專利名稱：同步檢測百合斑駁病毒、百合無癥病毒和黃瓜花葉病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種同步檢測侵染百合的百合斑駁病毒(LMoV)、百合無癥病毒(LSV)以及黃瓜花葉病毒(CMV)三種主要病毒的多重RT-PCR方法，屬植物保護領域。
背景技術：
百合是集觀賞、食用、藥用于一身的重要經(jīng)濟作物，尤其是切花百合顏色鮮艷、氣質(zhì)高雅，并帶有獨特的香味，已成為國際上最重要的觀賞花卉之一，具有很高的經(jīng)濟價值。近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，對鮮切花特別是百合的需求量不斷增加，百合的種植規(guī)模日益擴大。然而由于不規(guī)范的生產(chǎn)方式及長期無性繁殖使病毒不斷積累，百合的病毒病害發(fā)生日趨嚴重，極大的降低了百合的產(chǎn)量和品質(zhì)，給百合種植業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)報道侵染百合的病毒有10多種，分布廣，危害大，為害嚴重的主要有百合斑駁病毒(LMoV)、百合無癥病毒(LSV)和黃瓜花葉病(CMV)等，而且這三種病毒常復合侵染，引起葉片花葉、壞死、畸形及花朵碎色等癥狀，嚴重地降低了百合的商品性和觀賞性。通常百合病毒的感染率在30-40％，有的高達100％，給百合造成的危害更大。到目前為止，國際上尚無治療病毒病害的特效藥劑，因此百合病毒檢測尤其是對三種主要病毒的檢測和監(jiān)測，對于識別病毒病害和防止病毒的傳播流行具有重要的實際意義，是生產(chǎn)上對百合病毒病害進行綜合治理的重要措施之一。
通常檢測百合病毒的方法有指示植物法、電鏡技術、酶聯(lián)免疫吸附技術和分子生物學技術等。相比較而言，指示植物法雖然簡單，但是檢測周期長，最短也要10～20天，而且靈敏度非常低，還受到季節(jié)、環(huán)境以及病毒性質(zhì)等方面的影響，因此已經(jīng)很少用于百合病毒的檢測。免疫電鏡的出現(xiàn)極大的促進了電鏡技術在百合病毒檢測方面的應用，但是電子顯微鏡價格昂貴，制樣技術復雜，不易掌握，不適合作為百合病毒檢測的普通方法。目前應用最為廣泛的檢測百合病毒的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和分子生物學技術。較之指示植物法和電鏡技術，ELISA方法檢測周期較短，靈敏度高，可以檢測到納克(ng)級水平的病害。分子生物學技術，特別是RT-PCR技術不但操作簡單，而且特異性、靈敏度較ELISA方法高，可以檢測到飛克(fg)級水平的病毒。但是ELISA方法和普通RT-PCR的方法每次只能檢測一種病毒，對于多種病毒復合侵染百合的情況，則需要針對每種病毒進行單獨檢測，既浪費時間，又加大了檢測成本的投入。此外，普通的RT-PCR擴增過程中對于每種病毒都需要分別設計上游和下游引物，導致檢測成本升高，而且提高了非特異性檢測的發(fā)生幾率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)方法在檢測多種病毒復合侵染百合的不足，提供了一種同步、快速、靈敏、特異的檢測百合上發(fā)生的LMoV、LSV和CMV三種病毒的方法。
本發(fā)明的步驟是1)設計引物(a)設計檢測LMoV、LSV兩種病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)設計檢測LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)設計檢測CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)確定每對引物擴增片段大小
2)總RNA提取(a)稱取百合葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨，研磨液倒入1.5mL離心管中；(b)加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(c)12,000rpm離心10min；(d)上清移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(e)12,000rpm離心10min；(f)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR(a)RNA變性RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混勻，70℃保溫10min，之后迅速冰?。?b)反轉(zhuǎn)錄向上述管中按以下體系加入試劑，振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表體系加入各試劑
設置PCR程序為94℃4min，94℃1min、53℃～60℃1min、72℃2min，擴增25～40個循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測配制0.8％～2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)檢測結(jié)果分析根據(jù)電泳膠上擴增條帶的有無及大小確定百合感染的病毒種類；通過觀察，若凝膠中存在大小為1153bp的核酸片段，則說明樣品中含有LMoV；若凝膠中存在大小為736bp的核酸片段，則說明樣品中含有LSV；若凝膠中存在大小為590bp的核酸條帶，則說明樣品中含有CMV。
其中，所述的PCR退火溫度為53℃～60℃，也可以為56℃～58℃；所述的PCR循環(huán)可以為25～40個循環(huán)，也可以為26～29個循環(huán)；所述的瓊脂糖濃度可以為0.8％～2％，也可以為0.9％～1.2％。
本發(fā)明的有益效果是能夠極大的節(jié)約時間和成本。由于LMoV和LSV序列的3’端均帶有一個poly(A)結(jié)構(gòu)，因此可以據(jù)此設計一條帶Oligo d(T)的引物作為同時檢測LMoV和LSV共用的下游通用引物，減少了引物的數(shù)量，而且極大的降低了引物間的相互作用，而且增加了檢測的特異性。此外，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)RT-PCR一個體系一次只能檢測一種病毒的局限，在一個體系中可以同時檢測三種病毒，與傳統(tǒng)RT-PCR相比，最多能夠節(jié)約三分之二的檢測時間和試劑成本。
