黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種RNA植物病毒-煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的黃瓜綠斑駁花葉病毒（ Cucumber green mottle mosaic virus , CGMMV）侵染性克隆載體制備及攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株的致病性分析。黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體，該侵染性克隆載體由黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301-CH制備得到，所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列如Seq ID No:12所示。本發(fā)明農(nóng)桿菌菌株可以大量產(chǎn)生黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克??；該侵染性克隆只侵染植物，不侵染昆蟲，不感染動物和人，相對安全。
【專利說明】黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其 制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種RNA植物病毒-煙草花葉 病毒屬（Tobamovirus)的黃瓜綠斑駁花葉病毒mosaic Firw1S, CGMMV)侵染性克隆載體制備及攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株的致病 性分析。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜綠斑駁花葉病毒屬于蕪菁花葉病毒科（Tymoviridae)煙草花葉病毒屬 (genus TbAaffiorirw1S)成員，其病毒粒子形態(tài)為桿狀，病毒基因組約為6. 4kb，包括5' -及 3' -端非編碼區(qū)和4個開放性的閱讀框，分別編碼129kDa和186kDa復制相關(guān)蛋白、29kDa 的移動蛋白及17. 4kDa的外殼蛋白。該病毒嚴重威脅著瓢瓜（Zageaaria siceraria)、西瓜 {Citrullus Ianatu^)、激瓜 iCucumis melo)、貴瓜 iCucumis sativus Linn.')等銀蘆琴(飲· 物的生產(chǎn)，是世界上許多國家和地區(qū)葫蘆科植物上的重要檢疫性病毒。其傳播主要是通過 帶毒種子遠距離傳播，介體、汁液和被病殘體污染的土壤等也能傳毒。目前在我國廣西、遼 寧、北京、河北、甘肅、山東、湖南、上海等多個地區(qū)均檢測到CGMMV的發(fā)生，并呈擴展蔓延趨 勢，對葫蘆科蔬菜和瓜果的生產(chǎn)造成重要經(jīng)濟損失。
[0003] 植物病毒侵染性克隆的獲得是研究病毒基因功能的前提，運用構(gòu)建的侵染性克隆 很容易通過基因交換、突變、缺失、插入、重組等實驗來分析病毒基因的功能，鑒定病毒基因 在侵染植株中產(chǎn)生的效應(yīng)。1983年首次在雀麥花葉病毒η>?5·，BMV)中獲 得第一例有侵染活性的植物RNA病毒cDNA克隆。隨后該技術(shù)迅速發(fā)展，目前主要構(gòu)建策略 有攜帶T7、SP6或T3等原核啟動子控制的侵染性克隆和由花椰菜花葉病毒 mosaic CaMV) 35S啟動子控制的侵染性克隆兩種。本發(fā)明在獲得黃瓜綠斑駁花葉 病毒基因組全序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了該病毒的侵染性克隆。將包含35S啟動子的黃瓜綠斑 駁花葉病毒cDNA序列構(gòu)建入雙元載體pCB301-CH中，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化后在寄主體內(nèi)轉(zhuǎn) 錄、復制、侵染，以用于病毒的功能基因組研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是提供黃瓜綠斑駁花葉病毒 (Cl/camfer mosaic CGMMV)的侵染性克隆載體及其制備方法,本發(fā)明 的第二個目的是提供攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株及其應(yīng)用。
[0005] 為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 黃瓜綠斑駁花葉病毒（Ci/cttwAer mosaic Firw1S, CGMMV)的侵染性克隆 載體，該侵染性克隆載體由黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶 Rz的載體PCB301-CH制備得到，所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列如Seq ID No: 12 所示。
[0006] 上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，該方法包括以下的步 驟： 1) 獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列； 2) 設(shè)計引物 pCass-CH-CGMMV(+)， pCass-CH-CGMMV (-)， CGMMV3145(+)和引物 CGMMV3145 (-);分別以引物對 pCass-CH-CGMMV (+) /CGMMV3145 (-)和引物對 CGMMV3145 (+) / pCass-CH-CGMMV (-)分兩段擴增 CGMMV 全序列；所述的引物 pCass-CH-CGMMV (+)， pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV3145 (+)和引物 CGMMV3145 (-)的基因序列分別為 Seq ID No:10, Seq ID No:11, Seq ID No:8, Seq ID No:9 ； 3) 將純化的擴增目的片段與經(jīng)Stu I和Sma I雙酶切的pCB301-CH載體進行重組反 應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出具有正確CGMMV 基因組全序列的克??