’UTR發(fā)夾RNA來源的siRNAs積累的檢測CMV可分為三個亞組亞組IA、IB和亞組II。其中，每個株系內(nèi)3’UTR之間的序列相似性高達約80％，不同株系間RNA3 3’UTR的相似性也有60％左右(圖1A)。正是由于CMV三組分基因組RNA 3’UTR之間的這種高度相似性促使發(fā)明人研究靶向3’UTR的抗病毒策略。如圖1B所示，CMV的三條基因組RNA和兩條亞基因組RNA的3’UTR區(qū)域包含5’端和3’端tRNA-like結(jié)構。為了檢測3’UTR發(fā)夾RNA來源的siRNA的產(chǎn)生效率，擴增了對應于Q-CMV(亞組II)RNA3(M21464)3’UTR區(qū)域18到213nt和117到321nt的兩段序列，分別對應于3’UTR的5’端和3’端，構建到發(fā)夾結(jié)構表達框架中(圖1B)，該發(fā)夾結(jié)構由花椰菜花葉病毒(CauliflowerMosaic Virus，CaMV)的強組成型啟動子35S控制，得到35S-3UTi和35S-3TRi兩種發(fā)夾RNA表達框架。為了檢測siRNA的瞬時表達，攜帶有35S-3UTi或35S-3TRi重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。攜帶有35S-3TRi的農(nóng)桿菌生長緩慢，表明該結(jié)構對農(nóng)桿菌生長可能有毒性，3TR序列中的tRNA-1ike高級結(jié)構可能是原因之一。由于得不到可用的農(nóng)桿菌懸浮物，因此在下面的實驗中僅選用35S-3UTi進行更深入的分析。攜帶有35S-3UTi農(nóng)桿菌懸浮物被注射到本生煙葉片中，分別于注射后1、2、3天剪取注射葉片，提取RNA，進行小分子量Northern雜交。注有空載體的葉片作為陰性對照。由圖2中A可以看出，相對于注有空載體的葉片，在注有35S-3UTi重組質(zhì)粒的煙草葉片中能夠檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA的siRNA的表達。
具體實驗方法和結(jié)果如下(1)重組真核細胞表達載體的構建DNA操作與克隆按《分子克隆》中的標準程序進行(Sambrook J，Russel DW.Molecular Cloninga Laboratory Manual，3d edn.Cold Spring Harbor，NYColdSpring Harbor Laboratory 2002)。
A、以由CMV Q株系(Q-CMV)(植物基因組學國家重點實驗室)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴增得到Q-CMV RNA3(M21464)(genebank登錄號)3’UTR 18-213nt(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1894至2089位)(196bp)和117-321nt(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1993至2197位)(205bp)兩段序列，分別命名為3UT和3TR。其中，擴增3UT的引物為3UT5，5’-GTCCGAAGACGTTAAACTAC-3’，和3UT3，5’-CTAGGAGGTGATTTCAAGGGAAGCTT-3’；擴增3TR的引物為3TR5，5’-GGGTTGTCCATCCAGCTTACG-3’，和3TR3，5’-GGTCTCCTTATGGAGAACCTGTGGAAGCTT-3’。其中下劃線部分為外加的HindIII酶切位點。PCR產(chǎn)物直接連入pGEM-T載體(Promega，Madison，WI)，測序驗證后得到含有3UT的克隆pT-3UT和含有3TR的克隆pT-3TR。分別用HindIII/SalI限制酶和EcoRI/SpeI限制酶從pT-3UT上切下兩段3UT片段，將該片段分別連接到pSK-intron載體中的限制性內(nèi)切酶HindIII/SalI和EcoRI/SpeI位點間，得到含有3UT-intron-3UT片段的重組質(zhì)粒pSK-3UTi。
分別用HindIII/SalI限制酶和EcoRI/SpeI限制酶從pT-3TR上切下兩段3TR片段，將該片段分別連接到pSK-intron載體中的限制性內(nèi)切酶HindIII/SalI和EcoRI/SpeI位點間，得到含有3TR-intron-3TR片段的重組質(zhì)粒pSK-3TRi。
其中pSK-intron的構建方法如下通過PCR將擬南芥actin gene 11(ATU27981)的第三個內(nèi)含子(GenBank AccessionNumber U27981的自5′端第1957-2111位)擴增出來，引物為
Pint5’，TACGTAAGTAGATCTTCAACACC(下劃線為snaBI酶切位點)；Pint3’，GGAATTCTGCAAACACACAAGACAAT(下劃線為EcoRI酶切位點)。擴增出來的155bp片段經(jīng)snaBI(產(chǎn)生平末端)/EcoRI消化后連接到經(jīng)EcoRV(產(chǎn)生平末端)/EcoRI消化的pBluscript II SK+(Stratagene公司產(chǎn)品)載體上，得到pSK-intron載體。pSK-intron的物理圖譜如圖5所示。
