專利名稱：利什曼原蟲液體培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及黑熱病疫情監(jiān)測和黑熱病診斷的液體培養(yǎng)基技術(shù)領域，是一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
黑熱病是我國《傳染病法》規(guī)定的乙類傳染病之一，是由利什曼原蟲引起的一種自然疫源性寄生蟲病，白蛉是傳播媒介，患病的人和動物是主要傳染源；有些地方的傳染源和傳播媒介還沒有查明。2012年WHO報告，利什曼病包括黑熱病，廣泛分布于88個國家和地區(qū)，每年新增病例2百萬，總病例已達到I. 2億，有3. 5億人處在該病的威脅中。近些年全世界的黑熱病患者人數(shù)呈上升趨勢，我國和印度的黑熱病病人約占世界利什曼病的30%。隨著石油、農(nóng)業(yè)和旅游開發(fā)，進出疫區(qū)的人員日趨增加，增加了黑熱病向外擴散傳播的機會。由 于治療不徹底或治療方案不合理，抗藥性利什曼原蟲的分布范圍有擴大趨勢。培養(yǎng)分離利什曼原蟲不僅是判斷黑熱病的重要標準之一，而且是深入開展防治研究工作的基礎。3N培養(yǎng)基培養(yǎng)分離利什曼原蟲是世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國衛(wèi)生部黑熱病診斷標準推薦的培養(yǎng)基和培養(yǎng)分離技術(shù)。3N培養(yǎng)基為雙相培養(yǎng)基，下層為固體瓊脂凝膠，結(jié)冰融化后就不能使用，只能在0°C以上保存，有效期為30天。使用3N培養(yǎng)基培養(yǎng)分離利什曼原蟲，在亞洲黑熱病疫區(qū)，黑熱病患者的利什曼原蟲的檢出率不到20% ;在荒漠型黑熱病疫區(qū)，黑熱病患者的利什曼原蟲檢出率不到1%，出結(jié)果時間長達15天。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基及其制備方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決使用3N培養(yǎng)基培養(yǎng)分離利什曼原蟲的檢出率低、檢測出結(jié)果時間長和有效期短的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實現(xiàn)的一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2
0.2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟得到第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KCl,NaHC03> KH2PO3^CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變?yōu)榱咙S色,此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步,加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，然后將利什曼原蟲液體培養(yǎng)基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，_20°C保存。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進一步優(yōu)化或/和改進上述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實現(xiàn)的一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基的制備方法按下述步驟進行該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基含有NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640
10.4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟進行第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI_1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變?yōu)榱咙S色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為
0.4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，然后將利什曼原蟲液體培養(yǎng)基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中密閉保存。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進一步優(yōu)化或/和改進
上述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。本發(fā)明通過利什曼原蟲液體培養(yǎng)基培養(yǎng)疑似黑熱病病人的骨髓和腫大的動物脾臟，培養(yǎng)并分離利什曼原蟲，培養(yǎng)出利什曼原蟲的確定為黑熱病，具有出結(jié)果快、保存方便和有效期長的特點，提高了利什曼原蟲的分離率，為黑熱病臨床診斷、流行病調(diào)查和利什曼原蟲抗藥性研究提供依據(jù)。
具體實施例方式本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體的實施方式。實施例I :該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基含有NaCl 8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0.2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg, Hepes 4. 5g, RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100ml ;該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟得到第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用
0.IMol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變?yōu)榱咙S色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為
0.4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，然后將利什曼原蟲液體培養(yǎng)基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中密閉保存。利什曼原蟲液體培養(yǎng)基在溫度為_20°C下可保存I. 5年、溫度為4°C下可保存3個月、溫度為25°C下可保存30天。
實施例2 :與實施例I的不同之處實施例2的兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。上述實施例所得利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟進行應用
