專利名稱：黃瓜中基因地鏈接煙草花葉病毒抗性的標記及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子標記，其基因地鏈接黃瓜植株(Cucumis sativus L.)基因組 中的基因位點，且能鑒別基因位點，該基因組授予對煙草花葉病毒的通常抗性，特別是對兩 個在商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒有抗性，即，黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果 實斑駁花葉病毒(CFMMV)。本發(fā)明還涉及用于向黃瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株部位和果實提供對煙 草花葉病毒的抗性，特別是對兩個商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒，即，黃瓜綠斑駁花葉病 毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜植株(即，植株學品種Cucumis sativus的植株)屬于葫蘆科的葫蘆屬家族， 也包括了像甜瓜和南瓜這樣的家族成員。該植株的可食用果實通常被稱為黃瓜。黃瓜通常是圓柱形、綠色皮的果實，包括大 約96%的水。已被種植很久的黃瓜植株Cucumis sativus L.是一種世界范圍內(nèi)的重要的 園藝作物。黃瓜一般在未成熟的時期收獲，且被用在腌菜行業(yè)或新鮮市場中。感染葫蘆科的煙草花葉病毒可分為兩個亞組亞組I包括在文獻里表示為黃 瓜綠斑駁花葉病毒的株系和隔離群(CGMMV，包括株系CV3，CV4，CGMMV-ff, CGMMV-SH和 CGMMVV-Is)，亞組II包括黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)，Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)， 以及與KGMMV密切相關(guān)并可能被認為是它的一個株系(Antigus，2001年)的CGMMV的Yodo 株系。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是一種造成葫蘆科嚴重疾病的煙草花葉病毒屬的 RNA病毒。CGMMV株系最先由英國和歐洲報道(Ainsworth，1935年)。該病毒出現(xiàn)在所有組 織中(Hollings，1975年)，并且該病毒迅速在工人手中、服裝、刀和其他設(shè)備上傳播，且是 種傳的。種子的熱處理一般用來控制種子的病毒污染(Kim，2003年)。CGMMV還可以通過 地表水傳播(Drost，1988)。變黃、長斑、葉片向下卷曲的癥狀已被報導，但也許最有意義的是中重度的果實長 斑和變形的報道。果實的這種長斑和變形能夠迅速使受感染的作物滯銷。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)也許是感染黃瓜作物的最廣泛和最有名的煙草花 葉病毒。在如荷蘭、西班牙(Celix，1996年)、希臘(Varveri，2002年)和印度(Rashmi, 2005年)的黃瓜生產(chǎn)區(qū)域，CGMMV是一個全球性的問題。產(chǎn)量損失可能為15% (Fletcher, 1962年)。已做了尋找對CGMMV在黃瓜中的抗性的嘗試(Hsiao，1993年)，并且已發(fā)現(xiàn)一些 來源亞洲的無癥狀品種(Kooistra，1968年)。CFMMV是造成黃瓜植株(Cucumis sativus L)重大經(jīng)濟損失的煙草花葉病毒的另 一個家族成員。黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)感染通常在一個相對在前的生長階段里， 首先在果實和頂部葉子上被識別出。葉子癥狀包括嚴重的花葉病、脈結(jié)病和黃色斑紋。在某些例子中，充分生長的植株顯示導致植株倒塌的嚴重萎蔫癥狀。在溫室里的快速的病毒 傳播可能導致嚴重的作物損失。考慮到在黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中由煙草花葉病毒造成的經(jīng)濟損害，特 別是CGMMV和CFMMV，包括它們的變種，高度期望的是，提供基因地鏈接至煙草花葉病毒的 基因抗性位點，或質(zhì)量性狀位點(QTLs)，并能夠鑒別的基因標記，并且把這種煙草花葉病毒 抗性轉(zhuǎn)移到經(jīng)濟上重要的Cucumis sativus L.品種。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的之一是提供這樣的基因標記。根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于提供煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株 (Cucumis sativus L.)的方法,包括(a)在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中鑒別煙草花葉病毒的抗性基因位占.