重組質(zhì)粒pSK-3UTi和pSK-3TRi經(jīng)HincII和SacI消化，各自切下3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段。pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)經(jīng)XbaI酶切，Klenow酶補齊粘端，SacI酶切，分別與3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段連接，將3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段分別克隆到pCAMBIA1300雙元載體的XbaI(經(jīng)Klenow酶補齊末端)和SacI位點之間，上下游分別有35S啟動子和NOS終止子。最終得到含有3UT-intron-3UT片段(稱為3UTi)的重組質(zhì)粒為35S-3UTi，含有3TR-intron-3TR片段的重組質(zhì)粒35S-3TRi。
B、為了構建SD-CMV 3‘UTR來源的發(fā)夾RNA表達載體，以由CMV SD株系(SD-CMV)(植物基因組學國家重點實驗室)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴增得到SD-CMV RNA3 3’UTR 5’端1-200 nt片段(即GenBank Accession NumberAB008777的自5′端第1919至2118位)(200bp)，命名為SD-3UT，引物分別為SD-3UT5，GTATACATCCGTGTTTCCCAGAACCCTC，SD-3UT3，AAGCTTTGGTCTCCTAAAGGAGGCTCCCAC。下劃線部分分別為，為方便克隆而引入的HincII和HindIII位點，PCR產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體上，經(jīng)測序驗證后分別得到其正反向插入的克隆，分別命名為pT-SD3UT(+)和pT-SD3UT(-)，其中pT-SD3UT(+)經(jīng)HincII和HindIII消化后產(chǎn)生的片段連接到經(jīng)同樣酶消化的pSK-intron中間載體上，命名為pSK-SD3UT(+)，隨后pT-SD3UT(-)經(jīng)EcoRI和SpeI(pGEM-Teasy上有EcoRI和SpeI位點)的消化后產(chǎn)生的片段連接到經(jīng)同樣酶消化的pSK-SD3UT(+)上，這樣就在intron的左右兩側(cè)反向連上了SD-3UT片段，得到的含有SD3UT(+)-intron-SD3UT(-)片段(即SD-3UTi片段)的載體命名為pSK-SD-3UTi，最后，pSK-SD-3UTi載體經(jīng)HincII和SacI消化后產(chǎn)生的SD-3UTi片段連接到經(jīng)SmaI和SacI消化的雙元載體pCAMBIA1300(AF234296)上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-SD-3UTi(35S-SD-3UTi)。
(2)35S-3UTi注射本生煙(Nicotiana benthamiana)與siRNA表達檢測pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)或35S-3UTi或35S-3TRi經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(植物基因組學國家重點實驗室)中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性菌株。含有pCAMBIA1300或35S-3UTi或35S-3TRi的農(nóng)桿菌在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后用注射器注入本生煙草(Nicotiana benthamiana)(植物基因組學國家重點實驗室)葉片組織中(English JJ，Mueller E，Baulcombe DC.Suppression of Virus Accumulationin Transgenic Plants Exhibiting Silencing of Nuclear Genes.Plant Cell 1996；8179-88)，注射前將菌液的OD600吸光值調(diào)至1.0，注射劑量為注滿整個葉片。每種質(zhì)粒注射3株。注射后1，2，3天分別剪取每株注射葉，提取總RNA，進行siRNA的Northern雜交。
植物總RNA是選用Invrtrogen公司的TRIZOL提取試劑進行提取的，提取按照其操作說明進行。30μg總RNA經(jīng)17％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后進行低分子量RNA的雜交，雜交方法參照參考文獻(Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，BartelB，Bartel DP.MicroRNAs in plants.Genes Dev 2002；161616-26)。35S-3UTi和35S-3TRi來源的siRNA分別用α[32P]-UTP標記的經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的Q-CMV RNA33’UTR全長片段(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1877至2197位)探針進行雜交檢測，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒為Ambion的MAXIscript kit。溴化乙錠染色的5S rRNA用于低分子量RNA的上樣量對照。同時以3株未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)作為對照。