在以下實際應用中，嚴格按生物安全操作規(guī)定實施。一培養(yǎng)分離利什曼原蟲的設備和材料準備
I.設備和器材生物安全柜，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，毛細玻管，rk39ELISA試劑盒，rk39dipstick，一次性注射器，0. 9%生理鹽水，眼科剪刀，5ml細胞培養(yǎng)瓶。2.利什曼原蟲液體培養(yǎng)基將上述實施例所得利什曼原蟲液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為pH
7.2利什曼原蟲液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)利什曼原蟲前鞭毛體；將上述實施例所得利什曼原蟲液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為PH 6. 4利什曼原蟲液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)利什曼原蟲利杜體。臨用前，將低溫保存的上述調(diào)節(jié)好的利什曼原蟲液體培養(yǎng)基融化并搖勻，無菌操作分裝于5ml細胞培養(yǎng)瓶，每瓶4ml。4°C可保存30天。二培養(yǎng)分離利什曼原蟲標本采集
I.采集疑似黑熱病病人骨髓
采取有疑似黑熱病臨床癥狀的病人血清，按rk39dipstick或rk39ELISA使用說明書檢測血清rk39抗體，黑熱病抗體陽性的患者，在治療用藥前采取骨髓。2.采集動物骨髓、脾臟標本
用rk39dipstick或rk39ELISA檢測動物血清rk39抗體陽性的動物,體型較大的如家犬等，采取骨髓；小型嚙齒類動物，亦可采取股骨骨髓或脾臟標本，取骨髓或脾臟0. Ig,在凹孔載玻片上研碎，加0. 2ml上述實施例所得利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，研磨成混懸液。3.采集白蛉標本
鎢絲燈誘捕白蛉，鑒定分類后，解剖取胃內(nèi)容物，加0. Iml上述實施例所得利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，研磨成混懸液。三培養(yǎng)和觀察方法
將疑似黑熱病病人骨髓、動物脾臟、白蛉胃內(nèi)容物混懸液0. 01ml，分別加到裝有上述調(diào)節(jié)好的pH7. 2利什曼原蟲液體培養(yǎng)基的毛細玻管或培養(yǎng)瓶中，封口后25°C培養(yǎng)。從接種后第2天開始，每天用倒置顯微鏡200倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有鞭毛體游動，便可以確定有前鞭毛體生長；連續(xù)觀察到第15天，仍未觀察到前鞭毛體，按利什曼原蟲培養(yǎng)陰性處理。上述調(diào)節(jié)好的pH6. 4利什曼原蟲液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)利杜體，把有前鞭毛體生長的培養(yǎng)液接種到上述調(diào)節(jié)好的PTO. 4利什曼原蟲液體培養(yǎng)基中，3天后取培養(yǎng)液涂片，瑞氏染色或姬姆薩氏染色，油鏡觀察生長情況。四利什曼原蟲擴大培養(yǎng)和保種
觀測到有前鞭毛體生長的第8天，取部分有前鞭毛體的培養(yǎng)液，用2倍量上述調(diào)節(jié)好的利什曼原蟲液體培養(yǎng)基稀釋，擴大培養(yǎng)。已成功純化培養(yǎng)的利什曼原蟲，用上述調(diào)節(jié)好的利什曼原蟲液體培養(yǎng)基稀釋到每毫升10萬個利什曼原蟲，18°C _22°C試管內(nèi)可以保存40天，上述方法可傳代保存利什曼原蟲。
權(quán)利要求
1.一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，其特征在于該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基含有NaCl8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟得到第一步,依次將上述所需要量的NaCl、KCl、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入上述所需要量的Hepes, RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變?yōu)榱咙S色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，然后將利什曼原蟲液體培養(yǎng)基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，-20°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，其特征在于所述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為-5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。
3.—種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于按下述步驟進行該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養(yǎng)基按下述步驟進行第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變?yōu)榱咙S色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養(yǎng)基，然后將利什曼原蟲液體培養(yǎng)基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，_20°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利什曼原蟲液體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為-5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。
全文摘要
本發(fā)明涉及黑熱病疫情監(jiān)測和黑熱病診斷的液體培養(yǎng)基技術(shù)領域，是一種利什曼原蟲液體培養(yǎng)基及其制備方法;本發(fā)明通過利什曼原蟲液體培養(yǎng)基培養(yǎng)疑似黑熱病病人的骨髓和腫大的動物脾臟，培養(yǎng)并分離利什曼原蟲，與傳統(tǒng)3N培養(yǎng)基比較，培養(yǎng)和分離荒漠型黑熱病利什曼原蟲的分離率，由不到1%提高到10%以上；出結(jié)果快，培養(yǎng)觀察出結(jié)果時間由15天縮短到5天；保存方便，有效期由30天延長到2年。為黑熱病臨床診斷、流行病調(diào)查和利什曼原蟲抗藥性研究提供依據(jù)。
文檔編號C12N1/10GK102746989SQ20121025094
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者廖力夫, 徐兵, 徐藝玫, 燕順生 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心