^ \\\ (b)將鑒別的煙草花葉病毒的抗性基因位點轉(zhuǎn)移進第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述第二黃瓜植株(Cucumis sativusL.)授予煙草花葉病毒的抗 性；其中煙草花葉病毒的抗性基因位點的特征在于在一個分子擴增片段長度多態(tài)性 (AFLP)實驗中，利用分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ IDNo :1和SEQ ID No :2，出 現(xiàn)241到251bp的核酸擴增片段。根據(jù)本發(fā)明，引物SEQ ID No 1 包括核酸序列 5-GAC TGC GTA CCA ATTCGT-3‘， 引物 SEQ ID No 2 包括核酸序歹Ij 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACAC-3‘。基因地鏈接并能夠鑒別本煙草花葉病毒的抗性基因位點的分子擴增片段多態(tài)性 (AFLP)標記也指定為標記E22/M48-F-246(當用引物SEQ ID No :1和2時，核酸AFLP的擴 增片段的尺寸241-251bp，優(yōu)選地245-247bp，最優(yōu)選地246bp)。根據(jù)本發(fā)明的第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)可以是任何一個對煙草花葉 病毒，尤其是對CGMMV和CFMMV具有抗性顯型的黃瓜植株(Cucumissativus L.)，該抗性顯 型通過由如上限定的核酸擴增片段(Marker E22/M48-F-246)的出現(xiàn)鑒別的基因位點來授予。核酸擴增片段，或分子AFLP標記E22/M48-F-246，從而授予基因位點的抗性的出 現(xiàn)，可通過任何適合的分子生物學技術(shù)，如凝膠電泳，雜交，親和層析，熒光等，利用分析核 酸擴增產(chǎn)物來建立。在一個具體的優(yōu)選實施例中，片段利用在現(xiàn)有技術(shù)中指定為分子擴增片斷長度多 態(tài)性(AFLP，Zabeau，1993，and Vos，1995)的核酸擴增和檢測技術(shù)來擴增和鑒別。擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是一種以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的基因指紋技 術(shù)，是由Keygene于二十世紀90年代初開發(fā)的。AFLP用限制性內(nèi)切酶來酶切基因DNA，接 著把互補的雙鏈接頭與限制片段末端結(jié)扎。然后限制片段的子集利用補充接頭和限制位置 片段的引物對來擴增。片段通過放射自顯影或熒光方法在聚丙烯酰胺凝膠上被觀測到。這通常產(chǎn)生了許多不同尺寸的核酸擴增片段。通過比較從例如敏感性植株和抗性 植株獲得的核酸擴增片段，區(qū)別核酸擴增片段能夠在兩種顯型之間被鑒別，也能夠指定為
5標記。在目前情況下，基因地鏈接并能夠鑒別當前抗性位點的指定為AFLP標記E22/ M48-F-246的特定的AFLP標記基因是由241_251bp的核酸擴增片段的出現(xiàn)來鑒別的，優(yōu)選 245-247bp，最優(yōu)選246bp。該標記僅出現(xiàn)在抗性個體中許多未區(qū)別的其他AFLP擴增片段 中，但在敏感性個體中不出現(xiàn)。應(yīng)該注意的是，為了鑒別在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里的煙草花葉病 毒的抗性基因位點，利用AFLP引物SEQ ID No 1和2進行的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的AFLP分析，能夠產(chǎn)生與目前的AFLP標記E22/M48-F-246相差2bp的第二核酸擴增片 段。根據(jù)本發(fā)明，這個更大(2bp)的核酸擴增片段未基因地鏈接并能夠鑒別當前的煙草花 葉病毒的抗性基因位點基因。換言之，當利用AFLP和AFLP引物SEQ ID No :1和2分析時，目前的第一黃瓜植株 (Cucumis sativus L.) 一定產(chǎn)生標定尺寸的AFLP E22/M48-F-246標記，但另外也產(chǎn)生了較 大尺寸(2bp)的第二核酸擴增片段。只產(chǎn)生AFLP標記E22/M48-F-246或產(chǎn)生AFLP標記E22/M48-F-246，和附加地第二 略大(2bp)的片段的兩種第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)都包含在本發(fā)明中。然而， 只產(chǎn)生第二略大(2bp)的片段的第一黃瓜植株(Cucumissativus L.)未包含在本發(fā)明中。考慮到上述情況，第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的當前選擇本身包括了利 用分子生物學技術(shù)在該植株中檢測煙草花葉病毒的抗性基因位點。這是因為基因地鏈接 AFLP標記E22/M48-F-246的當前的煙草花葉病毒的抗性位點不能只利用對傳統(tǒng)育種技術(shù) 普遍的以顯型為基礎(chǔ)的選擇來建立。換言之，在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別煙草花葉病毒的抗性基因 位點不涉及利用單一的傳統(tǒng)選擇工藝。在根據(jù)本發(fā)明在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別煙草花葉病毒的抗 性基因位點之后，基因位點被轉(zhuǎn)移進第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述 第二個黃瓜植株(Cucumis sativus L.)授予煙草花葉病毒抗性。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移當前的煙草花葉病毒的抗性基因位點包括諸如傳統(tǒng)的把第一黃瓜植 株(Cucumis sativus L.)與第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)雜交、接下來一個或多 個子代與第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)回交的傳統(tǒng)育種方法。