結(jié)果表明，注射后1，2，3天，3株注有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)的葉片均未檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA的siRNA的表達，與3株未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)檢測結(jié)果相同；相對于注有空載體的葉片，注射后1，2，3天，在3株注有35S-3UTi重組質(zhì)粒的煙草葉片中均能夠檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA 21-22bp的siRNA的表達；注射后1，2，3天，在3株注有35S-3TRi重組質(zhì)粒的煙草葉片中均未檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA的21-22bp的siRNA的表達(圖2中A)。圖2中A，Marker是RNA分子梯度，Vector表示pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)，1、2、3分別表示注射后1，2，3天，WT為未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)。
2、共注射實驗中3’UTR來源的siRNA可下調(diào)CMV靶標的表達為了檢測產(chǎn)生的siRNA是否能夠成功下調(diào)CMV靶標的積累，構建了含有Q-CMV亞基因組RNA4全長的35S控制下的表達質(zhì)粒35S-QR4(圖2中B)，并與35S-3UTi共注射到煙草葉片中進行瞬時表達。結(jié)果正如預期一樣，與空載體共注射相比，與發(fā)夾RNA的共表達導致瞬時表達RNA4的水平顯著減少(圖2中B)，RNA4的降解在第二天最明顯，此時同樣能檢測到3UTi來源的siRNA(圖2中B)。該結(jié)果表明3UTi來源的siRNAs具有在RISC復合物中降解靶標RNA的生物學活性。
Q-CMV的RNA13’UTR與RNA3 3’UTR之間的保守性高達83.2％，為了檢測3UTi來源的siRNA對其他CMV靶標的降解效率，包含有3’UTR的Q-CMV RNA1部分序列(2428到3389，稱為RNA1*)被克隆到35S下游，得到的重組質(zhì)粒35S-QRi*。35S-QR1*與35S-3UTi共注射到煙草中，結(jié)果表明，注射后第三天RNA1*靶標的降解顯著(圖2中C)。但是，RNA1*靶標的降解要慢于RNA4靶標?？紤]到這兩組實驗中siRNA的表達水平?jīng)]有明顯差異(見圖2，B和2.C下部)，表明RNA3 3’UTR來源的siRNA-RISC對RNA1*靶標的剪切效率不如對RNA4高。這與前面的結(jié)論即RNA1和RNA3 3’UTR的5’端80％的相似性是一致的，而這種相似性的程度可能影響了對RNA1*靶標的降解效率。與這一現(xiàn)象一致，在35S-3UTi與另一含有SD-CMV(亞組IB)RNA4全長的靶標質(zhì)粒35S-SDR4的共注射實驗中，3UTi來源的siRNA對SD-CMV RNA4的剪切效率比對Q-CMV RNA1*的又有所降低(圖2.D)，因為SD-CMV RNA4與Q-CMV RNA3的3’UTR5’端只有72.9％的相似性。
另外，在35S-SD-3UTi與35S-SDR4、35S-QR4和35S-QR1*三種靶標載體的共注射實驗中，Northern雜交的結(jié)果也表明，SD-CMV 3UTi來源的siRNA同樣能夠下調(diào)CMV靶標RNA的表達水平，而且SD-CMV RNA4的減少最為顯著，其次為Q-CMV RNA1*和Q-CMV RNA4，兩者的降低水平差異不大，這與SD-CMV RNA4 3’UTR和Q-CMV RNA13’UTR與Q-CMV RNA4 3’UTR的相似度是一致的(分別為65.4％和63.7％)。無論如何，瞬時表達實驗證明了3UTi來源的siRNA是具有依賴同源性的降解病毒RNA靶標的能力的。