圖1是百合斑駁病毒、百合無癥病毒和黃瓜花葉病毒的電泳檢測圖。
具體實施例方式實例一以已知的復合感染了LMoV、LSV和CMV三種病毒的百合植株為材料，以健康百合植株為陰性對照，用本方法進行檢測。
1)設計引物(a)設計檢測LMoV、LSV兩種病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)設計檢測LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)設計檢測CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)確定每對引物擴增片段大小
2)總RNA提取(a)稱取百合葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨，研磨液倒入1.5mL離心管中；(b)加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(c)12,000rpm離心10min；(d)上清移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(e)12,000rpm離心10min；(f)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR(a)RNA變性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混勻，70℃保溫10min，之后迅速冰浴；(b)反轉(zhuǎn)錄向上述管中按以下體系加入試劑，振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表體系加入各試劑
設置PCR程序為94℃4min，94℃1min、58℃1min、72℃2min，擴增29個循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測配制1.2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)電泳檢測結(jié)果感染了LMoV、LSV和CMV三種病毒的百合葉片中檢測出了1153bp、736bp和590bp的三條核酸條帶，說明通過本發(fā)明可同步檢測出LMoV、LSV和CMV三種病毒；健康對照中未檢測到任何條帶，說明不含有這三種病毒任何一種。
實例二以已知的分別感染了LMoV、LSV或CMV的百合植株進行檢測，并以健康百合為陰性對照。
1)設計引物
(a)設計檢測LMoV、LSV兩種病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)設計檢測LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)設計檢測CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)確定每對引物擴增片段大小
2)總RNA提取(a)稱取百合葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨，研磨液倒入1.5mL離心管中；(b)加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(c)12,000rpm離心10min；(d)上清移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(e)12,000rpm離心10min；(f)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR(a)RNA變性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混勻，70℃保溫10min，之后迅速冰??；(b)反轉(zhuǎn)錄向上述管中按以下體系加入試劑，振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表體系加入各試劑
設置PCR程序為94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃2min，擴增26個循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測配制0.9％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)電泳檢測結(jié)果在單獨感染了LMoV的百合中檢測到了大小為1153bp的核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以特異的檢測出LMoV；在單獨感染了LSV的百合中檢測到了大小為736bp的核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以特異檢測出LSV；在單獨感染了CMV的百合中檢測到了590bp的核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以特異檢測出CMV；健康對照中沒檢測出任何條帶，說明該樣品種不含這三種病毒任何一種。
實例三以已知的復合感染了LMoV和LSV的百合植株、復合感染了LSV和CMV的百合植株以及復合感染了LMoV和CMV的百合植株為材料，以健康百合植株為陰性對照，用本方法進行檢測。
1)設計引物(a)設計檢測LMoV、LSV兩種病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)設計檢測LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)設計檢測CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)確定每對引物擴增片段大小