然而，這種傳統(tǒng)育種 方法優(yōu)選地與分子生物學技術(shù)共同協(xié)作，以便在第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里建 立當前抗性基因位點的保持。相對于傳統(tǒng)育種技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明當前的AFLP標記E22/M48-F-246的提供允許在 每次回交步驟后合適的煙草花葉病毒的抗性子代的迅速選擇，從而避免了繁瑣和昂貴的篩 選方法，例如在每代上病毒感染和建立一個抗性顯型，以便鑒別合適的煙草花葉病毒的抗 性子代。在一個優(yōu)選的實施例中，第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)是煙草花葉病毒 敏感性的商業(yè)品種。通過轉(zhuǎn)移當前的抗性基因位點進該植株，而保持其他的商業(yè)上有價 值的高品質(zhì)的基因型和顯型特征，從而提供了一個有更高經(jīng)濟價值的黃瓜植株(Cucumis sativus L)ο在一個最優(yōu)選的實施例中，當前的方法提供了一種具有含有第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的煙草花葉病毒的抗性基因位點的第二黃瓜植株(Cucumissativus L.)的基因型的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)。因此，根據(jù)第二方面，本發(fā)明還涉及包 括含有煙草花葉病毒的抗性基因位點的煙草花葉病毒敏感性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)品種的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點的特征在 于在一個分子擴增片段長度多態(tài)性實驗里，利用分子擴增片段多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1禾口 SEQ ID No 2擴增，出現(xiàn)241_251bp、優(yōu)選245_247bp、最優(yōu)選246bp的核酸擴增片 段。。在一個優(yōu)選實施例里，煙草花葉病毒抗性，從而根據(jù)本發(fā)明的煙草花葉病毒抗性 基因位點，至少授予對黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的 抗性。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及用于提供煙草花葉病毒的抗性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的煙草花葉病毒的抗性基因位點的用途，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點 特征如上所限定的。根據(jù)本發(fā)明的該第三方面，煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑駁花葉病毒 (CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。根據(jù)第四方面，本發(fā)明涉及煙草花葉病毒的抗性基因位點，其特征在于在分子擴 增長度多態(tài)性實驗中，利用核酸擴增片段長度多態(tài)性(ADLP)引物SEQID No :1和SEQ ID No 2的241-251bp核酸擴增片段。優(yōu)選地，當前的煙草花葉病毒的抗性基因位點的特征是一個245_247bp的AFLP核 酸擴增片段。最優(yōu)選地，當前的煙草花葉病毒的抗性基因位點是一個246bp的AFLP核酸擴增片 段。應(yīng)當注意的是，僅利用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2、表示為AFLP核酸擴增片段的基因位點比上述片段略大(2bp)，不包含在本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明的該第四方面，煙草花葉病毒的抗性優(yōu)選地包括黃瓜綠斑駁花葉病毒 (CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
具體實施例方式本發(fā)明將在下述實施例中被進一步說明。實施例1 敏感性和抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的鑒別介紹以下的實驗計劃用來將黃瓜植株(Cucumis sativus L.)分類為對黃瓜綠斑駁花 葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)感染有敏感性或抗性。至少在荷蘭，實 施分析的最佳時間是從9月到4月。植株原料被測試的植株(Cucumis sativus L.)，包括抗性植株與敏感性植株，被播種在中 等尺寸的蛭石里，且在24°C下生長，覆蓋小尺寸的蛭石。在4到5天后(子葉剛展開)，幼 苗被轉(zhuǎn)移到石棉塊上，且在2天后，植株被轉(zhuǎn)移到隔離的溫室里。在40個個體的每個塊之后，優(yōu)選地在將其放進隔離的溫室4天后，敏感性控制 Tyria Fl (Enza Zaden的商業(yè)Fl黃瓜品種，荷蘭)作為敏感性控制，并且幼苗被嫁接在子葉
7上。病原CGMMV和CFMMV的隔離種群被準備。簡單的說，準備接種體(inoculi)，新鮮的磷 酸鹽緩沖液(0. IM磷酸鹽溶液，pH值為7. 7)。從癥狀最近發(fā)展的感染的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)上摘取葉子原料。帶清楚癥狀的無莖的嫩葉子組織被采用。近1克的葉子原 料被用于5毫升的緩沖液。葉子原料被研磨，從而獲得病毒隔離種群。對于感染，當出現(xiàn)晴朗天氣時，如上生長的植株在感染一天前用覆蓋物遮蔭。在感 染一天后，移去覆蓋物。但是，在高的光強度的情況下，覆蓋物應(yīng)該再保留一天。在低濕度的 情況下，在感染后濕度能通過直接澆濕底盤來增加，以便防止子葉由于感染的傷害而枯萎。 溫度的要求是夜里18-20°C，白天22-25°C。植株通過雙粗棉布被金剛砂輕輕研磨。海棉被浸到接種體(inoculi)中，在整個 子葉的表面擦拭兩次。雖然病毒是穩(wěn)定的，感染時間應(yīng)該少于1小時。