具體實驗方法和結(jié)果如下(1)重組質(zhì)粒的構建為了構建siRNA的CMV靶標表達載體，以由Q-CMV(植物基因組學國家重點實驗室)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴增得到包含Q-CMV RNA1 3’UTR的962bp的片段(稱為QR1*)(即GenBank Accession Number X02733的自5′端第2428至3389位)，引物分別為QR1-5TCTAGATCGAGTGCTTGTGGATGAAGTTG，QR1-3TGGTCTCCTTATGGAGAACCTG，帶下劃線的部分為XbaI識別位點。PCR擴增產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體上，測序驗證后經(jīng)XbaI和SacI消化后得到包含Q-CMV RNA13’UTR的962bp的片段，將該片段連接入用同樣酶消化的pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)雙元載體中，得到重組質(zhì)粒35S-QR1*。另外兩個靶標表達載體35S-QR4和35S-SDR4首先分別以由Q-CMV(植物基因組學國家重點實驗室)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，和由SD-CMV(植物基因組學國家重點實驗室)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增Q-CMV RNA3的3’UTR的1031bp的片段(稱為QR4，即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1167至2197位)和SD-CMVRNA3的3’UTR的1009bp的片段(稱為DR4，即GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1211至2219位)。得到的片段經(jīng)測序驗證后經(jīng)XbaI和SacI消化連接到pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)上得到的。PCR擴增QR4的引物分別為QR4-5，5’-TCTAGAGTTTAGTTGTTCACCTGAGTC-3’和QR4-3，5’-GAGCTCTGGTCTCCTTATGGAGAAC-3’；PCR擴增SDR4的引物分別為SDR4-5，5’-TCTAGAGTCTGTGTGTTGTGTTTTTC-3’，和DR4-3，5’-GAGCTCTGGTCTCCTAAAGGAGGCT-3’。下劃線部分為方便克隆引入的XbaI和SacI限制性酶切位點。
(2)農(nóng)桿菌注射本生煙(Nicotiana benthamiana)35S-3UTi、35S-QR1*、35S-QR4或35S-SDR4經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性菌株。將OD600為1.5的攜帶有35S-3UTi的菌液與OD600為0.5的攜帶有靶標重組質(zhì)粒(35S-QR1*，35S-QR4和35S-SDR4中的任一種)的菌液等體積混合，用注射器注入本生煙草(Nicotiana benthamiana)葉片組織中(English JJ，Mueller E，BaulcombeDC.Suppression of Virus Accumulation in Transgenic Plants ExhibitingSilencing of Nuclear Genes.Plant Cell 1996；8179-88)，注射劑量為注滿整個葉片。每種質(zhì)粒注射3株。注射后1，2，3天分別剪取每株注射葉，提取總RNA，進行高分子量Northern雜交(檢測siRNA的靶標的積累)和低分子量Northern雜交。
在高分量RNA雜交分析中，8μg總RNA在含有1％甲醛的瓊脂糖膠(濃度為1.2％)中進行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜上。然后將膜與用α[32P]-dCTP標記的DNA探針進行雜交，選用Amersham公司的Random Primer labeling Kit進行探針標記。檢測siRNA的靶標Q-CMV RNA1*的積累選用Q-CMV基因組RNA1(即GenBank AccessionNumber X02733的自5′端第2720至3019位)為特異探針進行雜交，檢測siRNA的靶標Q-CMV RNA4的積累選用Q-CMV基因組RNA3(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1220至1876位)為特異探針進行雜交，檢測siRNA的靶標SD-CMV RNA4的積累選用SD-CMV基因組RNA3(即GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1263至1918位)為特異探針進行雜交。亞甲藍染色的28S rRNA用于高分子量RNA的上樣量對照。同時以3株未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)作為對照。
低分子量雜交方法同步驟1。
結(jié)果表明注射后1，2，3天，3株注有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)和35S-QR4的葉片均未檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA的siRNA的表達，與3株未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)檢測結(jié)果相同。相對于注有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)和35S-QR4的葉片，注射后2和3天，在3株注有35S-3UTi和35S-QR4重組質(zhì)粒的煙草葉片中均能夠檢測到來源于3’UTR發(fā)夾RNA的21-22bp的siRNA的表達；同時表明瞬時表達RNA4的水平顯著減少，RNA4的降解在第二天最明顯。該結(jié)果表明3UTi來源的siRNAs具有在RISC復合物中降解靶標RNA的生物學活性。(圖2中B)。圖2中B，Marker為RNA分子梯度，Vector表示pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)，1、2、3分別表示注射后1，2，3天，WT為未轉(zhuǎn)化的本生煙(Nicotiana benthamiana)。