； 4) 提取包含CGMMV全長質(zhì)粒的克隆，獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體 pCB301-CGMMV。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的步驟1)中黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列獲得包括以下的步 驟： I. 1)植物總RNA的提取：采用Trizol法提取病葉的總RNA ; I. 2)CGMMV 5'-末端和3'-末端序列的擴增：根據(jù)GenBank上發(fā)表的CGMMV基因組全 序列，GenBank登錄號NC_001801，設(shè)計引物CGMMV 682(-)、CGMMV 1218(-)和CGMMV CP(+)， 引物分別為369 10吣：1、569 10吣:2和569 10吣:3，以3六?/^6麗￥〇卩(+)為引物進行 3' -RACE，獲得完整3' -末端序列；5' -末端序列的獲得首先以5AP/CGMMV 1218 (-)進行第 一輪擴增，然后以該PCR擴增產(chǎn)物為模板，以5AP/CGMMV 682(-)為引物做巢式PCR進行第 二輪擴增，獲得完整5' -末端序列； 1. 3)經(jīng)5' -RACE和3' -RACE確定了 CGMMV分離物的5' -末端和3' -末端的序列后， 設(shè)計引物06麗￥〇)厘(+)、〇6麗￥2251 (+)、〇6麗￥3526(-)和〇6麗￥〇)厘(-)，序列分別為569 10 No:4、Seq ID No:6、Seq ID No:5 和 Seq ID No:7;以引物對 CGMMVC0M(+)/CGMMV3526(_) 和CGMMV2251 (+) /CGMMV COM(-)分兩段擴增CGMMV序列；擴增的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)測序拼 接獲得CGMMV的全序列。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的步驟I. 3)PCR擴增體系為：9μ L DEPC水、25μ L 2X PCR Buffer for KOD FX NeoUOyL 2 mM dNTPs、上下游引物（ΙΟμΜ)各 1.5yL、2yL cDNA模 板、1 μ L K0D-FX-NE0聚合酶，總反應(yīng)體系為50 μ L ;各片段的反應(yīng)條件為：94 °C 2min; 94 °C 15 s, 6(TC 30 s, 68 °C 3.5min, 35 個循環(huán)；68 °C lOmin。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的步驟3)中重組反采用IOyL體系反應(yīng)，其中5 X CE MultiS Buffer 2yL，StuI和Sma I雙酶切線性化克隆載體pCB301-CH 120ng，片段 P35SCGMMV3164 60ng，片段pCGMMV3145-RZ 66ng，Exnase?MultiS Ιμ?,最后用 ddH20,調(diào) 整體系至10 μ L。
[0010] 為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株，該農(nóng)桿菌菌株由權(quán)利要求1所述 的導入到農(nóng)桿菌菌株ΕΗΑ105獲得。
[0011] 上述的攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株的應(yīng)用，該應(yīng)用用于黃 瓜綠斑駁花葉病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有以下優(yōu)勢： 1、 提供的農(nóng)桿菌菌株可以大量產(chǎn)生黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克?。?2、 該侵染性克隆只侵染植物，不侵染昆蟲，也不感染動物和人，相對安全； 3、 利用發(fā)明提供的侵染性克隆能高效侵染多種葫蘆科、茄科植物，操作簡單，重復性 好； 4、 利用本發(fā)明提供的侵染性克隆可有效用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的致病性分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1表達載體pCB301-CGMMV擴增構(gòu)建示意圖。
[0014] 圖2 pCB301-CGMMV接種本氏煙、瓠瓜、西瓜和黃瓜后系統(tǒng)葉的癥狀表現(xiàn)；a: PCB301-CGMMV接種本氏煙10天后癥狀；b: pCB301-CGMMV接種瓠瓜10天后癥狀；c: PCB301-CGMMV接種西瓜10天后癥狀；d: pCB301-CGMMV接種黃瓜20天后癥狀。
[0015] 圖3 pCB301-CGMMV接種本氏煙、瓠瓜、西瓜和黃瓜后的Dot-ELISA檢測結(jié)果。
[0016] 圖4 pCB301-CGMMV接種本氏煙、瓠瓜、西瓜和黃瓜后的PCR檢測結(jié)果；M :Trans2K Plus DNA Marker ;1 :陽性對照；2 :陰性對照；3 :本氏煙；4 :瓢瓜；5 :西瓜；6 :黃瓜。

【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明所提供的實施例均按照常規(guī)實驗條件，其中所采用的引物序列如表1。
[0018] 表I CGMMV 5' -RACE、3' -RACE及全序列擴增引物

【權(quán)利要求】