評估黃瓜植株的最先的兩個葉子沒有顯示癥狀(敏感性植株與抗性植株一樣)。從第 三到第四個葉子的階段，癥狀將很容易評價敏感性或抗性。實施例2 鑒別一個煙草花葉病毒抗性QTL的AFLP標記的鑒別介紹在這個例子里，利用由Keygene N.V(瓦黑寧恩，荷蘭)實施的一個巨量QTL分析 (BQA)，在抗性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中鑒別質(zhì)量性狀位點(QTL)。98個個體的 群體作為煙草花葉病毒抗性的標記研發(fā)被選擇?？偣?6個的AFLP引物組合在包含顯示對 煙草花葉病毒抗性的“極端顯型”的個體的兩個庫里被篩選。隨后，5個候選標記在12個抗 性和12個敏感性個體上被驗證。標記鑒定和驗證獲得130個植株的葉子原料98個個體的Cuc 1879-01 X 0K561群體為測試提供群 體，30個供方親體Cucl879-01的自交系和群體的父本系。DNA被分離，EcoRI/Msel模板被 生成。用引物組合E14/M59的130個植株的測試指紋被生成。在個體上的BQA和驗證通過在一個包含十個“極端抗性”個體的庫和一個包含十個“極端敏感性”個體的 庫上篩選總共96個引物組合來實施BQA。這個篩選產(chǎn)生下述候選標記的鑒別-E14/M58-F-169-P2-E22/M48-F-248/246 (雙等位基因)這些標記隨后在24個個體(12個抗性個體和12個敏感性個體)上被驗證。依據(jù) 這個驗證，被鑒別的候選標記被證實為鏈接煙草花葉病毒的抗性。在群體上候選標記的驗證在篩選96個引物組合和隨后的標記確認之后，一個推定的QTL能被鑒別。為了判 斷被鑒別的QTL是否真正是一個分離的QTL，執(zhí)行連鎖分析。標記(E14/M58-F-169-P2和雙等位基因標記E22/M48-F-248/246)在來自98個個 體的群體的46個額外的個體上被篩選。標記數(shù)據(jù)集被生成，并與在24個體上的驗證的標記數(shù)據(jù)集合并。根據(jù)這一分析，能斷定4個標記真正地鏈接一個QTL。用WinQTL制圖進行標記分析為了確定顯型和基因型之間的相關(guān)性，用WinQTL制圖軟件包分析標記數(shù)據(jù)集。對 于單個標記分析(SMA)，12個中的一個LOD的值被計算。對于區(qū)間映射(IM)，通過在顯型數(shù) 據(jù)上實施1000置換，95%的可靠閾值被計算，并確定為L0D0. 9。解釋差異的LOD值和百分 比被計算用于該 QTL (L0D 9 ；Exp. Var. 49. 5)。結(jié)論為了鑒別對煙草花葉病毒的抗性的QTL，一個BQA被實施?？偣?6個引物組合在 一個有十個“極端抗性”個體的巨量和一個有十個“極端敏感性”個體的巨量上被篩選。其 中之一是雙等位基因的候選標記在12個極端抗性和12個極端敏感性個體上以及在群體中 的48個其它個體上被驗證。通過使用一個BQA途徑鑒別了一個QTL區(qū)域。該QTL解釋了 50%的差異?；赥estPC ( 5個標記)，在30個抗性供體Cuc 1879-01的自交系里沒有異 質(zhì)性被鑒定出。實施例3 分子標記輔助的煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.) 的鑒別分子分析用標準的實驗計劃，從敏感性和抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中分離基 因原料，敏感性即顯示如上所述的一個或多個病毒感染癥狀。接下來，這個基因原料用適當?shù)南拗泼?EcoRI/Msel)消化，再結(jié)扎接頭之后，用 引物對 SEQNo :1 5-GAC TGC GTA CCA ATT CGT-3‘和 SEQIDNo 2 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3'或引物對 SEQID No 3 5' -GACTGC GTA CCA ATT CAT-3‘和 SEQID No 4 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACGT-3‘來進行 AFLP 核酸擴增。產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物通過電泳確定大小。在獨立黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的 基因中的AFLP標記的出現(xiàn)可被檢測出是不存在㈠或存在(+)。具體來說，當AFLP標記E14/M58-F-169 (不包含在本發(fā)明中，SEQ ID Nos 3和4) 出現(xiàn)時，一個約169bp的條帶被觀察到；當AFLP標記E22/M48-F-248 (不包含在本發(fā)明中， 引物SEQ ID No:3和4)出現(xiàn)時，約248bp的條帶被觀察到。具有約246bp估計尺寸的AFLP 標記E14/M48-F-246(包括在本發(fā)明中，引物SEQ ID No 3和4)，基因地與抗性顯型相關(guān)。結(jié)果被總結(jié)在下述的表1中。表1 在 AFLP 標記 E14/M58-F-169、E22/M48-F-246、E22/M48-F-248 和煙草花葉病 毒抗性顯型之間的相關(guān)性
權(quán)利要求
用于提供一種煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的方法，包括(a)在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別一個煙草花葉病毒的抗性基因位點；(b)轉(zhuǎn)移鑒別的煙草花葉病毒的抗性基因位點到第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)授予煙草花葉病毒的抗性；其中煙草花葉病毒的抗性基因位點的特征在于在一個分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)實驗中，利用分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No1和SEQ ID No2，出現(xiàn)241bp到251bp的核酸擴增片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸擴增片段是245到247bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中核酸擴增片段是246bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的方法，其中所述煙草病毒的抗性包括黃瓜綠斑 駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的方法，其中所述煙草花葉病毒抗性包括一個或 多個亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