另外，在35S-SD-3UTi與35S-SDR4、35S-QR4和35S-QR1*三種靶標載體的共注射實驗中，Northern雜交的結(jié)果也表明，SD-CMV 3UTi來源的siRNA同樣能夠下調(diào)CMV靶標RNA的表達水平，而且SD-CMV RNA4的減少最為顯著，其次為Q-CMV RNA1*和Q-CMVRNA4，兩者的降低水平差異不大，這與SD-CMV RNA4 3’UTR和Q-CMV RNA1 3’UTR與Q-CMV RNA4 3’UTR的相似度是一致的(分別為65.4％和63.7％)。
3、轉(zhuǎn)基因植物中3UTi來源的siRNA的表達導致植物從CMV病毒侵染中恢復的現(xiàn)象得到瞬時表達實驗的證據(jù)后，將35S-3UTi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草，以轉(zhuǎn)有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)的轉(zhuǎn)基因煙草作為負對照?？偣驳玫搅?7個獨立的轉(zhuǎn)基因株系中，將轉(zhuǎn)基因植物T1代經(jīng)抗性篩選后移入土中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植物的T1代首先進行Northern雜交檢測3UTi來源的siRNA的積累水平，結(jié)果表明，47個株系中有20個能夠檢測到siRNA的表達，這20個株系中siRNA的積累水平也很不一致(圖3.A)，根據(jù)siRNA的積累水平可將這20個轉(zhuǎn)基因株系分為三組。組I包括株系6，15，17，24，28，40和45，siRNA的積累水平最低；組II包括株系8，20，27，34，37，38和43，具有中等水平的siRNAs積累；組III包括株系7，13，18，21，33和42，積累的siRNA最多(圖3.A)。
為了檢測這三組轉(zhuǎn)基因株系對CMV侵染的敏感性，T1代轉(zhuǎn)基因植物進行Q-CMV攻毒實驗。CMV侵染4-6天后通常后造成煙草系統(tǒng)侵染葉失綠等癥狀。攻毒實驗觀察表明，轉(zhuǎn)有空載體的對照植株表現(xiàn)出與野生型煙草一樣的感病癥狀，所有的轉(zhuǎn)有35S-3UTi重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因煙草都表現(xiàn)出一定程度的對Q-CMV侵染的保護功能，具體表現(xiàn)在大多數(shù)攻毒植株的病癥減少或者延遲。僅有很少的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對Q-CMV侵染的完全抗性。有趣的是，雖然在組I中完全抗性的比例(3.7％)較之組II(9.09％)和組III(7.84％)有些許降低，但三組轉(zhuǎn)基因植物中，感病植物都有在感病后表現(xiàn)出恢復健康表型的抗性植物的存在(表1)。這表明3UTi來源的siRNA的積累水平或許不是決定對CMV侵染敏感性的唯一因素。攻毒實驗25天后，每組選擇兩棵植物，以Q-CMV CP序列為特異探針進行的Northern雜交的結(jié)果表明(圖3.B，上半部分第2，4，6，8，10，12，14和16列)，在每組感染的轉(zhuǎn)基因植物中，侵染癥狀的減少伴隨著侵染葉中病毒RNA積累水平的下降。這一結(jié)果進一步證明了35S-UTi轉(zhuǎn)基因植物的抗CMV程度與siRNA的積累水平并沒有強相關性。觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒17天后新生葉感病癥狀就開始減輕，25天后新生葉中的病毒RNA水平顯著減少(見圖3.B，上面)。在三次獨立攻毒實驗中，所有三個組的轉(zhuǎn)基因植物都發(fā)現(xiàn)了這種恢復現(xiàn)象，而且在恢復現(xiàn)象出現(xiàn)的比例上沒有顯著不同(表1)。
為了檢測轉(zhuǎn)有35S-3UTi的轉(zhuǎn)基因植株對CMV病毒是否具有廣譜抗性，又進行了亞組IB SD-CMV的攻毒實驗。結(jié)果表明，感染后的野生型煙草出現(xiàn)更明顯的失綠癥狀，而且系統(tǒng)新生葉出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象(圖4.A，左圖)，與Q-CMV攻毒實驗一致，所有的轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出對SD-CMV侵染某種程度的保護作用，大部分植物病狀減輕或延遲，并且以SD-CMV CP序列為特異探針進行的Northern雜交結(jié)果表明，侵染葉中病毒RNA積累水平顯著降低(圖3.B中第2，4，6，8，10，12，14和16)。