1. 黃瓜綠斑駁花葉病毒（gree/? mosaic Firys，CGMMV)的侵染性克 隆載體，其特征在于：該侵染性克隆載體由黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列融合到帶35S 啟動子和核酶Rz的載體PCB301-CH制備得到，所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列如 Seq ID No: 12 所示。
2. 攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株，其特征在于：該農(nóng)桿菌菌株由 權(quán)利要求1所述的導入到農(nóng)桿菌菌株EHA105獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征 在于該方法包括以下的步驟： 1) 獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列； 2) 設(shè)計引物 pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV：3145(+)和引物 CGMMV3145 (-);分別以引物對 pCass-CH-CGMMV (+) /CGMMV3145 (-)和引物對 CGMMV3145 (+) / pCass-CH-CGMMV (-)分兩段擴增 CGMMV 全序列；所述的引物 pCass-CH-CGMMV (+)， pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV3145 (+)和引物 CGMMV3145 (-)的基因序列分別為 Seq ID No:10, Seq ID No:11, Seq ID No:8, Seq ID No:9 ； 3) 將純化的擴增目的片段與經(jīng)Stu I和Sma I雙酶切的pCB301-CH載體進行重組反 應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出具有正確CGMMV 基因組全序列的克?。? 4) 提取包含CGMMV全長質(zhì)粒的克隆，獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體 pCB301-CGMMV。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征 在于：步驟1)中黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV全序列獲得包括以下的步驟： 1. 1)植物總RNA的提?。翰捎肨rizol法提取病葉的總RNA ; 1. 2)CGMMV 5'-末端和3'-末端序列的擴增：根據(jù)GenBank上發(fā)表的CGMMV基因組全 序列，GenBank登錄號NC_001801，設(shè)計引物CGMMV 682(-)、CGMMV 1218(-)和CGMMV CP(+)， 引物分別為 Seq ID No: 1、Seq ID No:2 和 Seq ID No:3,以 3AP/CGMMV CP(+)為引物進行 3' -RACE，獲得完整3' -末端序列；5' -末端序列的獲得首先以5AP/CGMMV 1218 (-)進行第 一輪擴增，然后以該PCR擴增產(chǎn)物為模板，以5AP/CGMMV 682(-)為引物做巢式PCR進行第 二輪擴增，獲得完整5' -末端序列； 1. 3)經(jīng)5' -RACE和3' -RACE確定了 CGMMV分離物的5' -末端和3' -末端的序列后， 設(shè)計引物〇6麗￥〇)1(+)、〇6麗￥2251 (+)、〇6麗￥3526(-)和〇6麗￥〇)1(-)，序列分別為569 10 No:4、Seq ID No:6、Seq ID No:5 和 Seq ID No:7;以引物對 CGMMVC0M(+)/CGMMV3526(_) 和CGMMV2251 (+) /CGMMV COM(-)分兩段擴增CGMMV序列；擴增的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)測序拼 接獲得CGMMV的全序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其特征 在于：步驟 1.3)PCR 擴增體系為：9iiL DEPC 水、25iiL 2X PCR Buffer for KOD FX Neo、 10 ii L 2 mM dNTPs、上下游引物（10 ii M)各 1. 5 ii L、2 ii L cDNA 模板、1 ii L KOD-FX-NEO 聚 合酶，總反應(yīng)體系為50iiL;各片段的反應(yīng)條件為：94 °C 2min; 94 °C 15 s，60°C 30 s， 68 °C 3.5min, 35 個循環(huán)；68 °C lOmin。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，其 特征在于：步驟3)中重組反采用lOiiL體系反應(yīng)，其中5 X CE MultiS Buffer 2iiL， StuI和Sma I雙酶切線性化克隆載體pCB301-CH 120ng，片段p35SCGMMV3164 60ng，片段 PCGMMV3145-RZ 66ng，Exnase? MultiS 1 ii 1，最后用 ddH20 調(diào)整體系至 10 ii L。
7.權(quán)利要求2所述的攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌株的應(yīng)用，其特 征在于該應(yīng)用用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
【文檔編號】C12N1/21GK104498521SQ201410706857
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】燕飛, 鄭紅英, 肖彩利, 韓科雷, 魯宇文, 林林, 陳劍平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院