6.用于提供煙草花葉病毒抗性黃瓜植株(Cucumissativus L.)的煙草花葉病毒抗性 基因位點的用途，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點的特征在于在一個分子擴增片段長 度多態(tài)性(AFLP)實驗中，利用分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，出現(xiàn)241到251bp的核酸擴增片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中核酸擴增片段是245到247bp。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用途，其中核酸擴增片段是246bp。
9.根據(jù)權(quán)利6到8中任一項所述的用途，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑 駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項所述的用途，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括一個 或多個亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
11.煙草花葉病毒的抗性基因位點，其特征在于在一個分子擴增片段長度多態(tài)性 (AFLP)實驗中，利用分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ IDNo :1和SEQ ID No :2，出 現(xiàn)241到251bp的核酸擴增片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點，其中核酸擴增片段是245 到 247bp。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點，其中核酸擴增片段是 246bp。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點，其中所述 煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV) 的抗性。
15.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點，其中所述煙 草花葉病毒的抗性包括一個或多個亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
16.一種黃瓜植株(Cucumis sativus L.)，包括煙草花葉病毒敏感性的黃瓜植株 (Cucumis sativus L.)品種的基因型，含有煙草花葉病毒的抗性基因位點，其中煙草花葉 病毒的抗性基因位點的特征在于在一個分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)實驗中，利用分子擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No 1和SEQ ID No :2，出現(xiàn)241到251bp的核 酸擴增片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植株，其中核酸擴增片段是245到247bp.
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的植株，其中核酸擴增片段是246bp.
19.根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項所述的植株，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括黃 瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
20.根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項所述的植株，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括一 個或多個亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
21.根據(jù)權(quán)利要求16到20的任一項所述的植株的種子、植株部位或果實。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子標記，其基因地鏈接黃瓜植株(Cucumis sativus L.)基因組中的基因位點，且能鑒別基因位點，該基因組授予對煙草花葉病毒的通?？剐?，特別是對兩個在商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒有抗性，即，黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)。本發(fā)明還涉及用于向黃瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株、植株部位和果實提供對煙草花葉病毒，特別是對兩個商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒，即黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實斑駁花葉病毒(CFMMV)，的抗性的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101939447SQ200880124547
公開日2011年1月5日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者亞普·馬澤雷羅烏, 南內(nèi)·法貝爾, 布賴特·范·坎彭, 羅納爾多·威爾特丁克 申請人:安莎種子公司