但是，系統(tǒng)新生葉中病毒RNA的減少不如Q-CMV攻毒實驗中那么明顯，這與瞬時表達實驗中3UTi來源的siRNAs對SD-RNA4靶標的剪切效率不如Q-CMV RNA4靶標的結(jié)果是符合的(圖2.D)。但是，大多數(shù)經(jīng)SD-CMV攻毒實驗的轉(zhuǎn)基因植株中也發(fā)現(xiàn)了恢復現(xiàn)象。因為SD-CMV侵染野生型煙草的強烈的失綠和葉型卷曲癥狀，使轉(zhuǎn)基因煙草的恢復抗性表型更為明顯(圖4.B)。結(jié)合CMV不同亞組病毒的攻毒實驗，結(jié)果表明，3’UTR來源的發(fā)夾RNA產(chǎn)生的siRNAs在RISC介導的對病毒RNA 3’UTR的剪切中是具有生物學功能的，這種剪切導致了轉(zhuǎn)基因植物對CMV病毒侵染表現(xiàn)出同源依賴性的恢復現(xiàn)象。證明了表達3’UTR來源的hpRNA煙草具有誘導型廣譜抗CMV效應。
具體實驗方法和結(jié)果如下35S-3UTi經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性菌株。利用與攜帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)方法進行煙草(Xanthi.nc)(植物基因組學國家重點實驗室)轉(zhuǎn)化。具體方法如下①無菌苗準備將煙草種子在37℃浸泡過夜，再用30％的次氯酸鈉消毒15min，無菌水洗3-5次，轉(zhuǎn)移到裝有MS固體培養(yǎng)基的玻璃高瓶中，光照培養(yǎng)。
②預培養(yǎng)將無菌苗葉片切除邊緣和中脈后切成0.5cm×0.5cm的小塊，置于MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培養(yǎng)基上預培養(yǎng)兩天。
③農(nóng)桿菌的準備從平板上挑取新鮮單菌落或凍存的液體菌種，接種到2ml附加相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6~0.8。
④侵染將農(nóng)桿菌菌液于室溫條件下，4000rpm，離心10min，沉淀懸浮于10ml MS液體培養(yǎng)基中，將預培養(yǎng)的葉片放入菌液中浸泡15min，期間輕輕搖動。
⑤共培養(yǎng)取出葉片，置于無菌濾紙上吸去附著的菌液；放回MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培養(yǎng)基上，暗處共培養(yǎng)兩天。
⑥選擇培養(yǎng)將經(jīng)過共培養(yǎng)的葉片轉(zhuǎn)移到MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧芐霉素)(500mg/L)的分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)3-4周左右。
⑦繼代培養(yǎng)當葉盤分化出抗性不定芽或產(chǎn)生抗性愈傷組織時，將這些抗性材料轉(zhuǎn)移到新的分化培養(yǎng)基中上進行繼代培養(yǎng)。
⑧生根培養(yǎng)待不定芽長到1cm左右時，將其切下并轉(zhuǎn)到MS+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧芐霉素)(500mg/L)生根培養(yǎng)基上，2周左右長出不定根，當不定根長到2-3cm時，取出植株，徹底清除根部培養(yǎng)基，移入土壤中培養(yǎng)，成熟后收種。
總共得到了47個獨立的轉(zhuǎn)35S-3UTi株系。得到的35S-3UTi T1代轉(zhuǎn)基因煙草種子在含有潮霉素(20mg/L)的MS培養(yǎng)基的平板上篩選抗性植株轉(zhuǎn)移至土壤中，每個株系各10株。同時以轉(zhuǎn)有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)的轉(zhuǎn)基因煙草作為負對照。長至6片葉齡時，取第4片葉進行siRNAs積累水平的Northern雜交檢測，方法同步驟1。結(jié)果表明，47個株系中有20個能夠檢測到siRNA的表達，這20個株系中siRNA的積累水平也很不一致(圖3中A)；49株轉(zhuǎn)有空載體pCAMBIA-1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)的轉(zhuǎn)基因煙草均未檢測到siRNA的表達。根據(jù)siRNA的積累水平可將這20個轉(zhuǎn)基因株系分為三組。組I包括株系6，15，17，24，28，40和45，siRNA的積累水平最低；組II包括株系8，20，27，34，37，38和43，具有中等水平的siRNAs積累；組III包括株系7，13，18，21，33和42，積累的siRNA最多(圖3中A)(圖3中共檢測了47個株系的轉(zhuǎn)基因植物，圖中顯示的是有siRNA表達的20個株系的siRNA的積累情況，每個株系選擇5棵植物，樣品混在一起提取RNA進行雜交)。圖3中A具有兩位小數(shù)的數(shù)值表示結(jié)合到膜上的同位素探針的放射強度(代表膜上RNA的積累量)。