2)總RNA提取(a)稱取百合葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨，研磨液倒入1.5mL離心管中；(b)加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(c)12,000rpm離心10min；(d)上清移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(e)12,000rpm離心10min；(f)棄上清，沉淀用1mL70％乙醇洗滌，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR(a)RNA變性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混勻，70℃保溫10min，之后迅速冰?。?b)反轉(zhuǎn)錄向上述管中按以下體系加入試劑，振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表體系加入各試劑
設置PCR程序為94℃4min，94℃1min、57℃1min、72℃2min，擴增28個循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測配制1％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)電泳檢測結(jié)果在復合感染了LMoV和LSV的百合中檢測到了1153bp和736bp的兩條核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以同步檢測出LMoV和LSV兩種病毒；在感染了LSV和CMV兩種病毒的葉片中檢測到了736bp和590bp的兩條核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以同步檢測出LSV和CMV兩種病毒；在感染了LMoV和CMV兩種病毒的百合葉片中檢測到了1153bp和590bp的兩條核酸條帶，說明通過本發(fā)明可以同步檢測出LMoV和CMV兩種病毒；在健康對照中未檢測到任何條帶，說明該樣品種不含有這三種病毒任何一種。
利用此方法在不同情況下對百合斑駁病毒(LMoV)、百合無癥病毒(LSV)和黃瓜花葉病毒(CMV)進行了檢測。從實驗結(jié)果看出，無論是在一種病毒單獨侵染，還是在兩種或是三種病毒復合侵染的情況下，均能在電泳圖中特定位置檢測到相應的病毒擴增產(chǎn)物，而且陰性對照無非特異性結(jié)果發(fā)生，因此該方法可以被應用于百合植株上發(fā)生的LMoV、LSV和CMV三種主要病毒的同步檢測。
權利要求
1.一種同步檢測LMoV、LSV和CMV三種病毒的方法，其步驟如下1)設計引物(a)設計檢測LMoV、LSV兩種病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)設計檢測LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)設計檢測CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)確定每對引物擴增片段大小
2)總RNA提取(a)稱取百合葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨，研磨液倒入1.5mL離心管中；(b)加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(c)12,000rpm離心10min；(d)上清移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(e)12,000rpm離心10min；(f)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR(a)RNA變性RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混勻，70℃保溫10min，之后迅速冰??；(b)反轉(zhuǎn)錄向上述管中按以下體系加入試劑，振蕩混勻，室溫放置10min，42℃保溫1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表體系加入各試劑
設置PCR程序為94℃ 4min，94℃ 1min、53℃～60℃ 1min、72℃ 2min，擴增25～40個循環(huán)，72℃延伸10min后4℃保存；4)電泳檢測配制0.8％～2％的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液環(huán)境中，150V穩(wěn)壓電泳90min，之后取出凝膠浸泡在0.5μg/mL溴化乙錠中染色10min，然后在紫外燈下觀察并記錄結(jié)果；5)檢測結(jié)果分析根據(jù)電泳膠上擴增條帶的有無及大小確定百合感染的病毒種類；通過觀察，若凝膠中存在大小為1153bp的核酸片段，則說明樣品中含有LMoV；若凝膠中存在大小為736bp的核酸片段，則說明樣品中含有LSV；若凝膠中存在大小為590bp的核酸條帶，則說明樣品中含有CMV。
2.根據(jù)權利要求1所述的同步檢測LMoV、LSV和CMV三種病毒的方法中所用的PCR擴增方法，其特征是退火溫度為56℃～58℃。
3.根據(jù)權利要求1所述的同步檢測LMoV、LSV和CMV三種病毒的方法中所用的PCR擴增方法，其特征是擴增26～29個循環(huán)。
4.根據(jù)權利要求1所述的同步檢測LMoV、LSV和CMV三種病毒的方法中所用的電泳檢測方法，其特征是配制的瓊脂糖凝膠的濃度為0.9％～1.2％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同步檢測百合斑駁病毒(LMoV)、百合無癥病毒(LSV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的方法，屬植物保護領域。其方案是，通過提取總RNA、多重RT－PCR以及電泳檢測等步驟，在同一反應管及同一個熱循環(huán)條件下對百合感染的LMoV、LSV和CMV三種病毒中的1～3種進行擴增，并通過凝膠電泳進行分離和檢測。該方法除了具有普通RT－PCR具有的快速、特異、靈敏的優(yōu)點外，主要是實現(xiàn)了三種病毒同步檢測，降低了成本。
文檔編號C12Q1/02GK1793858SQ20051004872
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2005年12月22日
發(fā)明者李凡, 孫健, 陳海如, 李正躍, 王鈺麗, 劉云龍, 范靜華, 姬廣海, 孔寶華, 王揚, 楊斌, 蔣小龍, 白松, 蔡紅, 胡先奇 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學