這20個株系長至8片葉齡時進行病毒侵染實驗，毒源為CMV(Q株系或SD株系)(植物基因組學國家重點實驗室)，實驗設三次重復。侵染方法是首先在新鮮的轉(zhuǎn)基因植株葉面噴布一層金剛砂，然后將感染有CMV的煙草新鮮葉片組織在磷酸緩沖液(pH 7.2)中勻漿，濃度為500mg/ml磷酸緩沖液，感染時用手蘸取勻漿液輕輕涂抹于轉(zhuǎn)基因植株葉表，每株感染三個葉片，全部涂完10分鐘后用清水沖洗掉葉面的金剛砂，保濕24小時，轉(zhuǎn)入溫室正常培養(yǎng)，25天后觀察表型，同時每組選擇兩個株系，每個株系各3株，從感染葉(L)和系統(tǒng)未感染葉(感染葉上方第五片葉，S)中提取總RNA，8μg總RNA用于Nortern雜交，Q株系侵染的轉(zhuǎn)基因株系探針選用Q-CMV RNA4特異探針(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1220至1876位)，SD株系侵染的轉(zhuǎn)基因株系探針選用SD-CMV RNA4特異探針(即GenBankAccession Number AB008777的自5′端第1263至1918位)雜交方法同步驟2的高分子量雜交。
攻毒25天后，觀察發(fā)病情況，以葉片光滑無明顯皺縮，無花葉矮化癥狀，CMV RNA積累量低為抗性標準。49株轉(zhuǎn)有空載體pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)的對照植株表現(xiàn)出與10株野生型煙草一樣的感病癥狀如葉片皺縮卷曲，花斑失綠，植株矮化等。上述20個株系的每個株系轉(zhuǎn)有35S-3UTi重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因煙草都表現(xiàn)出一定程度的對Q-CMV侵染的保護功能，具體表現(xiàn)在大多數(shù)攻毒植株(72.22％-89.09％，見表1)的病癥減少或者延遲(表型觀察表明葉片無明顯皺縮，無失綠花斑，植株未見矮化，Northern雜交數(shù)據(jù)顯示病毒積累量降低)。圖4中B上部顯示的是一株未轉(zhuǎn)基因未被病毒侵染的野生型煙草(圖中以Mock表示)、一株轉(zhuǎn)pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)煙草(圖中以Vector表示)和一株轉(zhuǎn)35S-3UTi煙草(圖中以35S-3UTi表示)在Q-CMV攻毒后25天的表型。僅有很少的轉(zhuǎn)35S-3UTi植株表現(xiàn)出對Q-CMV侵染的完全抗性(全株無病)。有趣的是，雖然在組I中完全抗性的比例(3.7％)較之組II(9.09％)和組III(7.84％)有些許降低，但三組轉(zhuǎn)基因植物中，都有在感病后表現(xiàn)出恢復健康表型的抗性植株的存在(表1)。這表明3UTi來源的siRNA的積累水平或許不是決定對CMV侵染敏感性的唯一因素。表1是三次獨立攻毒實驗的結(jié)果。其中，組I中，株系6，15，17，24，28，40和45分別8、7、7、8、8、8、8株；組II中，株系8，20，27，34，37，38和43分別8、8、7、8、8、8、8株；組III中，株系7，13，18，21，33和42分別9、8、8、8、9、9株。
表1、Q-CMV攻毒后25天，各株系對Q-CMV的抗性

以Q-CMV CP序列為特異探針進行的Northern雜交的結(jié)果表明，在每組感染的轉(zhuǎn)35S-3UTi煙草中，侵染癥狀的減少伴隨著侵染葉中病毒RNA積累水平的下降(圖3中B為每個株系出現(xiàn)10棵表現(xiàn)恢復抗性表型植株混合樣品提取RNA進行Northern檢測的結(jié)果，上半部分第2，4，6，8，10，12，14和16列)。觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒17天后新生葉感病癥狀就開始減輕，25天后新生葉中的病毒RNA水平顯著減少(見圖3中B，上面，見圖中數(shù)據(jù)，圖3中B的具有兩位小數(shù)的數(shù)值表示結(jié)合到膜上的同位素探針的放射強度(代表膜上RNA的積累量))。在三次獨立攻毒實驗中，所有三個組的轉(zhuǎn)基因植物都發(fā)現(xiàn)了這種恢復現(xiàn)象，而且在恢復現(xiàn)象出現(xiàn)的比例上沒有顯著不同(表1)。
亞組IB SD-CMV的攻毒實驗結(jié)果表明，感染后的10株轉(zhuǎn)pCAMBIA1300煙草出現(xiàn)更明顯的失綠癥狀，而且系統(tǒng)新生葉出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，與Q-CMV攻毒實驗一致，所有的轉(zhuǎn)35S-3UTi植株都表現(xiàn)出對SD-CMV侵染某種程度的保護作用，70％-73.81％轉(zhuǎn)基因植物病狀減輕或延遲(見表2，表型觀察表明葉片無明顯皺縮，無失綠花斑，植株未見矮化，Northern雜交數(shù)據(jù)顯示病毒積累量降低)。圖4中A左圖顯示的是一株轉(zhuǎn)pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)煙草(圖中以Vector表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型；圖4中A右圖顯示的是一株轉(zhuǎn)35S-3UTi煙草(圖中以35S-3UTi表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型。
并且以SD-CMV CP序列為特異探針進行的Northern雜交結(jié)果表明，轉(zhuǎn)35S-3UTi煙草侵染葉中病毒RNA積累水平顯著降低(圖3.B下部中第2，4，6，8，10，12，14和16)。但是，系統(tǒng)新生葉中病毒RNA的減少不如Q-CMV攻毒實驗中那么明顯，這與瞬時表達實驗中3UTi來源的siRNAs對SD-RNA4靶標的剪切效率不如Q-CMV RNA4靶標的結(jié)果是符合的(圖2.D)。但是，經(jīng)SD-CMV攻毒實驗的轉(zhuǎn)基因植株中70.83％也發(fā)現(xiàn)了恢復現(xiàn)象(120株轉(zhuǎn)基因植株中有85株)。因為SD-CMV侵染野生型煙草的強烈的失綠和葉型卷曲癥狀，使轉(zhuǎn)基因煙草的恢復抗性表型更為明顯(圖4中B)。圖4中B下部顯示的是一株野生型未被病毒侵染的野生型煙草(圖中以Mock表示)、一株轉(zhuǎn)pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亞CAMBIA公司產(chǎn)品)煙草(圖中以Vector表示)和一株轉(zhuǎn)35S-3UTi煙草(圖中以35S-3UTi表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型。結(jié)合CMV不同亞組病毒的攻毒實驗，結(jié)果表明，3’UTR來源的發(fā)夾RNA產(chǎn)生的siRNAs在RISC介導的對病毒RNA 3’UTR的剪切中是具有生物學功能的，這種剪切導致了轉(zhuǎn)基因植物對CMV病毒侵染表現(xiàn)出同源依賴性的恢復現(xiàn)象。證明了表達3’UTR來源的hpRNA煙草具有誘導型廣譜抗CMV效應。
表2、SD-CMV攻毒后25天，各株系對Q-CMV的抗性

權利要求
1.一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法，是使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA，得到抗黃瓜花葉病毒的植物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述黃瓜花葉病毒3’UTR為亞組IA、IB和亞組II的黃瓜花葉病毒中的任意一個株系的3’UTR。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述亞組IA黃瓜花葉病毒包括Fny株系、Mf株系或O株系；所述亞組IB黃瓜花葉病毒包括SD株系、Tfn株系或Nt9株系；所述亞組II黃瓜花葉病毒包括Q株系、Ly株系或Trk7株系。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述黃瓜花葉病毒3’UTR為Fny株系、SD株系或Q株系的3’UTR；優(yōu)選為Q株系的3’UTR。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述黃瓜花葉病毒3’UTR為RNA3的3’UTR。
6.根據(jù)權利要求1至4中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA方法為，將在多克隆位點插入有用黃瓜花葉病毒3’UTR的3′端序列或5′端序列構建成的發(fā)夾結(jié)構的重組真核細胞表達載體導入目的植物中。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述3’UTR的5′端序列來自Q株系或SD株系的RNA3的3’UTR。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述Q株系的RNA3的3’UTR的5′端序列選自GenBank Accession Number M21464的自5′端第1877至2076位中21-200nt核苷酸片段中的任意一個序列；所述SD株系的RNA3的3’UTR的5′端序列選自GenBank Accession NumberAB008777的自5′端第1919至2118位中21-200nt核苷酸片段中的任意一個序列。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述重組真核細胞表達載體為如圖1B所示的35S-3UTi或35S-SD-3UTi。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述植物為煙草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育抗黃瓜花葉病毒植物的方法。該方法是使目的植物表達黃瓜花葉病毒3’UTR來源的siRNA，得到抗黃瓜花葉病毒的植物。本發(fā)明利用含有內(nèi)含子的反向重復序列(hpRNA)而不是簡單的正向或反向序列，能產(chǎn)生最高效率的RNA沉默抗病毒效應。而且該抗病特點在于減弱病毒的初期侵染的同時利用病毒初期侵染提高抗病效力，充分利用病毒初期侵染產(chǎn)生的病毒RNA被3’UTR hpRNA來源的小RNA的剪切，來加速RNAi效率，實現(xiàn)誘導型RNAi效力疊加的新型抗病體系。
文檔編號C12N15/33GK101092634SQ200710099649
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權日2007年5月25日
發(fā)明者郭惠珊, 段成國, 王春晗 申請人:中國科學院微生物研究所 被以下專利引用 (2),